反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV) p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80%以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中。本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础。     

含EGFP基因的马疱疹病毒1型新疆株gE基因缺失株的构建

为筛选马鼻肺炎（equine rhinopneumonitis,ER）基因缺失减毒活疫苗的候选毒株,本研究参考GenBank中EHV-1（登录号：KF644579.1）目的基因序列设计同源臂引物,以本地区流行株XJ2015株DNA为模板PCR扩增gE基因同源臂gEH1、gEH1,以EGFP表达盒（CMV+EGFP+polyA）为标记基因,酶切后依次连接至载体pUC-19,成功构建重组质粒pUC-gEH1H2-EGFP。将XJ2015基因组与质粒pUC-gEH1H2-EGFP共转染至RK-13细胞进行同源重组,以EGFP为标记进行gE基因缺失毒株的筛选及纯化,并测定重组毒株效价。结果显示：经5轮荧光噬斑纯化、PCR及测序鉴定,成功获取一株携带EGFP基因的重组毒株XJ2015-△gE-EGFP,且重组毒株效价（10^7.1TCID₅₀/0.1 mL）较原毒株（10^8.8TCID₅₀/0.1 mL）下降约10^1.7TCID₅₀/0.1 mL。采用同源重组技术成功构建了1株马疱疹病毒1型流行株gE基因缺失突变株,为未来筛选马鼻肺炎基因缺失弱毒疫苗奠定了基础。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HB09JY03株感染的DF-1细胞的冻融裂解液中提取DNA,通过PCR方法扩增出约720bp的gag-p27基因片段,克隆至pMD18-T载体。鉴定正确后,将该片段克隆至pET-30a(+)原核表达载体,经IPTG诱导表达。表达产物经His Trap TMHP纯化后,测蛋白浓度达到9mg/mL。用兔抗自然p27蛋白阳性血清进行Western blot检测,表明重组p27蛋白有抗原反应活性。免疫新西兰大白兔后,产生的抗体与禽白血病全病毒抗原可以发生特异性反应。所制备的重组p27蛋白和多克隆抗体将在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。     

E3泛素连接酶RNF185对A亚群禽白血病病毒体外复制的影响

【目的】 环指蛋白185（ring finger protein 185,RNF185）是Ring家族E3泛素连接酶的一员。试验旨在探明鸡源RNF185对A亚群禽白血病病毒（Avian leukemia virus subgroup A,ALV-A）体外复制的影响,为进一步研究鸡源RNF185对ALV-A致病性的影响和介导的致瘤机制提供参考。【方法】 参考GenBank中已公布的鸡RNF185基因（登录号：NP_001007841）序列分别设计RNF185过表达引物和RNF185单链shRNA,通过PCR扩增RNF185基因及合成双链shRNA,将其分别克隆至真核表达载体psi-flag和干扰载体pLKO.1-GFP,并使用PCR、双酶切和测序等方法验证重组质粒。使用Western blotting验证重组质粒的表达和干扰效果,并使用CCK-8试剂盒检测重组质粒对DF-1细胞活性的影响。在RNF185过表达和干扰后的DF-1细胞中分别接种10⁴半数组织感染剂量（TCID₅₀） ALV-A （rHB2015012）病毒液,于接种完成后3、4和5 d收取细胞,并使用Western blotting检测ALV-A的病毒载量。【结果】 PCR成功扩增出RNF185基因,单链shRNA经退火后形成双链shRNA,并成功构建重组质粒psi-flag-RNF185、pLKO.1-RNF185-1和pLKO.1-RNF185-2。Western blotting结果表明,构建的过表达和干扰质粒能够在DF-1细胞中稳定表达和干扰RNF185。CCK-8结果表明,过表达和干扰RNF185不影响DF-1细胞的活性。RNF185过表达可以促进ALV-A在DF-1细胞中的复制,干扰RNF185表达可以抑制ALV-A在DF-1细胞中的复制。【结论】 本研究构建了可以在DF-1细胞中高效表达和干扰RNF185的过表达质粒和干扰质粒,RNF185对DF-1细胞增殖无明显影响,能够促进ALV-A （rHB2015012）在体外的复制。     

布鲁氏菌侵染对类泛素SUMO-1表达的影响及类泛素SUMO-1慢病毒表达载体的构建

研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。     

猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV/TK~-的构建及其生物学特性

为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研...     

鸡IFIT5对J亚群禽白血病病毒在DF-1细胞内复制的影响

【目的】制备鸡干扰素诱导蛋白含三角形四肽重复5(IFIT5)多克隆抗体,以探究IFIT5对J型禽白血病病毒(ALV-J)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以感染ALV-J的鸡脾脏组织细胞提取的RNA反转录获得的cDNA作为模板,对IFIT5基因进行PCR扩增,利用重组酶将纯化后的PCR产物和线性化载体进行连接,构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT5并测序。将测序正确的重组质粒pET-28a-IFIT5转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,表达的融合蛋白His-IFIT5纯化后免疫6周龄BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,通过Western blotting鉴定抗体的特异性,利用间接ELISA测定抗体的效价。将测序正确的重组质粒pcDNA5-flag-IFIT5转染DF-1细胞,24 h后接种ALV-J,通过Western blotting检测DF-1细胞中过表达IFIT5对ALV-J复制的影响。【结果】试验成功扩增到大小为1 440 bp的IFIT5基因,并成功构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT...     

携带Ⅰ型鸭肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒的构建

为构建含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒,本研究将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,在其荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因,将重组后的转移载体(pBlueSK-TK-EGFP-30)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,转染细胞盲传2代后仍能观察到绿色荧...     

Expression and Identification of F Gene of Duck Newcastle Disease Virus in Insect Cells

In order to express the F protein of duck Newcastle disease virus (NDV) in insect cells,one pair of specific primers was designed according to the published genome sequences of duck NDV to amplify F gene by PCR,the amplified fragment was cloned into baculovirus expression vector pFastBac1.Then the recombinant vector pFastBac-F was transformed into E.coli DH10Bac competent cells,and the positive recombinant bacmid rBacmid-F was screened according to the resistance and blue-white plague screening.rBacmid-F was transfected into Sf9 insect cells by liposome,once the cytopathic effect was found,the rBac-F could be aquired.The results of Western blotting and indirect immunofluorescence test showed that the recombinant proteins could be recognized by positive serum,indicating that the protein had good reactiongenicity.These results suggested that F protein of duck NDV had been successfully expressed in insect cells,which laid the foundation for the prevention and control of duck Newcastle disease.     

鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。     

小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒的构建与鉴定

本研究旨在构建Zbtb38（zinc finger and BTB domain containing 38）基因慢病毒过表达质粒载体。以小鼠脊髓组织为材料,采用重叠延伸PCR方法扩增小鼠Zbtb38基因的CDS序列,分别设计Zbtb38 CDS序列前段扩增引物1和后段扩增引物2,再以上述两对引物的扩增产物作为模板,设计引物3并进行融合PCR扩增,由此得到Zbtb38 CDS全序列。将获得的Zbtb38基因CDS全序列连接到质粒pGM-T,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用直接PCR鉴定阳性克隆并进行测序验证。利用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切方法将Zbtb38 CDS序列连接至慢病毒载体Plvx-puro,获得穿梭质粒Plvx-puro-Zbtb38,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒。结果显示,引物1扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1-1 794 bp,扩增产物实际测序长度为1 772 bp,引物2扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1 762-3 594 bp,扩增产物实际测序长度为1 818 bp,说明分段扩增目的片段已成功。引物3扩增的预期融合产物及菌落PCR扩增产物均包含Zbtb38 CDS全序列（3 594 bp）,与NCBI数据库Zbtb38基因的CDS序列比对后的重合率达99.99%,表明Zbtb38 CDS序列扩增成功。实时荧光定量PCR检测结果显示,病毒滴度达3.25×10⁸ Tu/mL,达到普通动物注射标准要求,提示慢病毒载体构建成功。综上所述,本试验成功构建了小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒载体。     

表达A亚群禽白血病病毒Gp85蛋白的乳酸菌的构建

本研究旨在构建乳酸菌表达载体以研制A亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A）的活菌疫苗,用于预防禽白血病。使用锚定表达载体构建2株分别表达gp85和gp85-DCpep基因的重组植物乳杆菌,以感染ALV-A的DF-1细胞的基因组DNA为模板,使用PCR方法扩增ALV-A Gp85蛋白的编码基因gp85,将树突状细胞靶向肽（DC-targeting peptide,DCpep）编码基因与gp85基因进行融合,获得gp85-DCpep基因;使用乳酸菌锚定表达载体pSIP409-pgsA’通过同源重组的方法构建重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85;经测序正确后将上述质粒分别电转化植物乳杆菌NC8感受态细胞,获得重组植物乳杆菌;使用SppIP诱导重组植物乳杆菌的表达,收集处于对数生长期的菌体,通过反复冻融获取细胞膜的蛋白样,采用Western blotting技术检测pgsA’-gp85-DCpep和pgsA’-gp85蛋白的表达情况。结果显示,试验成功获得基因片段gp85和gp85-DCpep,构建的重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85测序无突变和丢失情况,并成功电转到植物乳杆菌NC8感受态细胞中,使用SDS-PAGE和Western blotting技术在细胞膜蛋白样中检测到蛋白的表达,大小分别为48.3（pgsA’-gp85-DCpep）和47 ku （pgsA’-gp85）。本试验成功构建了重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85,获得的重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和NC8-pSIP409-pgsA’-gp85中的蛋白均成功表达,且具有反应原性,为后期深入研究重组植物乳杆菌在抗ALV-A感染中的保护机制奠定良好的基础。     

Construction and Identification of Lentiviral Overexpression Plasmid of Mouse Zbtb38 Gene

This study was conducted to construct zinc finger and BTB domain containing 38 (Zbtb38) gene lentiviral overexpression plasmid vector.Firstly,the CDS sequence of mouse Zbtb38 gene was amplified by overlap extension PCR method using mouse spinal cord tissue,and the Zbtb38 CDS sequence front amplification primer 1 and the latter amplification primer 2 were designed respectively.Using the amplification products of the above two primers as template,primer 3 was designed and subjected to fusion PCR amplification,thereby obtaining the full CDS sequence of Zbtb38.Then,the obtained Zbtb38 gene CDS full sequence was ligated to the plasmid pGM-T,and the recombinant plasmid was transferred into E.coli DH5α competent cells,the positive clones were identified and verified by direct PCR and sequencing.Finally,the Zbtb38 CDS sequence was ligated into the lentiviral vector Plvx-puro by XhoⅠ and BamHⅠ double digestion to obtain the shuttle plasmid Plvx-puro-Zbtb38,which was co-transfected with lentiviral packaging plasmids to produce lentiviral particles in 293T cells.The results showed that the primer 1 amplification product contained the first 1-1 794 bp of the Zbtb38 CDS sequence,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 772 bp.The primer 2 amplification product contained the 1 762-3 594 bp of the entire sequence of Zbtb38 CDS,and the actual sequencing length of the amplified product was 1 818 bp,indicating that the fragmented amplification target fragment was successfully obtained.The expected fusion products amplified by primer 3 and the PCR amplification products of the colonies both contained the complete sequence of Zbtb38 CDS (3 594 bp),which was compared with the CDS sequence of Zbtb38 gene in NCBI database,and the coincidence rate was 99.99%,indicating that the Zbtb38 CDS sequence was successfully amplified.The Real-time PCR results showed that the virus titer reached 3.25×10⁸ Tu/mL,which met the experimental animal injection standard requirement,indicating that the lentiviral vector was successfully constructed.In summary,the mouse Zbtb38 gene lentiviral overexpression plasmid vector was successfully constructed in this experiment.     

猪痘病毒TK、ORF121、ORF143基因缺失毒株的构建及其生物学特性的测定

为筛选猪痘病毒（SWPV）复制非必需区并测定其缺失株的生物学特性,本研究根据同源重组原理分别针对SWPV的TK（ORF063）、ORF121和ORF143基因设计引物。应用重叠延伸PCR技术拼接同源重组左右臂及EGFP筛选标记表达盒,将拼接片段分别转染到感染SWPV的PK15细胞。利用荧光显微镜观察标记含EGFP的单个蚀斑,筛选获取重组毒株。应用PCR及Western blotting对重组毒株进行鉴定。分别测定各毒株感染PK15细胞的蚀斑大小和皮下接种保育猪致病性。PCR结果表明,目的基因成功整合到相应位点,成功获得重组毒株rSWPV-TK、rSWPV-121和rSWPV-143;Western blotting结果显示,连续传代的重组毒株在PK15细胞上稳定表达外源蛋白。重组毒株在PK15细胞上形成的痘斑均小于亲本毒株,其中ORF121缺失株差异极显著（P<0.01）。各毒株均可导致保育猪痘斑形成,其中ORF121缺失株引起病变时间短,产生痘斑小,毒力较亲本下降。综上所述,本研究筛选到2个SWPV基因组中可供外源蛋白插入的复制非必需区ORF121和ORF143,为构建SWPV基因工程载体奠定了基础。     

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞（PK15）的转染效率，为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象，用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况，采用CCK-8检测细胞存活率，进而比较3种方法的转染效果。结果显示，转染PK15细胞后，电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体（P<0.01），但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著（P>0.05）；EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好，脂质体方法较差，与细胞转染效率基本一致；CCK-8结果显示，电穿孔转染后细胞存活率最低，极显著低于对照组（P<0.01），脂质体方法显著低于对照组（P<0.05），慢病毒方法与对照组间差异不显著（P>0.05）。综合考虑转染效率及细胞活性，本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞，为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。     

表达口蹄疫病毒P1基因的重组伪狂犬病病毒TK/gG-/PgG-P1的构建

为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础     

表达非洲猪瘟病毒p54蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK_（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为10^7.34/0.1 mL和10^7.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。     

卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI的构建及表达

为构建卵泡抑制素与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因疫苗pEGISI,将pcISI中的乙肝表面抗原(HBsAg)S基因及插入S基因中的抑制素(INH)基因片段酶切回收;PCR扩增pcISI中INH基因片段,调整阅读框,一起融合到pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,构建ISI-EGFP融合表达质粒pEGISI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pEGISI构建成功。将pEGISI转染293T细胞,16h后检测到绿色荧光,48h检测到强烈荧光,说明融合基因在293T细胞获得高表达;ELISA检测证实,表达产物ISI-EGFP融合蛋白具有INH的抗原抗体反应原性。质粒pEGISI的成功构建及表达为抑制素基因免疫的机理及安全性研究奠定了基础。