小麦胚乳贮藏蛋白高分子量谷蛋白亚基1Dy10单克隆抗体在品质育种中的应用——Ⅰ.间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)的建立

本文研究利用高分子量谷蛋白亚基1Dy10特异性单克隆抗体测定小麦胚乳贮藏蛋白中是否含有优质亚基1Dx5 1Dy10的免疫化学测定条件,建立适宜的间接ELISA测定法。结果表明:蛋白质提取剂种类对籽粒贮藏蛋白提取效率及1Dx5 1Dy10与1Dx2 1Dy12亚基的识别起决定作用。其中以10mMHCl较理想,还原剂DTT能提高1Dx5 1Dy10与1Dx2 1Dy12亚基的识别能力,蛋白提取时间、醇溶蛋白含量以及封闭液的种类都对实验结果具有重要影响。     

小麦胚乳贮藏蛋白高分子量谷蛋白亚基1Dy10单克隆抗体在品质育种…

本文研究利用高分子量谷蛋白亚基１Ｄｙ１０特异性单克隆抗体测定小麦胚乳贮藏蛋白中是否含有优质亚基１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０的免疫化学测定条件，建立适宜的间接ＥＬＩＳＡ测定法。结果表明：蛋白质提取剂种类对籽粒贮藏蛋白提取效率及１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０与１Ｄｘ２＋１Ｄｙ１２亚基的识别起决定作用。其中以１０ｍＭ ＨＣｌ较理想，还原剂ＤＴＴ能提高１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０与１Ｄｘ２＋１Ｄｙ１２亚基的识别能力，蛋白提取时间、     

小麦回交后代中1 Dx 5+1 Dy 10优质亚基的分子检测

利用高分子量麦谷蛋白亚基1 Dx5、1 Dy 10的PCR分子标记,对贵农21与加拿大小麦Neepawa的BC1F2 100个单株进行了分子标记辅助选择.结果表明,具有1 Dx5和1 Dy 10亚基的亲本Neepawa和BC1F2代单株中可扩增出1 Dx5(450 bp)和1 Dy 10(576 bp)特异带,具有12亚基的单株扩增出612 bp特异带;在100个单株个体中,共检测到具有5+10优质亚基的5株,占5%;有2+12亚基的34株,占34%;同时具有5+10和2+12亚基的4株,占4%;并发现了新的组合类型5+12亚基,占57%.利用分子标记辅助选择技术,结合回交选育,可以在较早世代鉴定小麦优质亚基组合,选育出具有亚基组合新类型的小麦优质品系,为小麦的优质育种快速提供选育材料,从而提高选择效率,加快育种进程.     

黄淮麦区部分小麦品种（系）1Dx5+1Dy10的分子检测与分析

目前在已报道的检测高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5的PCR分子标记中,由引物Dx-F,Dx5-F和Dx-R组成的共显性标记,能稳定地扩增出5亚基和非5亚基的特异序列,并且无非特异PCR产物,是用于高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5分子检测的最理想标记。本次实验利用此对引物, 通过PCR技术对221份小麦亲本进行了1Dx5亚基检测。结果表明,在所检测的材料中有35份材料携带1Dx5亚基,占所测材料总数的16.3%,远低于国外的基因频率（约85%）。     

小麦胚乳贮藏蛋白亚基变异的研究进展

综述了组织培养、化学试剂处理、辐射、外源DNA导入以及转入目的基因等的情况下导致的小麦胚乳贮藏蛋白的各种变异,讨论了可能的变异机理,并对胚乳贮藏蛋白的变异在科学研究和育种上的应用作了展望。     

水稻胚乳贮藏蛋白研究及其多态性测定

采用玉米胚乳贮藏蛋白的多态性 ,进行杂交玉米种子真实性和纯度的检测 ,已在我国取得相当的成功。于是 ,对水稻胚乳贮藏蛋白的研究 ,也引起不少种子工作者的注意。本文综述了多年来这方面的研究成果 ,并简要介绍我们在水稻胚乳贮藏蛋白多态性测定方面取得的初步结果。1　水稻胚乳贮藏蛋白的组成及其分布1.1　水稻胚乳贮藏蛋白的组成水稻胚乳贮藏蛋白组成的划分主要有以下两种分类方式 :1.1.1　依据溶解性差异的划分方式1970年 Osbom在《科学》杂志上将禾谷类种子蛋白依据溶解性差异分为四类 :1能溶于水、稀酸溶液的水溶性蛋白 ,称为清蛋白 …     

小麦高分子量谷蛋白亚基功能的体外鉴定

通过SDS-PAGE方法回收纯化小麦高分子量谷蛋白亚基1Ax1、1Dx5、1Dy10、1Bx7、1By8和1By9,然后利用微量配粉方法将单个亚基分别添加到对照“京411”面粉中,经过揉混仪分析单个亚基对揉面特性的影响,进而确定各个亚基的功能特性。根据揉面时间、稳定时间等参数的变化,6个小麦高分子量谷蛋白亚基对面粉品质的影响表现为1Dy10 > 1Ax1 > 1Dx5 > 1By8 > 1Bx7 > 1By9。研究结果表明,通过揉混仪进行体外配粉检测是快速鉴定高分子量谷蛋白亚基功能的一种有效方法。     

普通小麦HMW-GS Dx5与Dx2亚基共显性标记

高分子量麦谷蛋白是决定小麦烘烤品质的重要蛋白组分,其中Glu-D1基因座(Locus)与小麦的烘烤品质关系最为密切,该座位的亚基类型中,Dx5亚基的面团弹性要大于Dx2亚基。本研究根据Dx5亚基和Dx2亚基DNA序列的中间重复区重复单元数目的不同,开发出用于鉴别两种不同亚基类型的共显性标记,并利用该标记对含有Dx2亚基的川麦38与具有Dx5亚基的川麦42杂交F1植株、F2群体进行PCR分析。研究结果显示电泳条带清晰,片段大小符合期望值,F2群体检测统计结果符合孟德尔定律。研究结果表明该共显性标记能够用于早期分子辅助选择育种。     

小麦编码高分子量谷蛋白亚基基因的转化

以小麦的幼穗和幼胚作为转化受体,首次用抗除草剂草甘麟的EPSPs基因作为选择标记,通过基因枪法共转化,将小麦编码高分子量谷蛋白亚基的基因1Dx5和1Dy10转移到普通小麦京花1号中,获得33株再生植株,经PCR初步检测有12株同时扩增到了3个处在不同质粒上的外源基因EPSPs, 1Dx5和1Dy10的目标片段。将部分PCR检测为阳性的转化体     

大麦胚乳发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成

利用光学显微镜和电子显微镜技术观察了大麦胚乳发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成。抽穗后8 d的胚乳细胞,富含内质网和蛋白贮藏液泡(PSV),少量淀粉粒沿细胞核或细胞膜分布。贮藏蛋白颗粒在抽穗后10 d的胚乳细胞中开始出现,内质网的腔膨大,积累贮藏蛋白,后脱离内质网形成蛋白体。在胚乳细胞生长分化早期,蛋白体呈球状进入PSV;随着胚乳发育,贮藏蛋白体急剧增多,以亚糊粉层细胞为主。在胚乳细胞生长分化中期,PSV充满蛋白体,其周围有电子致密物质;新产生的蛋白体在细胞质基质中呈球状聚集在一起。在胚乳细胞生长分化后期,PSV中的部分蛋白体或者细胞质基质中的部分蛋白体开始相互融合,同时内质网衍生出许多小蛋白体分散在淀粉粒之间。在胚乳发育成熟期,蛋白体相互融合形成无定形的蛋白质基质分布在淀粉粒间的间隙中。结果表明,大麦胚乳发育过程中,内质网衍生出蛋白体,聚集于PSV或细胞质基质中,然后相互融合形成成熟籽粒的蛋白质基质。     

分子标记辅助选育小麦抗白粉病、优质高分子量麦谷蛋白亚基聚合体

现代小麦育种的目标是选育丰产、综合抗逆性好的优质小麦新品种,将分子标记技术与传统育种方法相结合可以大大提高育种效率.本研究利用与小麦抗白粉病基因Pm21紧密连锁的共显性PCR标记、以及优质高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5 1Dy10特异的PCR标记对以小麦品种安农94212、安农92484为优质亲本和以抗白粉病小麦簇毛麦易位系为抗病亲本的杂交高代材料进行标记位点的检测,结合田间抗病性鉴定结果,筛选、培育出聚合有Pm21和1Dx5 1Dy10的抗白粉病小麦聚合体,为小麦抗病、优质育种提供了具有重要利用价值的中间材料.     

1Dx5亚基特异PCR标记在小麦品质性状群体改良中的应用

利用1Dx5亚基特异PCR标记对改良品质性状的Ta1小麦轮回选择群体C₄进行了分子检测，并通过SDS-PAGE电泳对其结果的验证，以探讨群体5亚基基因型的组成及其特异PCR标记用于轮回选择的可行性。结果表明：（1）1Dx5亚基特异PCR标记在具有1Dx5亚基的单株中均扩增出450 bp的基因片段，生化标记检测也证明所有能扩增出450 bp片段的单株均含有5亚基的条带，分子标记与生化标记结果一致，而且PCR扩增结果的重复性好。说明1Dx5亚基特异PCR标记的选择准确率高，完全可用于Ta1小麦群体改良中1Dx5亚基基因型的检测；（2）构建的轮回选择群体C₄中携带1Dx5亚基的优质基因型比例高，达56.81％，且大都伴随与之连锁的10亚基出现。生化检测表明群体中同时产生5＋12稀有亚基和14＋15与5＋10的聚合体。     

小麦育种亲本材料Dx5、Bx14亚基及1BL/1RS易位的分子检测

为给小麦优质育种的亲本选配等研究提供参考,利用优质谷蛋白Dx5、Bx14亚基及1BL/1RS易位的特异性分子标记,对本课题组近年常用的38份杂交亲本材料进行了分子检测.结果表明,在引进品种和自育品种(系)中,含Dx5亚基的材料分别占16.0％和7.7％,含Bx14亚基的材料分别占16.0％和23.1％,1BL/1RS易位材料分别占24.0％和38.5％.与引进品种相比,自育品种(系)含Dx5亚基的材料很少,而含Bx14亚基和1BL/1RS易位的材料较多.总体来看,育种亲本含Dx5、Bx14亚基的材料较少,而含1BL/1RS易位的材料相对较多.因此,今后小麦优质育种中应重视含Dx5、Bx14亚基材料的引进和利用,合理使用1BL/1RS易位材料,并加强杂种后代的分子鉴定与选择.     

新疆小麦品种高分子量谷蛋白亚基及相关品质基因的分子标记检测

高分子量麦谷蛋白亚基、1B·1R易位系、多酚氧化酶(PPO)活性及黄色素含量等基因对小麦加工品质有重要影响,准确、快速鉴定这些基因对品质改良有重要意义.本研究对新疆当地及国内外引进的321份小麦品种进行SDS-PAGE分析,利用特异性分子标记对高分子量谷蛋白亚基中的Dx5、Bx7、By8、By9亚基、1B·1R易位系、PPO和黄色素含量基因进行鉴定.进一步验证分子标记检测的可靠性和准确性,为优质小麦分子标记辅助育种提供材料和方法.SDS-PAGE分析表明,供试材料有21种亚基类型,其中Glu-A1位点有3种类型,以null为主;Glu-B1位点有10种类型,Bx7+By8和Bx7+By9亚基占主导地位;Glu-DJ位点有8种类型,Dx2+Dy12和Dx5+Dy10占主导地位.分子标记检测表明,Dx5亚基的频率为38.3%,Bx7亚基的频率为85.7%,By8亚基的频率为38.9%,Bx9亚基的频率为42.7%;特异性PCR标记扩增与SDS-PAGE鉴定结果的吻合率分别为97.2%、98.4%、93.4%和97.2%.在新疆当地品种、其他国内品种和国外品种中,1B·1R易位系材料的频率分别为22.0%、31.5%和25.0%,Psy-A1b的频率分别为9.0%、10.8%和5.4%,Ppo-A1b的频率分别为38.0%、43.8%和45.7%,Ppo-Dla的频率分别为48.0%、66.9%和40.2%.同时含Ppo-A1b和Ppo-D1a的材料有74份,占23.0%.本试验中采用的基因特异性标记重复性好、准确率高,可有效用于小麦品质分子标记辅助选择.     

不同SDS-PAGE分离胶浓度下椰子贮藏 蛋白亚基的分离效果

采用SDS-PAGE浓缩胶浓度为7.5%,分离胶浓度分别为9%、10%、11%、11.5%、12%、13%、14%、15%、16%的凝胶系统,探讨不同分离胶浓度条件下椰子贮藏蛋白亚基的分离效果。结果表明,分离胶浓度对亚基电泳分辨率的影响非常明显。分离胶浓度为11%~12%时,蛋白质亚基的分辨效果很好;当分离胶浓度为11.5%时,椰子贮藏蛋白亚基的分离效果最好,可以得到9条清晰的亚基条带。     

节节麦HWM-GS D~tx5与普通小麦HWM-GS Dx5亚基的AS-PCR鉴别

高分子量谷蛋白(HMW-GS)是小麦的重要储藏蛋白之一,决定小麦烘烤品质,其中HMW-GS Glu-D1位点与面包烘烤品质的关系最为密切。人工合成小麦(synthetic hexaploid wheat,SHW)继承了节节麦D基因组丰富的遗传变异,是高效利用野生祖先种优良基因的重要桥梁资源;近年来随着人工合成小麦在小麦遗传育种中的不断应用,来自节节麦类群的大量高分子量谷蛋白亚基类型越来越多的涌向普通小麦。而传统SDS-PAGE无法区分节节麦HMW-GS Dtx5和普通小麦Dx5亚基,鉴于此本研究利用节节麦HMW-GS Dtx5亚基和普通小麦HMW-GS Dx5亚基DNA序列之间存在的几个SNPs差异开发出等位特异PCR(allele specific polymerase chain reaction,AS-PCR)引物,通过PCR方法来区分两种不同来源的5亚基。结果显示,所设计出的两对引物都能够扩增出清晰稳定的目标条带,并且两对引物的扩增结果一致,含HMW-GS Dx5亚基的表现为阳性带,含节节麦来源的Dtx5亚基表现为阴性;同源性分析表明Dtx5亚基与Dx2亚基氨基酸序列的同源性要高于Dtx5与Dx5之间的同源性。     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基多重PCR扩增体系的建立

小麦的加工品质与小麦高低分子量麦谷蛋白的组成和含量密切相关,特别是Glu-1位点编码的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的组成和含量.其中与好的加工品质相关的优质亚基如1Dx5、1Ax2*和1Bx7OB(over-expression)特异的分子标记已经被建立并应用于品质改良的分子育种.本研究的目的在于通过摸索PCR反应组分和循环参数对多重PCR反应结果的影响,建立一次反应能够同时鉴定1Ax2*、1Bx7OE和1Dx5亚基的多重PCR反应体系.结果表明:反应体系中的三种亚基的引物浓度比例和反应的Tm值是多重PCR成败的关键因素,当引物浓度比例为1Dx5:1Bx7CEL:1Ax2*=0.1:0.2:0.3或1Dx5:1Bx7OE:1Ax2*=0.1:0.2:0.4,Tm=60℃时1Ax2*、1Bx7OE和1Dx5亚基的多重PCR结果最好.利用HMW-GS的多重PCR的方法可以快速高效的鉴定多个亚基,可以进行小麦品质育种的复合分子标记辅助选择.     

北部旱地冬麦区部分冬小麦胚乳贮藏蛋白HMW-GS的遗传变异分析

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)生化标记,对北部旱地冬麦区的74份普通小麦品种(系)进行高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)组成进行了分析,并按照Payne等的评分方法计算其Glu-1位点的品质得分.结果表明:74个品种(系)中存在7种亚基变异类型和9种亚基组合类型.在7种亚基中,Glu-A 1位上null的出现频率最高(87.84％);Gly-B1位上主要为7+8亚基(70.27％);Glu-D1位染色体上主要以2+12亚基存在(82.43％).在9种亚基组合类型中以null、7+8、2+12出现频率最高,占供试材料的55.41％;其次为null、7+9、2+12的亚基组合,5+10亚基则多出现在上世纪70～80年的一些育成品种中.以外,陇东地区冬小麦品种(系)的品质评分为4～10分,平均得分较低,为6.16分.     

小麦资源胚乳蛋白Glu-1、Glu-3、Gli-1基因位点变异特点

141个普通小麦品种及农家种中，由Glu-1位点控制的高分子量谷蛋白亚基共27种图谱，最常见的图谱是（N，7+8，2+12）占22%和（N，7+9，2+12）占19.9%，Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点控制的均为正效应亚基，其图谱（1，7+8，5+10），（1，14+15，5+10），（1，13+16，5+10），（1，17+18，5+10），（2*，7+8，5+10），（2*，13+16，5+10）占13.4%; 由Glu-3位点控制的低分子量谷蛋白亚基共48种以上的图谱，最常见的图谱是（a, j, c）, Glu-A3位点存在6个以上等位基因，新发现的占5.7%, Glu-B3位点存在10个以上等位基因，新发现的占2.8%, Glu-D3位点存在3个等位基因；由Gli-1位点控制的醇溶蛋白共81种以上图谱，Gli-1A1位点存在7个以上等位基因，新发现的占7.1%, Gli-B1位点存在12个以上等位基因，新发现的等位基因占3.5%, Gli-D1位点存在10个等位基因，Gli-B1位点的l为1B/1R易位系，占总数的33.6%; 由Gli-1位点控制的醇溶蛋白和由Glu-3位点控制的低分子量谷蛋白亚基基因变异远比由G1u-1位点控制的高分子量谷蛋白亚基复杂和丰富。     

1Dx5在新冬26小麦中的遗传转化及分析

为了对转1Dx5基因小麦的T1进行遗传分析,将优质高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因1Dx5转入新疆耐盐小麦品种新冬26,在蛋白质水平上经SDS-PAGE检测,有37粒小麦种子1Dx5基因表达。经过继代培育,得到37个T1转基因株系,SDS-PAGE分析T1转基因小麦籽粒的HMW-GS组成,结果表明:在蛋白质水平,HMW-GS的组成在T1小麦种子中有3种表型:表型Ⅰ,外源1Dx5基因没有表达;表型Ⅱ,外源1Dx5基因表达;表型Ⅲ,内源1Dx2基因没有表达。这3种表型出现的概率分别约为34.3%,45.9%和19.8%。该研究成功获得了新的HMW-GS组成的小麦,为选育优质小麦提供分子依据。