GNA和α-PAP双抗表达载体的构建及对烟草的遗传转化

将带有启动子GaMV35S、终止子Nos-ter的雪花莲凝集素基因GNA插入到已构建好的植物表达载体pBI121/α-PAP上，构建成双抗表达载体pBI121/GNA α-PAP，并采用农杆菌介导法将其转化进入烟草红花大金元，获得了卡那霉素筛选的抗性植株，通过PCR扩增验证，烟草基因组中含有这两个抗性基因。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

GNA和ACA双价转基因烟草培育及其抗蚜研究

蚜虫是一种常见的农作物害虫,作为多种植物病毒的载体而成为影响农业发展的重要害虫之一,对蚜虫的防治一直是众多科学工作者所面对的难题。构建了雪花莲凝集素(GNA)和苋菜凝集素(ACA)双价植物表达载体pBI121-GA,在农杆菌介导下,叶盘法转化烟草NC89,得到卡那霉素抗性植株65株。通过基因组PCR、ELISA、RT-PCR和Western-blot等分子生物学检测,从中筛选出外源凝集素不同表达水平的转基因烟草5株。对筛选出的5株转基因烟草植株进行初步蚜虫抗性实验,证实转基因烟草对桃蚜表现出一定的抗性,最高抑制率达85.8%,为农作物双价抗蚜基因的应用研究提供一定的理论基础。     

蚯蚓MT基因植物表达载体的构建及烟草转化

为了提高植物对重金属的耐受力和富集能力,从而减少重金属对土壤的污染,本研究将克隆的赤子爱胜蚓(Eiseniafoetia)MT基因,装入植物表达载体pPZP111,构建了植物表达载体pPZP-efMT。然后用三亲法将其导入根瘤农杆菌EHA105中,通过叶盘法转化烟草。经PCR检测,efMT基因已整合到烟草基因组中,为进一步验证转基因烟草的抗重金属能力奠定了基础。     

小菊'类锌指蛋白'基因植物表达载体构建及对烟草的转化

为了建立耐盐碱小菊(Chrysanthemum morifolium)中克隆到的'类锌指蛋白基因'CmSTZF(DQ864730)的烟草遗传转化体系,并研究其抗逆特性。本研究借助Gateway技术构建了小菊'类锌指蛋白'基因CmSTZF的过量表达载体pH7WG2D-CmSTZF,并以烟草NC89(N.plumbaginifolia'NC89')的叶片为试材,通过农杆菌介导的转化,成功地建立了烟草遗传转化体系,经PCR-Southern鉴定获得CmSTZF的转基因烟草株系。     

BcMF3反义基因植物表达载体的构建及其对拟南芥的遗传转化

根据编码白菜(Brassica rapa L. ssp. chinensis,syn B. campestris ssp. chinensis)果胶甲酯酶的BcMF3 基因cDNA 序列内部第1 343～1 797个碱基之间序列设计引物,从白菜花蕾cDNA中PCR扩增出455 bp的片段,把该片段作为反义基因连接至双元载体pBI12l上,得到了植物表达栽体pBI-B3,并用"三亲杂交"法导入农杆菌LBA4404菌株中,PCR扩增和酶切结果表明所构建的植物表达载体pBI-B3含有BcMF3 反义基因片断,并已导入了根癌农杆菌(Agrobacterinm tumefuciens)中;采用花序浸润法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)后,播种筛选浸润植株的种子获得了5 株卡那霉素抗性植株,PCR 扩增证明BcMF3反义片段成功整合到拟南芥基因组中;转基因拟南芥子代(T2)的抗性分离符合孟德尔分离比例,表明外源基因是单一位点插入.     

玉米ZmbZIP基因植物表达载体的构建

根据玉米(Zea mays)Zmb ZIP的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pGM-T-ZmbZIP为模板PCR扩增ZmbZIP基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建该基因的植物表达载体.结果表明,扩增出的ZmbZIP基因片段长度为894 bp.经PCR检测及测序鉴定,表明植物表达载体构建成功,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

GUS基因分泌型植物表达载体的构建及对烟草的转化

为了验证PR1B分泌肽对谜底蛋白的分泌和增强功能,以GUS基因为靶基因,成功构建了PR1B 和GUS融合基因的植物表达载体,通过三亲融合法转入LBA4404农杆菌,并对烟草进行了转化,在216株卡那抗 性植株中共获得2株GUS染色阳性植株。     

巴西橡胶树HbMT2植物表达载体的构建及遗传转化烟草

将巴西橡胶树金属硫蛋白基因HbMT2插入到植物表达载体pCAMBIA 1304,得到HbMT2基因的植物表达载体pCAMBIA1304-HbMT2.通过电击法将该载体导入根癌农杆菌菌株中并转化烟草.将获得的具有潮霉素(Hyg)抗性的再生植株进行PCR鉴定.结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中.抗逆性分析试验显示,转基因烟草对H202处理和紫外线照射耐受性显著提高;重金属离子胁迫下,转基因烟草叶绿素含量、过氧化物酶和过氧化氢酶活性明显高于对照.     

Chi和Bar基因双价植物表达载体的构建及转基因烟草的初步检测

构建了单子叶植物双价表达载体pBI121-Ubi-Bar/Chi,其中含有木霉几丁质酶基因Chi和抗除草剂Bar基因,均由玉米Ubi启动子驱动.以烟草无菌苗叶片为受体,用农杆菌介导法将目的基因转入烟草中;以Bar基因作为选择标记,PPT为选择剂进行筛选,获得了一定数量的转基因植株.结果表明:经PCR分析,初步确定目的基因已经整合到烟草基因组中.     

猪肝脏BHMT基因植物表达载体构建及玉米遗传转化

甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)是一种甲基代谢酶,在动物和微生物体内存在,能催化甜菜碱向高半胱氨酸转移甲基,促进甲硫氨酸形成。本试验通过RT-PCR扩增猪肝脏BHMT基因ORF的cDNA序列,成功构建了p3301-BHMT植物表达载体,并利用农杆菌介导法转化玉米萌动胚,经PPT筛选和PCR检测,初步确定获得4株抗性植株。试验结果将为研究BHMT基因在植物中的作用,提高玉米甲硫氨酸含量和抗逆性提供试验材料。     

植物afp表达载体的构建及其对农杆菌的直接转化

详细报道了胡萝卜抗冻蛋白基因 (afp)植物表达载体的构建过程及其直接法转化农杆菌的方法。以限制性内切酶从克隆载体上切取 afp基因 ,将其连接在相应酶切的 p BI12 1工程质粒上 ,构建成 afp植物表达载体。采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌 ,并用 PCR方法进行了鉴定     

烟草Bex inhibitor-1基因植物沉默表达载体的构建及对农杆菌的转化

试验首先对质粒pGSA1285进行改造,将pFGC5941质粒的查尔酮合酶的Intron片段取代pGSA1285的GUS片段,构建含有内含子并具有卡那抗性的pGSA2285植物沉默表达载体。同时设计引物、PCR扩增、在BI-1基因两端各加上两个酶切位点,将BI-1基因分别反向、正向插入改造后的质粒pGSA2285Intron片段两端的多克隆位点中,构建得到烟草BI-1基因沉默载体pGSA4285。此沉默质粒经PCR鉴定、限制性酶切分析以及回复动员试验证明已正确构建并成功转入农杆菌,为获得含有BI-1基因沉默烟草植株及其在植物程序性死亡中调控作用的研究奠定试验基础。     

苎麻CCoAOMT基因干扰表达载体构建及对烟草的转化

根据已克隆的苎麻CCoAOMT(咖啡酰辅酶-A-氧甲基转移酶)基因cDNA序列,以其编码纤维素合成酶底物结合和催化合成结构域的 cDNA 序列为目标,采用PCR扩增方法引入克隆的酶切位点,分别将其正、反方向克隆到植物RNA干扰表达质粒PFGC5941 T-DNA上CHSA内含子两侧,构建了植物表达苎麻CCoAOMT基因的干扰重组Ti载体.将该载体转入根癌农杆菌LBA4404后,采用农杆菌介导法对木质素研究的模式烟草WS38进行了遗传转化,抗性筛选和分子检测表明,成功获得了转基因植株.转基因植株生长延缓,表明可能存在基因表达干扰现象.     

杀虫基因高效植物表达载体的构建

以质粒pCAMBIA1200、pBI121、pMMAR和pC1300MAR为基础,通过酶切连接,构建植物中间载体pC2MARHyg;再利用pAVAc质粒、载体pGA1611和中间载体pC2MARHyg,构建含有Ubi-1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR-AVAc,然后转化农杆菌EHA105,经筛选鉴定获得阳性克隆,为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。     

烟草4CL与虎杖STS融合基因原核表达载体的构建

植物次生代谢产物白藜芦醇具有抗肿瘤、保护心血管、抗氧化的药理作用。通过分子生物学技术利用带有13个氨基酸的链接序列(linker)将来自烟草的4-香豆酰辅酶A连接酶(4-Coumarate-CoA ligase,4CL)和虎杖的白藜芦醇合酶(Stilbene synthase,STS)的基因连接,构建成融合基因,并转入原核表达载体。为后续的白藜芦醇的代谢工程奠定了基础。但该研究中所构建的融合基因与原基因相比有7个碱基突变,导致4个氨基酸的改变。这些突变是否会影响到融合酶的活性,试验所引入的13个氨基酸的linker对于融合蛋白活性的影响等都还待后续进一步研究。