广西地方禽类品种ALV和REV感染情况的调查及ALV分离株gp85基因序列分析

为了解广西钦州地区主要地方品种商品禽类中禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)的感染情况,本试验随机采集了广西钦州地区代表饲养场的麻鸭、狮头鹅、铁脚麻鸡、火鸡、鸽子共5个品种的蛋清、肛拭子及血清样品共953份,使用ELISA商品试剂盒进行检测;然后对部分ALV p27阳性的个体采集其血清样品接种DF-1细胞进行病毒分离并测定其gp85基因的序列。结果发现,除铁脚麻鸡外其他4个非鸡禽类品种的ALV检测均为阴性;除鸽子和狮头鹅外,麻鸭、铁脚麻鸡、火鸡均检测到REV抗体阳性;获得的两株铁脚麻鸡ALV分离株gp85基因之间核苷酸同源性为94.5%,与参考株之间核苷酸同源性为86.9%~94.9%;两株分离株gp85基因之间氨基酸同源性为91.5%,与参考株之间氨基酸同源性为84.0%~91.6%。高变区hr1和hr2区存在较多可变位点,可变区vr2和vr3相对较保守。系统进化树分析结果表明这两个毒株与参考株SCAU11-XG的亲缘关系最近。     

安徽省五华鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因分子序列特征分析

为进一步了解J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)gp85基因的结构、功能及其遗传变异趋势,采用PCR方法克隆了安徽省地方品种五华鸡ALV-J gp85基因序列ALV-J-WH,并将该序列与GenBank数据库中登录的15个gp85基因序列进行了比对分析。结果显示,ALV-J-WH与所比对的氨基酸序列同源性介于85.9%~96.2%之间,与其同源性最高的是来自于国内ALV-J毒株的JN378888基因序列,进化树也证实两者亲缘关系较近;此外,相对其他ALV-J gp85氨基酸序列,ALV-J-WH在223位氨基酸后有10个氨基酸的缺失;对所有全长序列分析结果表明,共有71个可变氨基酸位点,10个高度变异位点,尤其是hr1和hr2区域分布较多。结果表明,ALV-J-WH与国内部分ALV-J毒株分离gp85基因来自共同的原始病毒,但其具有独特的序列特征;ALV-J gp85基因高度易变,部分高频率突变的氨基酸位点可能是ALV-J在抗体免疫选择压下的作用位点。     

J亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在中国普遍存在,严重危害养禽业,暂时尚无有效预防、治疗禽白血病的措施,只能通过净化控制。因此,研究一种低成本、易推广的检测方法对防控此病非常重要。用DF-1细胞接种病毒,以细胞基因组为模板,通过巢式PCR方法扩增出941 bp的含酶切位点的ALV-J特异性基因gp85基因序列,连接于pET32a(+)载体上,实现gp85蛋白在宿主菌BL21的表达,以切胶回收方式纯化蛋白,成功获得约52 ku的重组融合蛋白,免疫新西兰兔,制备gp85单因子抗血清,Dot-ELISA检测抗体效价。结果显示,纯化所得蛋白质具有良好抗原性,制备的抗血清效价高于1.024×10⁵。本试验通过较简便、低耗的方法获得高效单因子血清,为抗血清的制备提供参考,为ALV-J gp85蛋白的研究、ALV-J特异性检测方法的研制打下基础,对ALV-J的净化有重要意义。     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

J亚群禽白血病JL-2株gp85基因的克隆与表达

本实验在分离鉴定J亚群禽白血病JL-2株的基础上,利用PCR方法扩增出包括gp85基因在内的长度为960bp的DNA片段.将其连到PGEX-6p-1载体上,构建了重组表达质粒PGEX-6P-1/gp85,对质粒进行序列分析并在IPTG的诱导下进行表达.SDS-PAGE分析结果表明,融合蛋白(54 Ku)在BL21中得到有效表达.表达产物占菌体总蛋白的31.8%.Western Blot结果表明,表达产物可与ALV-J阳性血清发生特异性反应.这些结果为进一步研究gp85蛋白的功能及研制ALV-J ELISA诊断试剂盒奠定了基础.     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在重组杆状病毒中的表达及鉴定

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmid-gp85转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp85。Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果表明ALV-J gp85蛋白在Sf9昆虫细胞中得到正确表达,表达的重组gp85蛋白分子量约为38 ku。ALV-J gp85重组蛋白在Sf9细胞中的正确表达为其功能研究和应用提供了良好的基础。     

J亚群禽白血病毒gp85基因克隆表达与初步应用

在本实验室分离鉴定J亚群禽白血病病毒的基础上,用PCR方法扩增gp85基因,长度为921 bp的DNA片段,与J亚群禽白血病标准毒株序列比对同源率为96.4%。将该片段连接到pET28a表达载体上,构建了重组表达质粒pET28a-S1-Jgp85,对质粒测序后分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为40 kD的融合蛋白。Western blot结果表明,表达产物可以与ALV-J阳性血清发生特异性反应。以纯化的His-Jgp85重组蛋白为包被抗原,建立间接ELISA方法,用于J亚群禽白血病的临床诊断。本研究对抗原包被浓度,待检血清稀释浓度,酶标抗体浓度,特异性试验及临界值等条件进行优化,对优化后的ELISA检测方法进行了临床应用试验。本研究建立了能特异性检测J亚群禽白血病血清抗体的ELISA方法。     

禽白血病病毒gp85蛋白在293T细胞中的表达及分析

为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(pEGFP-N1-gp85)的表达情况。结果显示,pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中均匀分布,说明pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达;pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达的蛋白质分子质量约为60 ku。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-gp85,并在293T细胞中获得了表达,为研制ALV-J-gp85 DNA核酸疫苗提供了科学支撑。     

禽白血病病毒贵州流行株env基因克隆与序列分析

为了解禽白血病病毒（ALV）贵州流行株的遗传变异情况及分子特征,本试验基于ALV env基因设计合成引物对禽白血病贵州临床病例进行目的基因扩增、克隆和序列分析。结果显示,从临床病例中筛选获得3份阳性样本,PCR扩增均获得大小约921 bp的目的基因片段,将其命名为：GZ-ALV-1株、GZ-ALV-2株和GZ-ALV-3株。序列分析结果显示,3株ALV贵州流行株之间核苷酸同源性在97.2%~97.6%之间,与国内外ALV-J的同源性相对较高,为93.1%~99.3%;而与A、B、C、D、E、K亚群ALV同源性仅为51.4%~53.2%。系统进化分析显示,3株ALV贵州流行株与ALV-J亚群参考株处于同一分支,表明本试验所检测的ALV毒株均为ALV-J亚群;与A、B、C、D、E、K亚群处于不同进化分支。基因变异分析显示,3株流行株37处相同核苷酸变异导致17处氨基酸发生位点变异,其中9个可变点在高变区hr1和hr2,1个可变点在低变区vr3。结果表明,3株ALV贵州流行株均为ALV-J亚群,env基因存在位点发生了变异,且可变位点位于序列高变区。本研究结果为明确贵州禽白血病流行概况及ALV的防控与净化提供基础数据。     

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于J亚群禽白血病病毒（ALV-J）原型株HPRS-103基因组碱基#5394-#5416及#7811-#7794的1对引物对PCR，在2000-2001年从山东，河南和宁夏分离的8株ALV-J中，有6株可以扩增出含gp85基因的2.2kb左右的特异性片段，对其中5株的扩增片段做了序列分析，结果表明，这5个毒株的囊膜糖蛋白gp85与原型株hprs-103有93.4%-96.8%的同源性，与我国最早的分离株SD99024有93.7%-98.7%的同源性，它们相互之间的同源性为91.2%-98.7%，由此说明，我国AVL-J的gp85基因正在不断发生变异。     

我国部分地区蛋鸡ALV-J分离株gp85基因遗传进化分析

为了解我国蛋鸡J亚型白血病病毒(ALV-J)株来源及其遗传进化关系,本研究对2009年从我国6个省区蛋鸡场分离到的19株ALV-J的gp85基因进行克隆和测序,并与11个ALV-J参考株gp85基因作了比较分析.结果表明:19个ALV-J分离株的gp85基因长度为894bp～924 bp不等,分别编码298～308个氨基酸;各病毒株间gp85推导氨基酸的同源性为71.3%～100%.遗传进化分析表明,目前我国蛋鸡ALV-J分离株来源复杂,其中13个分离株与英国原型株HPRS-103、国内麻黄肉鸡株SCAU-0901亲缘关系较近;3个分离株与美国株ADOL-7501及国内白羽肉鸡株HN0001处在同一大的分支;而另外3个分离株则各自形成独立的分支,表明其gp85基因发生了较大变异.本研究表明,19个分离株与国内早期肉鸡分离株亲缘关系较远,提示我国当前蛋鸡ALV-J株可能并非源自国内早期肉鸡ALV-J株,其来源有待进一步研究.     

不同地区海兰褐蛋鸡中J亚群-禽白血病病毒株gp85基因的分子演化分析

本研究通过对不同地区海兰褐蛋鸡群中分离的5株J亚群-禽白血病病毒(ALV-J)的囊膜糖蛋白基因(gp85)进行同源性分析,阐述了不同海兰褐鸡群中存在的ALV-J的分子演化规律。对2008-2009年分别从北京、陕西、山东泰安、济阳、曲阜等不同地区饲养的海兰褐鸡分离到的5株ALV-J,用PCR方法克隆gp85基因、测序,并与国内外已发表的14株ALV-Jgp85基因进行同源性比较。结果表明,5株ALV-J与来自白羽肉鸡的HPRS-103株的同源性最近,平均为96.6%(96.4%～96.8%);与来自国内海兰灰蛋鸡的SD07LK1株的同源性平均仅为89.6%(89.3%～89.9%);而5株ALV-J间的同源性高达98.1%以上(98.1%～100%)。本研究发现,不同地区的海兰褐蛋鸡中广泛存在的ALV-J可能有一个共同的来源,即国外的白羽肉鸡。     

用ALV-J gp85单克隆抗体证明蛋鸡存在J亚群禽白血病

采用免疫组化法，对病理学初步诊断为蛋用型鸡J亚群白血病的自然发病鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、心脏、胰脏、输卵管、卵巢、腺胃、骨骼肌、大脑、坐骨神经，用特异性抗J亚群禽白血病病毒(ALV—J)囊膜糖蛋白gp85的单克隆抗体进行检测，待检的组织切片中均检出阳性抗原，免疫组化的研究结果与病理学诊断结果相一致。在国内外首次发现并报道蛋用型鸡J亚群禽白血病的自然病例。     

江苏地方山羊品种细胞色素b基因全序列的比较研究

对江苏2个地方山羊品种细胞色素b基因全序列进行测定,并引用国外10个山羊品种Cyt b基因序列构建山羊分子系统树。结果表明,长江三角洲白山羊和黄淮山羊Cyt b基因全序列均为1140 bp,而且碱基组成也相似,序列间的差异百分数较小,仅为0.09%;构建的分子系统树提示2个品种的亲缘关系较近,可能在较早的世代具有共同的祖先。     

J亚群白血病的病理学观察及基因分析

内蒙古某肉种鸡场40周龄种鸡发生肿瘤性疾病，死淘率15％；经病理组织学检查，增生的肿瘤为典型的髓细胞瘤，因此怀疑此病是J亚群白血病。取病鸡肝电镜观察，在肝细胞胞浆膜下见有圆形的类病毒粒子存在；将肝病料处理后接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)，经电镜观察，可见正出芽的病毒粒子。为进一步确诊，以ALV-J原型株HPRS-103囊膜gp85基因为基础设计特异性引物，以感染的CEF基因组DNA为模板，体外扩增(PCR)gp85基因，结果获得了924bp的相应片段。将PCR产物进行分子克隆和序列测定，结果表明，内蒙古地区ALV-Jgp85蛋白的推测氨基酸与ALV-J原型株HPRS-103、山东SD9901株、美国ADOL-R5-4株及内源性病毒EAV-HP的gp85蛋白的氨基酸同源性分别为97.40％、95.13％、86.69％和85.06％，其中与HPRS-103的同源性最高，与EAV-HP同源性最低。因此可以确定本研究所克隆的基因为ALV-Jgp85基因，暂命名为ALV-J-NM8761。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒安徽分离株的鉴定及其gp85基因序列分析

从安徽省的黄羽肉鸡和罗曼蛋鸡中各分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒,克隆获得了2条相应的gp85基因序列,并与参考毒株进行序列比对。结果表明,两分离毒株与J亚群参考毒株同源性为82.1%~99.4%,分离毒株之间同源性为85.4%。其中肉鸡分离毒株与J亚群原型毒株HPRS-103同源性为97.1%,与J亚群国内毒株SD09TA04、SDYC02J同源性均为99.4%;蛋鸡分离毒株与HPRS-103的同源性为89.0%,与SD09TA04和SDYC02J同源性仅为88.6%。两分离毒株的gp85氨基酸序列出现突变和缺失,在高变区hr1、hr2变异明显。进化分析进一步表明,2个分离毒株亲缘关系较远,可能来源于不同的原始病毒株。     

AA肉种鸡内源性类ALV-J gp85基因及其抗原表位的分析

利用ALV-J gp85基因两侧的序列片段为引物,从山东潍坊某肉种鸡场送检的7日龄肉种鸡基因组中完整地扩增了内源性类ALV-J gp85基因。利用ALV-J env基因特异性引物不能扩增出长度为2.2kb的目的片段,用ALV-J特异性单抗JE-9做间接免疫荧光检测,也呈现阴性反应。这种内源性类ALV-J gp85基因与已报道的禽内源性反录病毒EAV-HP序列的同源性为85.6%～93.8%,其中与ADOL 0系来航鸡EAV-HP的相似性最高(93.8%)。所得到的内源性类ALV-J gp85基因与外源性ALV-J毒株HPRS-103、SD07LK1、NX0101的同源性分别为93.8%、91.8%和91.7%。并且与外源性ALV-J gp85基因具有相似的Jameson-Worlf抗原表位优势。这种内源性类gp85基因很可能与肉雏鸡早期感染ALV-J后所呈现的免疫耐受现象有关。     

鸡内源性类J亚群禽白血病病毒gp85基因的序列分析

利用J亚群禽白血病病毒gp85基因两侧的序列为引物,从正常的SPF鸡胚、肉鸡胚、良凤花鸡胚和土鸡的基因组中扩增出完整的内源性类ALV-Jgp85基因序列.这4种不同品种来源的ALV-JgP85基因与已报道的DF1细胞的内源性类ALV-Jgp85基因的同源性依次为98.5%、96.7%、98.6%、95.2%;与ALV-J原型株HPRS-103的同源性依次为97.3%、95.2%、97.6%、94.9%;与外源性IMC株的同源性依次为90.4%、88.5%、90.7%、89.6%.这将为深入探讨内源性类gp85基因在感染ALV-J发病的过程中起何种作用奠定了基础.     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。