大豆花叶病毒间接ELISA检测方法的建立及应用

为快速有效地检测大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV),本研究利用已制备的大豆花叶病毒衣壳蛋白(Coat Protein,CP)及其单克隆抗体,通过优化ELISA条件为:检测材料抗原包被酶标板37℃1 h,检测抗体工作浓度125 ng/mL,孵育60 min,酶标抗体工作浓度100 ng/mL,孵育30 min;SMV CP蛋白最低检测限为3.23 ng/mL;该方法重复性变异系数小于3%,重复性良好;运用上述检测条件与RTPCR检测方法对田间样品进行随机检测,结果显示一致率高达94%。SMV间接ELISA检测方法的成功建立,为SMV快速检测试剂盒及试纸条的研发奠定了基础。     

单克隆抗体检测水稻白叶枯病菌的研究

用ELISA双夹心法,以单克隆抗体为第二抗体,对60份水稻白叶枯病的病种和病叶进行检测,2张病叶在7ml0.01molPBS(pH7.2)中的浸出液稀释至32倍表现明显阳性;病种稻壳与PBS的比例(W/V)>1:3时效果明显。被测的病种稻壳浸出液的光密度值大于健种稻壳浸出液光密度值1.2倍可定为阳性。该法灵敏度为1.9μg/50μl。     

免疫斑点法和免疫捕获RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科作物上重要的病毒之一.用提纯的黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫新西兰大白兔制备CGMMV的多克隆抗体.该多克隆抗体的间接ELISA效价达1∶512 000,与CGMMV17.5 ku外壳蛋白有特异性反应,而与烟草花叶病毒、齿兰环斑病毒和健康植物没有任何反应.用ACP-ELISA分析多抗灵敏度表明多抗检测1∶40 960倍稀释的CGMMV病叶时仍呈阳性反应.用该多抗建立了检测CGMMV的免疫斑点法(dot-ELISA)和免疫捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR).病叶汁液可被dot-ELISA检出的最大稀释度为1∶10 240.IC-RT-PCR从感染CGMMV的病叶组织中扩增到与预期大小相同的480 bp DNA条带,且当CGMMV病叶稀释1∶163 840倍时检测仍呈阳性.检测CGMMV的dot-ELISA和IC-RT-PCR方法的建立为该病毒病的诊断和控制提供了技术支撑.     

褐飞虱抗原检测最佳ELISA条件的建立

应用褐飞虱单克隆抗体3B2和4B8比较了直接、间接和多种抗体夹心ELISA方法.结果表明:当拟环纹豹蛛稀释512倍(含拟环纹豹蛛0.04 mg/mL)时,直接和间接ELISA的OD值比阳性对照仍降低5%以上.而当捕食者稀释100倍时,对同种单抗、异种单抗和两种单抗混合夹心ELISA检测OD值的影响均小于5%.在加入100倍豹蛛稀释液时,3种抗体夹心ELISA检测灵敏度均为16.90 ng/mL(1/17509头褐飞虱雌成虫),直接和间接ELISA分别为:67.59 ng/mL (1/4378头)和135.18 ng/mL (1/2189头).建立了4B8稀释1000倍(28.13 μg/mL),捕食者匀浆液定容至1 mL/头后再稀释100倍,HRP-4B8稀释4000倍(1.04 μg/mL)的夹心ELISA用于检测捕食者肠道中的褐飞虱抗原.在此系统下,检测灵敏度为每头拟环纹豹蛛含1.69 μg猎物蛋白(1/175头褐飞虱雌成虫),非目标抗原的影响小于5%.     

用酶联免疫吸附试验检测马铃薯卷叶病毒

本文介绍用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法快速检测马铃薯叶片及块茎内的马铃薯卷叶病毒(PLRV),检测叶片的最高稀释倍数为1/128,检测块茎的最高稀释倍数为1/64。马铃薯病株的顶部叶片和底部叶片的病毒含量不同,而又没有一定的规律性。马铃薯感染PLRV后可表现为底叶卷叶、部分全株卷叶或顶叶卷叶,有的品种无症;还有一部分植株虽然表现出各种卷叶症状,但并不是由PLRV所致。我院马铃薯育种圃内常用的杂交亲本的带毒率为31.21％;在黑龙江省的几个主栽品种上均可检测到PLRV。     

大豆(阿同纳、Glycine max L Merr“Altona”)胚轴内大豆花叶病毒(SMV)分布的ELISA研究

这一试验是参加慕赫等在凡尔赛植病所主持大豆种子ELISA检定研究中的一小部份。应用酶联免疫吸附测定法(RLISA),以聚苯乙烯微皿板(96孔)、SMV抗血清和酶标抗SMV—IgG,测定接种SMV后的大豆种皮颜色黑、白和携带病毒的关系;以及胚轴带病毒的分布和机率。得知种子颜色和带毒无相关性.在微皿板中,鉴定胚轴带病毒,根据光密度值(O.D.值)的反应,健种胚轴测定限度,其O.D值至0.250为止,病种胚轴O.D值至1.150。反应是较清楚的,ELISA法是灵敏的。     

马铃薯X病毒云南分离物单克隆抗体的制备及其检测应用

用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗PVX单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞2B12和4E7,并分别制备它们的单抗腹水.2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10-6以上,2B12和4E7的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链.利用这些单克隆抗体建立了抗原包被的间接ELISA(ACP-ELISA)检测PVX的方法.病叶经1:600倍稀释、提纯PVX病毒浓度为2 ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.2 ng)时,该方法仍能检测到病毒.利用ACP-ELISA方法测定了田间样品,发现PVX在马铃薯上发病很普遍.     

葡萄斑点病毒检测技术研究

分别采用PAS—ELISA和免疫组织印迹法对湖北省农业科学院果茶研究所葡萄园内5个主栽品种的葡萄斑点病毒(GFkV)的带毒情况进行检测，结果表明，在检测的5个品种中，仅胜宝遭受GFkV侵染，而且两种方法检测的结果高度一致。当选用枝条作为PAS—ELISA检测材料时，在GFkV抗体的最适工作浓度(1:1000)下，其病毒粗提物稀释1000倍后，仍能得到准确可靠的阳性结果，其灵敏度较高；当分别选取经PAS—ELISA检测呈阳性结果的叶柄和叶片作为免疫组织印迹检测的材料时，并采用两种工作浓度(1：7000和1：14000)的碱性磷酸酯酶标记的羊抗免IgG进行检测，均得到准确、可靠、灵敏、直观的阳性结果。     

辣椒轻斑驳病毒的分子杂交检测

为探索辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMo V)的分子杂交技术检测方法,以感病辣椒叶片为试材,用改良CTAB法从辣椒叶片中提取总核酸,运用RT–PCR技术扩增出PMMo V特异片段。以带有PMMo V特异片段的质粒DNA为模板,以用PCR技术制备的地高辛标记PMMo V c DNA探针检测PMMo V。结果表明:1)干燥叶片、新鲜叶片中提取的总核酸稀释80、640倍(相当于12.5、1.60μg叶片)后仍可检测到其中的PMMo V;干燥叶片利于保存及长距离转运,利于对大批量样品进行集中检测;2)采用快速提取法提取叶片总核酸,可从稀释80倍(约12.5μg叶片)的总核酸样品中检测到PMMo V。该技术体系可基本满足常规检测试验的需要。     

进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测

【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus,BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）,建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设计2对特异性引物,以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料,提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测,测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA,将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释,依次稀释为原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍作为模板,分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增,测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后,连接于pMD18-T载体,进行克隆测序和序列比对,进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测,同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管,将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合,建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示,最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L^-1、SMV 0.4 μmol·L^-1,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为35。特异性测定结果表明,多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 bp特异性目的条带,从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 bp特异性目的条带,从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 bp特异性目的条带,而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果表明,当dsRNA原液稀释至10^-3倍时,无论是多重RT-PCR,还是单一RT-PCR均未扩增出特异性目的条带,多重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏度相当,为10^-2倍dsRNA原液。多重RT-PCR扩增产物克隆测序和序列比对结果显示,BPMV、SMV所测的序列全长分别为542和221 bp,与预期大小完全相符,且与已报道的各病毒基因序列高度同源,证实了多重RT-PCR结果的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法分别对来自于4个国家的大豆种子样品进行检测,结果从3份美国大豆种子样品检出BPMV,1份美国大豆种子检出SMV,1份阿根廷大豆种子检出SMV,2份中国大豆种子检出SMV,该结果与单一RT-PCR验证结果一致,阳性符合率达100% 。建立的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子中成功扩增出2条特异性目的条带,而从健康大豆种子中未扩增出特异性目的条带。【结论】建立的多重RT-PCR检测方法为进境大豆种子上BPMV、SMV的快速检测提供了参考。     

大豆种子浸提液对大豆花叶病毒侵染力的抑制效应

本文介绍了用枯斑反应法研究大豆种子的磷酸缓冲液提取物对大豆花叶病毒(SMV)侵染力的影响。试验结果表明:1.成熟大豆种子内含有抑制 SMV 侵染的物质。成熟种子的浸提液对 SMV 侵染抑制率为50%左右;2.大豆不同品种的成熟种子浸提液对 SMV 侵染的抑制作用无差异;3.成熟大豆种子的浸提液对SMV 的不同株系的抑制作用无差异;4.成熟大豆种子浸提液在100℃下加热10分钟后,其抑制效力不变;5.大豆未成熟种子浸提液对 SMV 的侵染力无抑制作用;6.菜豆和眉豆成熟种子浸提液对 SMV 的侵染力具有与大豆成熟种子浸提液相似的抑制效应。     

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。     

大豆花叶病毒对产量及产量性状的影响

采用相关分析的方法，研究ＳＭＶ不同株系对大豆植株产量及产量性状的影响。结果表明，感病植株株高、株英数、株粒数、株粒重、百粒重等性状均变劣，产量降低。ＳＭＶ不同株系间以及不同抗性品种间，单株产量及产量性状的变化存在明显的差异。     

大豆花叶病毒抗血清制备和应用方法研究

用差速离心法提纯6个大豆花叶病毒株,提纯液用紫外分光光度计扫描,以260mm的OD值计算病毒汁液浓度.影响提纯病毒浓度的因素有:(1)不同毒株同一提纯方法得率差异很大;(2)采病叶的时间:症状最明显时采叶提纯得率最高;(3)PEG处理时间以3.5小时较好. 将提纯病毒免疫兔子(以6号兔为例),共注射8.34mg,心脏采血,取得抗血清,通过微量凝聚、微量沉淀反应及琼脂扩散试验,在方法上进行了研究.     

大豆花叶病毒(SMV)一强株系的若干特性

将从大豆黑农16号分离的毒株SMV-H-16与美国阿肯色州分离的两个毒株SMV-S-6及S-7比较,三毒株的寄主范围基本相同,只系统侵染大豆,在几个菜豆品种上形成局部斑.H-16局部侵染昆诺藜,而S-6、S-7则不能.按Cho与Goodmon系统,H-16属G 5株系,S-6及S-7属于G 1株系.H-16及S-6提纯,在蔗糖梯度柱上只形成一条病毒区带.H-16电泳分析RNA及外壳蛋白质均只形成一条带,其分子量分别为2.9×10~6-3.2×10~6及26,000-26,500.分析超速离心只出现一个峰.沉降系数为135-138S.三株系与已知SMV抗血清作用生成沉淀线,彼此间不形成刺状物而完全融合.与WMV-2及WMV-E的抗血清呈阳性反应,而与TRSV、BPMV及WMV-1的抗血清呈阴性反应.粒体线状,长740mm左右.病叶组织中易见风轮状筒形内含物,并可见到病毒粒体.     

40年来大豆遗传育种科学的进展及东北农学院的大豆遗传育种研究工作

本文通过40年来世界大豆生产形势的变化,主要论述了40年来大豆遗传育种科学的进展及东北农学院大豆遗传育种研究工作情况。     

不同抗性大豆品种感染SMV1后若干生化变化

以对 SMV1 抗性不同的 4个大豆品种为试材 ,分析了感染 SMV1 后叶片中总酚含量、类黄酮含量及多酚氧化酶 (PPO)活性的变化。结果表明 ,接种 SMV1 后 ,在发病早期抗病品种总酚含量增加而感病品种降低 ,而在发病后期抗、感品种均降低 ;抗病品种类黄酮含量在早期和后期均增加 ,感病品种在两个时期均降低 ,在发病早期抗病品种接种株类黄酮含量明显高于感病品种 ;抗病品种接种株 PPO活性在两个时期均明显高于感病品种     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。     

大豆花叶病毒的侵染对大豆碳氨化合物代谢的影响

感染大豆花叶病毒（ＳＭＶ）的大豆在发病初期其叶片除还原糖以外，其它各类碳水化合物含量均下降，包括总糖，总可溶性糖、不溶性糖、非还原性糖、但总可溶性蛋白、总游离氨基酸均明显增加．这说明ＳＭＶ侵染明显地抑制了寄主碳水化合物代谢，但促进了寄主氮化合物代谢．因此ＳＭＶ侵染大豆后，在消耗碳水化合物的基础上，优先合成各类蛋白质、这有利于ＳＭＶ的复制．另外在感染ＳＭＶ的大豆中，还发现总氮量增加，这说明ＳＭＶ浸染刺激了寄主对氮的吸收并直接合成各种氨基酸，而有利于病毒的增殖．另一方面由于病毒的增殖不破坏寄主本身的蛋白质，所以氮吸收的增加对寄主起到一种保护作用。