马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备

 利用RT-PCR扩增马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白（CP）基因（PLRV-CP）,回收大小约630 bp的特异性扩增片段并进行T-A克隆,测序表明该基因长度为627 bp,与已报道的36个PLRV-CP基因的核苷酸序列的同源性大于96%。以pBAD/Thio-TOPO为起始载体,构建了PLRV-CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP。以pBAD-LRCP为模板,用PCR法删除了该基因富含精氨酸稀有密码子的第52 ~ 177核苷酸,获得了PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126。用阿拉伯糖诱导工程菌TOP10（pBAD-LRCP-126）,获得了34 kD的诱导表达的融合蛋白（重组CP）。用镍离子亲和层析法从包涵体中纯化出了高纯度的重组CP,用纯化的重组CP作抗原免疫家兔获得了PLRV特异性的抗血清,间接ELISA检测显示效价为1︰12 800。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备PLRV抗血清奠定了基础。     

转基因马铃薯外源CP基因转录表达与病毒在寄主体内复制关系

以表达马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的转基因条件下马铃植株为供试材料,在接种病毒后续发感染条件下提取转基因植株ＲＮＡ,用克隆的病毒ＣＰ基因ＣＤＮＡ为探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析,用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）测定病毒含量,结果表明,转基因植株体内病毒积累量明显低于未转基因的对照植株,转基因植中外源ＣＰ基因的转录表达水平与病毒在体内的复制呈负相关。     

辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b（+）上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。     

香蕉线条病毒衣壳蛋白功能域基因的原核表达及抗血清制备

 制备香蕉线条病毒广东分离物（BSV-GD）的抗血清,可为BSV-GD 的快速检测和进一步研 究BSV 编码蛋白的功能提供条件。通过常规分子生物学方法,克隆了BSV-GD 衣壳蛋白（Coat protein, CP）功能域基因,构建了该基因的原核表达载体pET28b-CP,并诱导表达了大小约为46.5 kD 的融合蛋 白His-CP。可溶性分析表明该融合蛋白以包涵体形式存在。利用His 标签纯化试剂盒对目的蛋白进行纯 化、回收,获得了高纯度的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫健康大耳白兔,成功制备了BSV-GD CP 功能域基因编码蛋白的兔抗血清。Western-blotting 分析表明该抗血清具有很强的特异性,间接ELISA 法检测抗血清效价达204 800 倍以上,对植物材料的合适检测浓度为1︰1 600 ~ 1︰6 400。     

山东寿光地区番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用双生病毒简并引物PA/PB,对山东寿光地区保护地疑似感染番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的番茄植株进行PCR检测,结果证明番茄病叶由TYLCV侵染所致。以提取的病叶总DNA为模板,扩增得到长约770 bp的TYLCV-CP基因片段,克隆至pEASY-T1 Simple载体,然后用Xho I和EcoR I将其切下并插入到pET-32a表达载体中,构建了寿光地区TYLCV分离物的外壳蛋白基因原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导获得了50 kD重组蛋白,Ni2+-NTA亲和层析纯化和Western印迹分析证明目的蛋白为TYLCV外壳蛋白,且具有良好的抗原活性。     

中国葡萄卷叶相关病毒7检测及基因变异分析

葡萄卷叶相关病毒7(grapevine leafroll-associated virus 7,GLRaV-7)是与葡萄卷叶病相关的重要病原物之一.为明确中国GLRaV-7分离物的基因序列变异,采用RT-PCR方法对采自中国15个省(市)、自治区的188份葡萄样品进行检测,检出率为24.5％ (44/188).对来源于...     

利用原核表达的外壳蛋白制备草莓轻型黄边病毒抗血清

【目的】探索以原核表达的草莓轻型黄边病毒(SMYEV)外壳蛋白(CP)为抗原制备抗血清的方法,从而建立利用ELISA检测SMYEV的技术体系。【方法】利用IPTG诱导SMYEV CP重组蛋白在大肠杆菌中表达,分离纯化重组蛋白并以其为抗原对新西兰兔进行免疫。血清效价达到要求后,分离纯化抗血清并利用DAC-ELISA对草莓植株进行SMYEV检测,同时利用RT-PCR对DAC-ELISA检测结果进行验证。【结果】宿有SMYEV CP基因的大肠杆菌经IPTG诱导后出现一条52.0 ku左右的特异性重组蛋白谱带,以纯化的重组蛋白为抗原制备出专一性较强的针对SMYEV的抗血清,该抗血清稀释800倍后仍能有效检测草莓植株中的SMYEV。利用DAC-ELISA和RT-PCR对26份草莓试材分别进行SMYEV检测,2种检测方法的检测结果基本一致。【结论】以原核表达的SMYEV CP为抗原可以制备出专一性较强、效价较高的SMYEV的抗血清。     

葡萄A病毒四川分离物的外壳蛋白基因克隆与原核表达

葡萄A病毒（Grapevine Virus A,GVA）是葡萄病毒属（Vitivirus）的典型种,在世界葡萄产区广泛分布。采集10株“藤稔”葡萄成熟枝条,使用6种葡萄病毒ELISA试剂盒检测发现10个样本中有6个感染4种不同的葡萄病毒。以GVA的ELISA阳性植株为材料进行RT-PCR扩增,首次获得了GVA四川分离物SL10的完整外壳蛋白基因（CP）。该基因全长597 bp,将其与GeneBank收录的15个GVA分离物的CP序列进行比对和构建系统进化树。把不同地理起源的GVA分离物分成2个变异组;其中Ⅰ组包括3个分离物(与Ⅱ组的其他分离物只有75.9%～80.1%的序列同一性);其余的13个分离物组成Ⅱ组（组内分离物具有84.4%～99.5%的序列同一性）。构建了GVA CP的原核表达质粒PET-30-GVAcp并转化BL21菌株,经IPTG诱导,目的基因得到了大量表达。     

葡萄卷叶病毒3 RT-PCR检测技术研究

采用改进的二氧化硅吸附法和2组特异性引物进行葡萄卷叶病毒3(GLR aV-3)RT-PCR检测。结果表明,二氧化硅吸附法提取总RNA纯度好、浓度高、操作简便;随机引物合成cDNA能同时用于多种病毒及不同引物的PCR,可简化检测程序,降低检测费用;LC 1/LC 2引物进行RT-PCR检测,病毒检出率高于PU/PD引物和EL ISA方法。建立了规范、灵敏、稳定、快速、经济的GLR aV-3RT-PCR检测技术体系。     

落葵皱缩花叶病毒CP基因的原核表达及多克隆抗血清的制备

以感病紫茉莉叶片为材料,采用RT-PCR方法克隆落葵皱缩花叶病毒(Basella rugose mosaic virus,Ba RMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,并构建p ET30a-Ba RMV-cp原核表达载体。将原核表达载体转化大肠杆菌[Rosetta(DE3)Plys S],成功诱导表达得到大小约为40.0 k D的与预期大小相符的融合蛋白(His-CP)。SDS-PAGE电泳完毕后用0.25 mol·L~(-1)的KCl溶液染色,将目的蛋白切胶纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗血清。间接酶联免疫吸附法(ID-ELISA)检测该抗体的效价为1︰16 000,Western-blotting分析表明该抗体具有很强的特异性。对野外感病紫茉莉和实验室内接种发病本氏烟检测结果也表明,所制备的抗体具有良好的特异性,可用于大规模样品检测。     

百合无症病毒CP基因的克隆及其RNA i载体的构建

 以感染百合无症病毒(LSV) 的百合叶片总RNA为模板, 利用反转录聚合酶链式反应(RT2PCR) 扩增出了876 bp的LSV CP基因, 经Blast比对发现该片段与GenBank上发表的LSV CP基因序列高度同源, 同源率98% , 由该序列推导出的氨基酸序列相似性达到98%。应用Gateway技术将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR201, 并进行序列测定, 再通过LR反应将目的片段插入到RNAi植物表达载体pH7GW IWG2 ( Ⅱ) , 成功构建了适合农杆菌介导的百合转化的RNAi载体。     

差异显示技术在马铃薯基因功能研究中的应用

近年来,包括马铃薯在内的植物功能基因组学研究得到飞速发展。基因差异表达技术的日趋完善,为探讨动植物特定的遗传现象、规律及抗逆机制研究提供了极大的方便。文章论述抑制性消减杂交技术、cDNA—AFLP技术、cDNA微阵列（也称为cDNA芯片）等技术在马铃薯基因功能研究中的最新进展。     

马铃薯Y 病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析和株系鉴定

 对河北张家口感病马铃薯的一个马铃薯Y病毒分离物( PXY-HBEI) 的外壳蛋白基因进行了克隆和序列分析。以提取的RNA为模板, 应用RT-PCR扩增目的基因, 扩增产物克隆到质粒pGEM-T, 上并序列分析。结果表明, 克隆cDNA片段由801个核苷酸组成, 编码267个氨基酸。与基因库中PVY代表株系相比, 它们的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.6%～98.8%和93.3% ～98.5% , 与PVYN 和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93.6%和97.8% , 确定PVY-HBEI归属于普通株系( PVYO株系) , 同时建立了快速、灵敏、简便的PVY RT-PCR检测方法。     

葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析

 葡萄卷叶伴随3型病毒（Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3）和葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Himrod’）中不同组织内病毒的相对积累量,结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的cDNA为模板,优化了RT-PCR多重扩增体系,可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染GLRaV-3与GVA的‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Fujiminori’）中,分别克隆了GLRaV-3外壳蛋白（coat protein,CP）基因全长序列和GVA部分基因组区域序列,后者包括CP基因的部分序列与病毒RNA沉默抑制子（viral suppressor of RNA silencing,VSR）基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进化研究表明,不同GLRaV-3分离物的CP高度保守;而‘藤稔’葡萄的GVA分离物包含多种变异株,具有准种病毒的特点。     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

 以田间采集的马铃薯病叶中提取的马铃薯病毒s(PVS)总RNA为模板，通过RT—PCR获取长度为890 bp的P 一cp的cDNA，克隆至pGEM—T载体上。酶切回收该基因片段，并构建了该基因的原核表达质粒pBV—pvs。SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析表明：P 一印基因在大肠杆菌JM109中可特异地高效表达分子量约33kD的蛋白，且表达蛋白具有良好的抗原活性。利用该表达产物免疫动物家兔，获得的抗血清可用于大田马铃薯s病毒的快速检测。     

黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 的原核表达载体 的构建及表达分析

以先前克隆到的黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 全长的cDNA 为模板,用含有特异性酶切位点
的Yh1、Yh2 为引物,通过PCR 方法将黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 的ORF 区构建到大肠杆菌表达载体
pGEX-4T-1 上获得原核表达载体p4t-LOX2,将该表达载体p4t-LOX2 转化到大肠杆菌菌株BL21（DE3）
中,获得相应的重组工程菌。在IPTG 诱导下,通过SDS-PAGE 电泳,得到一条约115 kD 的融合蛋白条带,
除去pGEX-4T-1 自身诱导的约26 kD 大小的GST 标签蛋白后,CsLOX2 编码一个约89 kD 的蛋白。 经过
融合蛋白表达体系的优化分析,表明该融合蛋白在 37℃,0.80 mmol·L^-1 IPTG 诱导表达 10.5 h,可获得
融合蛋白的最大表达量。     

百合无症病毒16kD基因的克隆、原核表达及抗血清制备

以感染百合无症病毒(LSV)的百合叶片为试材,克隆LSV16 k D基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)上。将获得的重组质粒p ET-28a(+)+16 k D转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到了高效表达的16 k D蛋白,融合蛋白分子量约为20 k D。融合蛋白经过镍柱纯化后作为抗原免疫注射小鼠,制备得到16 k D蛋白抗血清。Western blot分析显示所制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应;通过ELISA检测和RT-PCR检测百合样品,证实制备的抗血清与LSV侵染的百合叶片发生了相同的特异性反应。结果表明,目的蛋白表达成功,所制备的抗血清具有特异性,可用于LSV的快速检测、免疫组织化学以及16 k D蛋白功能研究。