同一养殖模式下不同地区猪源大肠杆菌耐药性比较

本试验旨在比较新疆相同养殖模式下不同地区猪源大肠杆菌的耐药情况。分别在某规模化养猪场呼图壁(207份)、玛纳斯(210份)和昌吉(210份)地区采集粪样,共计627份样品,各地区猪源大肠杆菌的分离率均为100.0%。采用微量肉汤稀释法对分离出的大肠杆菌进行临床常用抗菌药物的药敏试验,并通过卡方检验比较3个地区猪源大肠杆菌耐药率的差异。结果显示,呼图壁地区猪源大肠杆菌对安普霉素、阿米卡星、阿莫西林—克拉维酸和头孢噻呋的耐药率均极显著高于另外两地区(P< 0.01);玛纳斯地区猪源大肠杆菌对环丙沙星的耐药率显著高于另外两地区(P< 0.05),对诺氟沙星的耐药率极显著高于另外两地区(P< 0.01);昌吉地区猪源大肠杆菌对诺氟沙星的耐药率极显著高于呼图壁地区(P< 0.01),而对阿莫西林—克拉维酸和氨苄西林的耐药率均显著高于玛纳斯地区(P< 0.05)。呼图壁地区3~8耐菌株占94.7%,玛纳斯地区3~7耐菌株占89.5%,昌吉地区4~8耐菌株占82.4%。不同地区之间3~7耐菌株数差异不显著(P> 0.05)。结果表明,在相同的养殖模式下,不同地区猪源大肠杆菌的耐药情况不同。此外,养殖场猪源大肠杆菌的耐药问题严重,以多药耐药为主,耐药谱型呈多样化。     

猪m6A去甲基化酶FTO、ALKBH5基因表达水平与大肠杆菌F18感染抗性的关系分析

为了探讨猪6-甲基腺嘌呤（m⁶A）去甲基化酶mRNA表达水平与仔猪大肠杆菌F18抗性的关系,本研究运用实时荧光定量PCR方法检测m⁶A去甲基化酶FTO和ALKBH5基因在35日龄苏太猪断奶仔猪大肠杆菌F18抗性型和敏感型个体十二指肠和空肠组织中的mRNA表达差异,同时分别利用F18ab、F18ac大肠杆菌菌体刺激和内毒素LPS诱导猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,检测FTO、ALKBH5基因表达变化。结果表明,FTO、ALKBH5基因在抗性型个体十二指肠和空肠中的表达量均极显著或显著高于敏感型个体（P<0.01,P<0.05）;不同F18大肠杆菌菌体刺激IPEC-J2细胞后,FTO基因表达水平均无显著变化（P>0.05）,而ALKBH5基因在F18ac刺激后表达量显著上调（P<0.05）;LPS诱导4 h时,FTO和ALKBH5基因表达量均显著上调（P<0.05）。本研究在细胞和个体水平上初步验证并发现了m⁶A去甲基化酶FTO和ALKBH5基因表达水平与大肠杆菌感染仔猪密切相关,为今后深入研究RNA去甲基化修饰在仔猪细菌性腹泻调控中的作用机制提供了理论基础。     

Relationship Between Expression Levels of Porcine m6A Demethylases FTO and ALKBH5 Genes and Resistance to E.coli F18 Infection

To investigate the relationship between the mRNA expression level of m⁶A demethylase and E.coli F18 resistance in piglets,Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA expression differences of m⁶A demethylase FTO and ALKBH5 genes in the duodenum and jejunum tissues of E.coli F18-resistant and -sensitive individuals from 35-day Sutai weaned piglets.In E.coli F18ab,F18ac bacteria-stimulated and endotoxin LPS-induced porcine small intestinal epithelial cells (IPEC-J2),the expression levels of FTO and ALKBH5 genes were detected,respectively.The results showed that the expression levels of FTO and ALKBH5 genes in the duodenum and jejunum of resistant individuals were extremely significantly or significantly higher than those of sensitive individuals (P<0.01,P<0.05),and the expression of FTO gene were not significantly changed in E.coli F18 bacteria-stimulated IPEC-J2 cells (P>0.05),but the expression levels of ALKBH5 gene were significantly up-regulated after F18ac stimulation (P<0.05).After LPS induction for 4 hours,the expression levels of FTO and ALKBH5 genes showed significant up-regulation in IPEC-J2 cells (P<0.05).This study preliminarily verified and indicated that the expression levels of m⁶A demethylases FTO and ALKBH5 genes were closely related to E.coli resistance of piglets at the cellular and individual levels,which will provide a theoretical basis for future in-depth study of the regulation mechanism of RNA demethylation modification on bacterial diarrhea in piglets.     

石榴皮水提物对猪源多重耐药大肠杆菌的抑菌作用研究

【目的】筛选腹泻仔猪中携毒力基因且多重耐药的大肠杆菌菌株,评估中药水提物对该菌株的抑菌活性,并探索中药抑菌机制。【方法】通过PCR方法与Kirby-Bauer(K-B)药敏纸片法评估临床大肠杆菌菌株的肠毒素基因携带情况和耐药性;通过微量肉汤稀释法评估中药水提物对多重耐药大肠杆菌菌株的抑菌活性,确定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration, MBC);通过电导率仪以及相关试剂盒检测评估石榴皮水提物对多重耐药菌株作用不同时间后菌液电导率、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)含量及菌体内ATP含量的变化;通过SDS-PAGE和蛋白含量检测评估菌体内可溶性蛋白的含量变化;通过扫描电镜观察大肠杆菌形态变化。【结果】PCR检测14株临床大肠杆菌中肠毒素基因携带率达到78.57%,抗生素药敏试验结果显示,所有菌株至少对2种抗生素耐药,均属于多重耐药菌株。中药药敏试验结果显示,黄连、黄芩、石榴皮水提物对多重耐药菌株抑菌活性较好,其中石榴皮水提...     

Resistance Analysis and Genotype Detection of ESBLs-producing Swine E.coli Strains in Parts of Guizhou Province

To find out the drug resistance and the distribution and prevalence of ESBLs genotypes of E.coli strains on scale pig farms in Guizhou, the antimicrobial susceptibility of 164 E.coli strains were determined.And the genotype of ESBLs was identified and determined by CLSI standard method, DNA was amplified and the 4 genotypes of drug resistance plasmid of ESBLs were analyzed by PCR.The results showed that the drug resistance rates of 164 E.coli strains to ten kinds of antimicrobial agents were ceftiofur 93.29%, ampicillin 87.19%, tetracycline 86.59%, gentamicin 81.10%, streptomycin 53.66%, polymyxin 51.83%, ciprofloxacin 53.05%, kanamycin 47.56%, chlortetracycline 34.76% and florfenicol 21.95%, respectively, and most of them were multiple drug resistance strains, during which there were 137 strains ESBLs positive, detection rate was 83.54%, and the detection rates of 4 regions were different.The detection rates of TEM, CTX-M-1, SHV and OXA-1 genes of 137 ESBLs-producing E.coli strains were 90.51%, 70.07%, 51.82% and 43.07%, respectively.And the detection rates were various in 4 regions.The results showed that the drug resistance of E.coli strains from scale pig farms was serious in Guizhou, and the detection rate of ESBLs strains was very high, the drug resistance gene detection rate was extremely high, and most drug resistance strains were the composite genotype drug resistant.To prevent and cure colibacillosis in veterinary clinic effectively, we should reinforce monitoring and studying about the ESBLs-producing drug resistance bacteria.     

贵州部分地区猪源大肠杆菌耐药性分析及ESBLs基因型检测

为了解贵州地区规模养猪场大肠杆菌菌株耐药情况和ESBLs基因型的流行情况,试验采用CLSI推荐的方法对采自贵州省4个地区规模养猪场的164株大肠杆菌进行药物敏感性试验和产ESBLs菌的检测,并用PCR方法对TEM、SHV、OXA-1和CTX-M-1 4种常见ESBLs基因进行检测。结果显示,164株大肠杆菌对10种常用抗菌药物耐药率分别是头孢噻呋93.29%、氨苄西林87.19%、四环素86.59%、庆大霉素81.10%、链霉素53.66%、多黏菌素51.83%、环丙沙星53.05%、卡那霉素47.56%、金霉素34.76%和氟苯尼考21.95%,且大多为多重耐药,其中检测出ESBLs阳性菌株137株,阳性率为83.54%,各个地区的检出率不同;137株产ESBLs大肠杆菌中,TEM、SHV、OXA-1和CTX-M-1基因的检出率分别为90.51%、70.07%、51.82%和43.07%,且多为复合基因型耐药菌株,各地区的各种基因检出率不同。试验结果表明,贵州部分地区的猪源大肠杆菌耐药现象严重,ESBLs菌株的检出率很高,耐药基因的检出率也极高,且多为复合基因型耐药菌株,应加强当地产酶耐药菌的监测和研究,有效防制此类细菌引发的疾病。     

猪m6A甲基化酶WTAP基因与F18大肠杆菌感染的关系

本研究旨在探讨猪m⁶A甲基化酶WTAP表达水平与大肠杆菌（E. coli）感染抗性的关系。选取35日龄苏太断奶仔猪（Sus scrofa）大肠杆菌抗性型和敏感型个体各4头,采集十二指肠和空肠组织,利用RT-qPCR检测WTAP在E. coli抗性型和敏感型个体十二指肠、空肠的表达差异,并分别利用产肠毒素大肠杆菌（F18ab、F18ac）刺激和内毒素（LPS）诱导猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,检测WTAP基因的表达变化。同时构建WTAP基因干扰载体并转染IPEC-J2细胞,通过菌毛定量、菌落计数以及间接免疫荧光试验检测该基因沉默对大肠杆菌黏附能力的影响。结果显示：在十二指肠和空肠组织中,WTAP基因在E. coli抗性型个体中的表达量显著高于敏感型个体（P<0.01）;并且在F18ab和F18ac刺激后表达量显著下降,与LPS诱导6 h后结果相一致（P<0.01）。沉默WTAP基因后,大肠杆菌黏附能力极显著上升（P<0.01）。本研究在细胞和个体水平上验证发现,m⁶A甲基转移酶WTAP的高表达可能有助于仔猪抗大肠杆菌感染,为进一步揭示仔猪抗大肠杆菌感染的RNA甲基化调控机制奠定基础。     

六十二株水貂源大肠杆菌分离株耐药表型与耐药基因及克隆菌群分析

为了调查诸城地区某水貂养殖场粪便源大肠杆菌的表观及其分子特征,采集某个水貂养殖场的水貂粪便进行大肠杆菌分离鉴定,对分离鉴定的大肠杆菌进行血清型鉴定和对14种常见抗菌药物的耐药表型鉴定;使用PCR检测耐药基因以及Ⅰ整合子基因盒的携带情况,利用多位点序列分型（MLST）来分析菌株的克隆关系并构建系统发育树来分析相同克隆群菌株的遗传相似性。结果显示,自82份水貂粪便样品分离到62株大肠杆菌,分离率75.61%;大肠杆菌分离株对AMP和TET的耐药率超过90%,多重耐药菌株（MDR）占比为85.48%。PCR检测到5类耐药基因的存在,qnrS检出率最高,为61.29%（38/62）;aaC2、aaC4、sul1和aac（6'）-Ib-cr耐药基因与菌株产生相应的耐药抗性存在一致性（P<0.01）。分离菌株中Ⅰ类整合子可变区域的优势结构为dfrA27-aadA2-qnrA。鉴定出致病性血清型的存在,且对应菌株都具有多重耐药性,优势血清型为O104：H4。分离株中存在33个STs,ST46为优势STs（16.13%）,具有3个主要克隆群,依次为CC10、CC46和CC176;与致病性相关菌株的STs和人源大肠杆菌具有共同的遗传背景。本研究表明,养殖场的水貂受到致病性和多重耐药性大肠杆菌的污染,相同克隆群菌株的耐药基因分布具有多态性,表观特征差异明显。     

Study on the Anti-Escherichia coli Activity and Mechanism of Water Extract of Radix isatidis Powder

In order to explore the antibacterial activity and mechanism of the Radix isatidis powder water extract,the effects of the Radix isatidis powder water extract on the morphology and structure of Escherichia coli (E.coli) were tested by scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.The effects of the Radix isatidis powder water extract on the conductivity and total leakage rate of E.coli and the content of alkaline phosphatase in the culture medium of the content of protein,DNA and RNA were stained by DAPI to detect the effect of the Radix isatidis powder water extract on the nucleic acid of E.coli,and the effect of the Radix isatidis powder water extract on the metabolism of E.coli in vivo,in vitro,ALT,AST,pyruvic acid and ATP.The results showed that after the Radix isatidis powder water extract acted on E.coli for 10 h,it was observed by SEM that the bacteria appeared to overflow and shrink,the length of the bacteria became shorter obviously,many residues were formed due to breakage,some of them were sunken in the middle and deformed.Under TEM,it was observed that the boundary of the cell wall of E.coli was unclear,the wall membrane was zigzag,deformed and some of the bacteria were broken.The protein content outside the cell was significantly different from that in the blank control group from 8 h (P<0.01), and that in the cell from 4 h (P<0.01). DNA content had no significant difference with blank control group before 12 h (P>0.05), but had significant difference with blank control group from 16 h (P<0.01); RNA content began to decrease at 8 h, and was significantly different from blank control group at 12 h (P<0.05), and was extremely significant from 16 h (P<0.01). There was no significant difference between ALT and AST (P>0.05). The pyruvate content in culture medium and bacteria was higher than that in blank control group, and the difference was very significant from 4 h (P<0.01). The ATP content in the culture medium was significantly different from that in the blank control group (P<0.01), and the ATP content in the cell was significantly different from that in the blank control group from 4 h (P<0.01).In conclusion,the Radix isatidis powder water extract could inhibit the synthesis and metabolism of bacterial genetic material and the content of pyruvate and ATP by destroying the integrity of cell wall and cell membrane.     

板蓝根微粉水提物抗大肠杆菌活性及其机制的探究

为了探究板蓝根微粉水提物的抗菌活性及其抗菌机制，试验通过扫描电镜、透射电镜检测板蓝根微粉水提物对大肠杆菌形态和结构影响；酶标仪测定板蓝根微粉对大肠杆菌电导率、胞内物质总漏出率影响；测定大肠杆菌培养液中碱性磷酸酶含量以及大肠杆菌菌体内、外蛋白质含量；通过DAPI染色DNA、RNA，检测板蓝根微粉水提物对大肠杆菌核酸的影响；检测板蓝根微粉水提物对大肠杆菌菌体内、外谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、丙酮酸以及三磷酸腺苷（ATP）等菌体内代谢的影响。结果显示，板蓝根微粉水提物作用大肠杆菌10 h后，扫描电镜检测可见菌体出现溢缩，菌体长度明显变短，断裂形成许多残体，有的中间凹陷，发生变形；透射电镜下可观察大肠杆菌的胞壁界限模糊不清，壁膜呈现锯齿状，弯弯曲曲，变形，有的菌体破碎。总漏出率、电导率以及碱性磷酸酶含量测定结果显示，板蓝根微粉水提物各组D_{600 nm}均高于空白对照组，且呈剂量依赖性。菌体外蛋白质含量从8 h开始与空白对照组差异极显著（P<0.01）；菌体内蛋白质含量从4 h开始与空白对照组差异极显著（P<0.01）。DNA含量在12 h前与空白对照组无显著差异（P>0.05），从16 h开始与空白对照组差异极显著（P<0.01）；RNA含量在8 h开始降低，在12 h时与空白对照组差异显著（P<0.05），从16 h开始差异极显著（P<0.01）。ALT和AST浓度测定无显著性差异（P>0.05）。培养液和菌体内的丙酮酸含量均高于空白对照组，且从4 h开始与空白对照组差异极显著（P<0.01）。培养液中的ATP含量与空白对照组差异极显著（P<0.01）；菌体内ATP含量从4 h开始与空白对照组差异极显著（P<0.01）。综上，板蓝根微粉水提物可以通过破坏细胞壁、细胞膜的完整性，抑制细菌遗传物质合成和代谢，影响丙酮酸和ATP含量从而实现抗大肠杆菌作用。     

抑制大肠杆菌K88的益生菌体外筛选

本研究以从断奶仔猪肠道分离的益生菌为试验菌株,将大肠杆菌K88和益生菌接种到体外培养的猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cell-1,IPEC-1)中,测定培养2.5h上清液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,同时将益生菌和大肠杆菌K88体外混合培养2.5h,进行平板计数,统计大肠杆菌K88菌数的变化,筛选出可以抑制大肠杆菌K88的益生菌。试验结果显示,干酪乳杆菌和凝结芽孢杆菌能显著降低IPEC-1培养上清液中的LDH活性(P<0.05),降低大肠杆菌K88对细胞的损伤;凝结芽孢杆菌能降低DMEM培养基中大肠杆菌K88的生长速度,结合模拟制粒过程及胃肠道环境的耐高温、耐酸及耐胆盐研究进行综合分析,该凝结芽胞杆菌对大肠杆菌K88有较好的抑制作用且具有良好的耐高温、耐酸及耐胆盐性能,具有作为微生态制剂菌株的应用潜力。本试验建立了能够抑制大肠杆菌K88的益生菌体外筛选技术模型。     

广东鹅场大肠杆菌耐药状况及blaCTX-M基因的传播特征

为揭示广东地区鹅场动物和环境源大肠杆菌的耐药情况及超广谱β-内酰胺酶CTX-M的流行与传播特征,本研究从广东省江门及阳江市共10处鹅场采集鹅及环境样品199份,采用MALDI-TOF-MS法分离鉴定大肠杆菌。采用琼脂稀释法对菌株进行耐药性分析,采用PCR法检测头孢噻肟耐药菌中bla_CTX-M基因及其基因环境,采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）、接合转移和质粒复制子分型等方法探究bla_CTX-M基因的传播特征。结果显示,共获得196株大肠杆菌,对氨苄西林、多西环素、氟苯尼考和链霉素耐药率均超过50%,第三代头孢菌素耐药率为10%~25%,其中头孢噻肟耐药菌有49株（24.6%）。阳江地区大肠杆菌对受试药物的耐药率高于江门,且动物源高于环境源,尤其是头孢噻肟和头孢噻呋均存在显著差异（P<0.05）。头孢噻肟耐药菌中共检出19株携带bla_CTX-M基因,包括bla_CTX-M-55（n=17）、bla_CTX-M-27（n=1）和bla_CTX-M-65（n=1）,且bla_CTX-M基因阳性菌均可对5~11种药物耐药,呈现多重耐药的表型。bla_CTX-M-55基因环境均为ISEcp1-bla_CTX-M-55-orf477,且在ISEcp1与bla_CTX-M基因之间有3种长度的间隔序列;而bla_CTX-M-27和bla_CTX-M-65的基因环境均为ISEcp1-bla_CTX-M-27/65-IS903。19株bla_CTX-M基因阳性菌呈现10种PFGE谱型,存在一种主要流行的谱型（47.4%）,其包括多种来源菌株,暗示存在克隆传播现象。12株（63.2%）bla_CTX-M基因阳性大肠杆菌中bla_CTX-M基因转移成功,bla_CTX-M基因阳性接合子携带的复制子型为IncFⅡ（n=10）和IncHⅠ2（n=2）,且存在多西环素和氟苯尼考耐药表型与bla_CTX-M基因共转移现象。研究发现,阳江鹅场大肠杆菌耐药情况较为严重,bla_CTX-M基因存在一定的流行性且以bla_CTX-M-55亚型为主,bla_CTX-M基因阳性菌的克隆传播和质粒及插入序列ISEcp1介导的水平传播是导致该基因在鹅场大肠杆菌中扩散的主要原因,应引起高度重视。     

基于网络药理学联合16S rDNA高通量测序技术分析丹参对感染大肠杆菌小鼠肠道菌群的影响

本研究旨在通过网络药理学联合16S rDNA高通量测序技术分析丹参对感染大肠杆菌小鼠肠道菌群的影响。利用传统中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）筛选丹参有效成分及靶点基因。使用基因数据库（Genecards）获得E.coli靶点基因。两者靶点基因取交集,通过STRING平台进行蛋白质相互作用分析,构建PPI网络,并运用Cytoscape 3.8.2软件构建“丹参活性成分-潜在作用靶点”网络。利用DAVID在线工具进行基因本体论（GO）功能富集分析,Metascape数据库进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。试验选用110只雄性昆明小鼠,随机分为对照组、大肠杆菌组和低、中、高剂量丹参大肠杆菌感染组,每组22只。连续灌胃丹参液28 d后,用E.coli O₁₀₁进行腹腔注射,对照组注射无菌生理盐水,观察24 h后,收集各组粪便。应用16S rDNA高通量测序技术对各组小鼠肠道菌群进行分析。结果显示：1）网络药理学丹参有效成分36个,作用靶点669个,Genecards数据库搜索E.coli靶点8 902个,对两者取交集去除孤立点获得丹参治疗E.coli潜在靶点51个;GO、KEGG分析,获得关键靶点18个、关键通路47条,其中生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）各为174、76、45条;2）通过Illumina Miseq测序共获得950 855条有效序列,2 537个操作分类单元（OTUs）;3） Alpha多样性分析结果表明,不同剂量丹参组肠道菌群多样性与对照组具有显著差异,大肠杆菌组肠道菌群多样性显著低于对照组（P<0.05）;4）相比于大肠杆菌感染组,在门水平上,低、中、高剂量丹参大肠杆菌感染组Bacteroidetes （拟杆菌门）丰度极显著增高（P<0.01）,Firmicutes （厚壁菌门）丰度显著增高（P<0.05）,Proteobacteria （变形菌门）极显著降低（P<0.01）,在属水平上Bacteroides（拟杆菌属）丰度极显著增高（P<0.01）;5）基于LEfSe分析,对照组、大肠杆菌感染组、丹参高剂量大肠杆菌感染组共发现14种显著差异菌群;6） PICRUSt功能预测分析发现,丹参对大肠杆菌感染小鼠肠道菌群调节功能主要富集的途径是氨基酸、碳水化合物运输与代谢,翻译、核糖体结构和生物转化,细胞壁/膜/生物合成等方面。综上,基于网络药理学联合16S rDNA高通量测序技术全面揭示了丹参多成分、多靶点、多途径调节相关菌群生物丰富度,对大肠杆菌感染小鼠的肠道菌群紊乱有缓解作用,为临床应用丹参治疗大肠杆菌感染提供理论依据。     

畜禽粪污中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的LAMP检测及其耐药性分析

为深入了解畜禽粪污中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的流行及耐药状况,采用建立的畜禽粪便中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法对山东省内牛粪污、猪粪、鸡粪、鸭粪中的金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌进行检测,进而对检测阳性样品进行分离,并对药敏试验中多重耐药性菌株进行耐药基因预测。结果表明,LAMP方法检测畜禽粪污中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌与国家标准方法检测结果符合率为100%,重复性好,特异性高。从80份畜禽粪污样品中分离到的3株金黄色葡萄球菌均对青霉素耐药;34株大肠埃希氏菌对氟苯尼考、利福平的耐药比例高于50%,高于25%以上的还有氨苄西林、四环素、多西环素、磺胺异噁唑、头孢噻吩和头孢噻呋;耐药基因预测结果显示,鸡粪、鸭粪、牛粪和猪粪中的4株大肠埃希氏菌分别携带10、8、20和15种耐药基因;鸡粪中的1株金黄色葡萄球菌携带11种耐药基因。说明山东地区畜禽粪污中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌耐药状况严峻,菌株普遍多重耐药,且携带多种耐药基因。     

山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

试验旨在了解山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的污染状况及耐药情况。选择山东省3个地区的规模化奶牛场共采集227份牛奶样品，采用细菌学方法对大肠杆菌进行分离鉴定，用微量肉汤稀释法检测分离菌对11种常规抗菌药物的敏感性，采用PCR方法对常见的13种耐药基因、8种毒力基因和Ⅰ类整合子基因盒结构进行分析。结果显示，从227份牛奶样品中共分离出71株大肠杆菌；大肠杆菌对1种及1种以上抗菌药耐药的菌株达到77.5%，多重耐药率为15.5%，其中对多黏菌素耐药率为52.2%，对阿莫西林-克拉维酸耐药率为39.4%，而所有菌株均对新霉素表现为敏感。PCR检测耐药基因、毒力基因和Ⅰ类整合子结果显示，β-内酰胺类耐药基因中bla_TEM基因携带率为100%，其中全部为bla_TEM-1基因，bla_CTX-M基因携带率为32.4%，其中主要为bla_CTX-M-15基因，没有检测到bla_SHV、bla_OXA基因；多黏菌素的耐药基因mcr-1携带率为29.6%；喹诺酮类耐药基因中aac（6'）-Ⅰb-cr基因携带率为29.6%，qnrB基因携带率为20.8%，没有检测到qnrA和qnrC耐药基因；对8种毒力基因检测分析结果显示，仅Hly毒力基因没有被检出，Ecs3703、Irp2基因的检出率较高，分别为90.1%和63.4%，71株大肠杆菌中共有11株携带Ⅰ类整合子，检出率为15.5%，11株大肠杆菌携带6种耐药基因盒结构，最主要的耐药基因盒排列为dfr17-aadA5。本研究结果表明，山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的耐药现象严重，携带毒力基因Ecs3703、Irp2的大肠杆菌可能是引起奶牛乳房炎的致病菌，Ⅰ类整合子的检测在细菌耐药性与基因携带率方面发挥着关键作用，可为临床预防和治疗奶牛乳房炎大肠杆菌病提供理论依据。     

Screening of Probiotics Inhibiting E. coli K88 in vitro

The probiotics tested in the experiment were isolated from the intestinal of weaning piglets.The isolated probiotics and E.coli K88 were inoculated into the culture of intestinal porcine epithelial cell-1 (IPEC-1).The activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the supernatant was measured after incubating for 2.5 h.At the same time, the probiotics and E.coli K88 were co-cultured in vitro, the number of E.coli K88 was counted and the probiotics which could be resistant to the E.coli K88 were selected 2.5 h later.The results showed that the Lactobacillus casei and Bacillus coagulans could significantly reduce LDH activity (P<0.05), decrease the damage of E.coli K88; Bacillus coagulans could inhibit the growth of E.coli K88.At the same time, Bacillus coagulans could resist high temperature, acid and bile salt.The results showed that Bacillus coagulans strains had great potential as the application of probiotics strains.The methods could be used as a model of screen probiotics which could inhibit the growth of E.coli K88 in vitro.     

大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的研究

试验旨在研究大肠杆菌（E.coli）对奶牛子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells,BEECs）的体外炎性损伤,探究大肠杆菌引发炎性反应的最佳浓度、作用时间及机制。首先,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵、1×10⁶、2.5×10⁶、5×10⁶ CFU/mL）诱导刺激细胞3、6和9 h,通过倒置显微镜观察细胞形态、CCK-8法测D_{450 nm}值,检测大肠杆菌对细胞活性的影响;其次,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞3、6和9 h,用ELISA方法检测细胞上清液中白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌量;最后,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞6和9 h,用Western blotting检测核因子κB抑制蛋白α（IκBα）和p65蛋白的磷酸化水平。结果显示,与对照组相比,大肠杆菌感染细胞9 h后,1×10⁶、2.5×10⁶和5×10⁶ CFU/mL大肠杆菌组细胞活性均极显著降低（P<0.01）,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组显著降低（P<0.05）;大肠杆菌感染细胞9 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α极显著升高（P<0.01）;大肠杆菌感染细胞6 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IκBα、p65蛋白磷酸化水平和IL-6均极显著升高（P<0.01）,5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌组IκBα和p65蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.05）。结果表明,大肠杆菌可以刺激奶牛子宫内膜上皮细胞产生炎性反应,且当细胞与5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌作用6 h或与5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌作用9 h为最佳。     

灭活大肠杆菌与脂多糖诱导猪肠黏膜上皮细胞表达RegⅢγ的机理研究

试验旨在探索革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）及其表面分子脂多糖（LPS）诱导胰腺再生蛋白Ⅲγ（RegⅢγ）表达调控的机制。首先,用不同浓度灭活E.coli（10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ CFU/mL）和LPS （0.01、0.1、1、5、10、20、40、80 μg/mL）诱导猪肠黏膜上皮细胞（IPEC-JⅡ）,用MTT法测D_{490 nm}值,检测E.coli和LPS对IPEC-JⅡ细胞活力的影响;其次,用不同浓度灭活E.coli（10⁷、10⁶、10⁵ CFU/mL）和LPS （0.01、0.1、1、5 μg/mL）处理IPEC-JⅡ细胞24 h,用实时荧光定量PCR和Western blotting检测RegⅢγ mRNA和蛋白的表达;最后,用1 μg/mL LPS处理IPEC-JⅡ细胞24 h,用实时荧光定量PCR和Western blotting检测p65、p38、JNK、ERK mRNA和蛋白表达及磷酸化水平。结果显示,除0.01 μg/mL LPS不抑制IPEC-JⅡ细胞活力外,其他浓度的灭活E.coli和LPS均可抑制IPEC-JⅡ细胞活力,且10⁹、10⁸ CFU/mL E.coli和10、20、40、80 μg/mL LPS组细胞活力极显著下降（P<0.01）;与对照组相比,10⁷、10⁶和10⁵ CFU/mL E.coli均能诱导RegⅢγ表达增加,且10⁵ CFU/mL E.coli组RegⅢγ mRNA表达量极显著高于对照组（P<0.01）,蛋白表达量显著高于对照组（P<0.05）;0.01、0.1、1和10 μg/mL LPS均能诱导RegⅢγ表达增加,且0.1和1 μg/mL LPS组RegⅢγ mRNA表达量极显著高于对照组（P<0.01）,RegⅢγ蛋白表达虽有增加趋势,但差异不显著（P>0.05）;与对照组相比,1 μg/mL LPS组p65、p38 mRNA表达量极显著增加（P<0.01）,JNK、ERK mRNA表达量显著增加（P<0.05）;同时,p38、JNK蛋白表达量和磷酸化水平均极显著增加（P<0.01）,p65蛋白磷酸化水平显著增加（P<0.05）,ERK蛋白和磷酸化水平均增加,但差异不显著（P>0.05）。以上结果表明,灭活E.coli和LPS均可诱导RegⅢγ表达,1 μg/mL LPS可增加p65、p38和JNK蛋白的磷酸化水平。     

甜叶菊绿原酸增强大肠杆菌感染蛋雏鸡免疫力研究

旨在评价甜叶菊绿原酸增强人工腹气囊感染大肠杆菌O₇₈蛋雏鸡免疫力的作用效果,为功能性抗生素替代品研发提供基础参数支持。本试验随机将1日龄、体重无显著差异的健康海兰蛋鸡360只分为6组：空白对照组（C）、大肠杆菌O₇₈处理组（EC0）、1.0 g·L^-1杜仲素+大肠杆菌O₇₈处理组（ED1）、1.0 g·L^-1甜叶菊绿原酸+大肠杆菌O₇₈处理组（EC1）、2.0 g·L^-1甜叶菊绿原酸+大肠杆菌O₇₈处理组（EC2）、4.0 g·L^-1甜叶菊绿原酸+大肠杆菌O₇₈处理组（EC4）,预饲7 d后开始正式试验。第7天时将大肠杆菌O₇₈通过腹气囊感染蛋雏鸡,饮水投喂药物,每天1次,连用3 d。随后通过ELISA法检测血清IL-1β、IL-2、IL-6、IgM、IgA、TNF-α水平;RT-qPCR检测空肠和回肠IL-1β、IL-2、TNF-α、Claudin-1和ZO-1基因表达;高通量测序分析盲肠内容物微生物种类。结果显示：1）腹气囊感染大肠杆菌O₇₈显著增加了蛋雏鸡死亡率（P<0.05）,而甜叶菊绿原酸处理组（EC2、EC4）蛋雏鸡的死亡率显著降低（P<0.05）。2）甜叶菊绿原酸对大肠杆菌O₇₈感染蛋雏鸡血清IgA和IgM含量有提高趋势,可不同程度降低血清炎性因子含量,其中EC1、EC2、EC4组血清TNF-α含量显著降低（P<0.05）;EC2显著降低大肠杆菌O₇₈感染蛋雏鸡回肠促炎细胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α的基因表达（P<0.05）。3）甜叶菊绿原酸可促进蛋雏鸡空肠紧密连接蛋白基因表达,改善腹气囊感染大肠杆菌O₇₈对肠道屏障的损伤。4）腹气囊感染大肠杆菌O₇₈导致鸡肠道特有OTUs增加,增加肠道拟杆菌门、变形菌门和梭杆菌门的相对丰度,降低厚壁菌门的相对丰度;而甜叶菊绿原酸处理组（EC2）蛋雏鸡盲肠厚壁菌门的相对丰度升高,拟杆菌门和变形菌门的相对丰度降低。甜叶菊绿原酸可增强腹气囊感染大肠杆菌O₇₈蛋雏鸡机体的免疫功能,抵御大肠杆菌O₇₈对蛋雏鸡的侵袭,其中应用剂量为2.0 g·L^-1甜叶菊绿原酸的效果较好。这预示绿原酸具有抗生素替代品的功效,其对大肠杆菌感染蛋雏鸡机体免疫力的积极作用可能是通过调控免疫相关基因和维持盲肠微生物菌群稳态达到的,但其作用机制仍需深入的研究。     

Tissue Expression Profile and Differential Expression of LTβR Gene in Sutai Piglets of Different Ages

Dynamic changes of LTβR expression levels in 11 tissues (heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, muscle, thymus, lymph node, duodenum and jejunum) of Sutai piglets ranging from newborn to post-weaning days 8, 18, 30, and 35 were compared and analyzed by the Real-time PCR method, which aimed to provide theoretical basis for further investigate the relationship between LTβR gene and pathogenicity of E.coli F18.The results revealed that the LTβR expression levels were higher in the liver, spleen, lung, kidney, stomach, lymph node, duodenum and jejunum, and showed obvious age-dependent expression differentiation.The LTβR expression levels in the lymph node, duodenum, and jejunum were extremely significant higher in 8 days old piglets than in the other age stages (P<0.01), and the expression levels were extremely significantly higher in the lungs of 8 days old piglets than in 35 days old piglets (P<0.01) and significantly higher than 30 days old piglets (P<0.05).In the liver tissue, the expression level was extremely significant higher in 35 days old piglets than in other age stages (P<0.01).In the stomach tissue, the expression level was significantly higher in 35 days old piglets than in 18 days old piglets (P<0.05).The results speculated that intestinal immune barrier of piglets formed rapidly around 8 days old and the higher LTβR expression could contribute to the resistance to E.coli F18.