同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立

应用猪瘟病毒（CSFV）及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT—PCR方法。该方法可检测到3．2TCID50的CSFV和1．8TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量RT—PCR方法对155份现地样品进行检测,结果73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT—PCR的符合率高达99．4％。该复合荧光定量RT—PCR方法敏感、特异、重复性好。     

猪蓝耳病活疫苗中猪瘟外源病毒检测

试验采用IFA法对2批随机抽样的PRRS活疫苗(每批4瓶)、阳性对照(CSFV)、阴性对照(未被CSFV污染的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV))和特异性试验检测病毒(猪圆环病毒2型(porcine circo virus 2 type,PCV-2))接种于生长良好的PK-15细胞进行间接免疫荧光染色检测CSFV,以期建立快速、准确的间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)调查猪蓝耳病活疫苗中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的污染情况;在不同时间、相同试验条件下,相同批次的疫苗被重复检测了3次。试验结果表明:阳性对照接种的PK-15细胞出现特异性黄绿色荧光,阴性对照、PCV-2和待检样品接种的PK-15细胞均未出现特异性黄绿色荧光,即待检2批PRRS活疫苗未被CSFV污染;通过3次重复操作,最终的检测结果一致,说明IFA检测猪瘟病毒包涵体的特异性强、敏感性高。     

猪流感病毒与繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、圆环病毒、伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌混合感染的情况调查

应用套式PCR方法对采自广西境内13个市122个不同规模猪场及农村散养户的126份病料,进行了SIV的检测,并对鉴定为SIV阳性的15份病料,再分别进行PRRSV、CSFV、PCV-2、PRV、HPS的检测,以调查广西猪群中SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2、PRV、HPS混合感染的情况。结果发现：猪群中SIV感染率为11.9%(15/126),而在所检测的15份阳性病料中,SIV混合感染十分严重,感染率为73.3%(11/15)。混合感染病毒种类最多达四重感染（SIV+PRRSV+CSFV+PCV-2）,占6.67%(1/15);三重感染(SIV+PRRSV+PCV 2、SIV+PRRSV+CSFV) 占40%(6/15);二重感染（SIV+PRRSV,SIV+PCV-2）占26.6%(4/15)。调查结果表明广西发病猪群中SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2混合感染普遍存在。     

实时荧光定量PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

根据GenBank发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守区域的序列分别设计了2对特异性引物。建立了一种快速检测CSFV和PRRSV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测采集的临床疑似病料。结果表明,建立的CSFV、PRRSV-SYBR GreenⅠPCR有较好的特异性,敏感性和重复性,可以用于CSFV和PRRSV的检测。     

基于牛呼吸道合胞体病毒F基因TB Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立

为了对牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)进行准确定量检测，针对BRSV F基因设计特异性引物，构建pMD19T-BRSV-gF重组质粒，以其为模板优化反应条件及反应体系，建立TB GreenⅡ荧光定量PCR方法并应用于临床BRSV检测。结果显示，针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好，相关系数为0.995 2;灵敏度高，BRSV最低检测限达3.9×10¹ copies/μL;特异性良好，可特异性检测出BRSV,对牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒的扩增呈阴性；重复性好，批内和批间重复性试验变异系数均小于2%。对50份临床样品进行检测，荧光定量PCR对BRSV的阳性检出率(26%)明显优于常规PCR方法(14%)。结果表明针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR检测方法适合BRSV的临床检测。     

2020年秋冬季四川省内江市无害化处理病死猪5种病毒核酸检测

为了解2020年秋冬季内江市病死猪中猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒3型(PCV-3)、猪瘟病毒(CSFV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)5种病毒感染情况,在14个病死畜禽无害化处理收集点,采集108份病料样品,采用荧光PCR/RT-PCR方法进行5种病毒核酸检测。结果显示:PCV-2、PRRSV、PCV-3、CSFV的核酸检出率分别为44.4%、33.3%、12.9%、7.4%,未检出PRV核酸;双重感染检出率为18.5%,以"PCV-2+PRRSV""PCV-2+PCV-3"为主,多重感染检出率为1.9%。结果表明,内江市病死猪群中PRRSV、PCV-2感染较为严重,PCV-3零星分布,且呈现一定的混合感染状态,而CSFV和PRV感染得到有效控制。结果提示,内江市应重点加强PRRSV、PCV-2、PCV-3感染的监测与控制。     

猪圆环病毒1型和2型a与b基因型三重PCR鉴别方法的建立及应用

根据PCV-1、PCV-2a和PCV-2b差异序列,设计了3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可以用于PCV检测及PCV-1、PCV-2a和PCV-2b分型的PCR方法。结果表明,三重PCR检测的最低敏感度可达4.87×107 copies/μL(PCV-1)、2.83×107 copies/μL(PCV-2a)和2.96×106 copies/μL(PCV-2b)。引物特异性良好,各引物之间没有交叉反应,对伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)检测均为阴性。应用该方法对采自陕西省的56份样品进行检测,PCV-1检出率57.14%(32/56),PCV-2a检出率1.78%(1/56),PCV-2b检出率42.86%(24/56),多重PCR检测结果与单PCR检测结果的符合率达99%以上,可用于猪圆环病毒的临床检测及流行病学监测等。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了快速准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)并对病毒拷贝数进行定量,试验根据Gen Bank中PCV-2保守序列(登录号为FJ644559.1)设计1对特异性引物和Taq Man探针,制备标准品,建立PCV-2的荧光定量检测方法,并对临床样品进行检测。结果表明:该方法在1×101~1×108拷贝/μL的模板范围内具有良好的线性关系,相关系数可达0.999;敏感性是常规PCR方法的100倍;对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均为阴性,没有交叉反应;批内、批间重复试验变异系数均小于2.50%;在临床检测中,比常规PCR方法检测PCV-2的阳性检出率高出38%。说明试验成功建立了PCV-2 Taq Man荧光定量PCR检测方法,可用于临床检测PCV-2感染及对其拷贝数进行定量。     

猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征寡核苷酸芯片诊断方法的建立与初步应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）是引发猪繁殖障碍的主要病原,建立其基因芯片快速检测体系,对开发猪繁殖障碍快速检测试剂盒具有重要意义。根据GenBank中已发表的PRRSV、CSFV和PCV-2的病毒基因组序列,设计合成特异性引物和特异性较强的60mer的寡核苷酸探针,并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片。通过引物标记及特异性验证,建立了带标记引物的多重PCR检测体系,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段。将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交,扫描、分析芯片上荧光信号。结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR检测60份临床病料,两者符合率高达92%,表明该检测技术能够用于临床病料的检测及快速诊断PRRSV、CSFV和PCV-2。     

2017—2021年南阳市猪主要病毒病的病原学检测与分析

为了掌握2017—2021年南阳市猪主要病毒病的流行情况，试验应用RT-PCR/PCR方法对采集的261份临床病料样品进行猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV-2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3, PCV-3)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)5种病原的检测，并按不同地区、不同年份、不同季节及混合感染和单一感染情况进行统计分析。结果表明：南阳市存在CSFV、PRRSV、PCV-2、PCV-3和PRV的流行，以PCV-2的阳性率(24.52%)最高，PRV(9.96%)次之，CSFV和PRRSV的阳性率(3.45%和3.83%)较低。CSFV、PRRSV、PCV-2、PCV-3、PRV阳性率最高的地区分别为宛城区(6.90%)、镇平县(8.57%)、社旗县(3...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,采用RT-PCR扩增PRRSV N基因266bp片段,并克隆到pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立了PRRSV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.3×101拷贝/μL,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪日本脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明,建立的PRRSV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征病毒病(PRRS)的诊断。     

荧光定量RT-PCR检测公猪精液和血液中猪瘟病毒载量

为快速检测规模化猪场猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),本研究参考GenBank中登录的CSFV序列设计引物,利用实时荧光PCR技术,构建重组质粒作为阳性标准品,建立特异、敏感、重复性好的CSFV快速定量检测方法.同时建立标准曲线,用于对猪瘟病毒的定量分析.本方法对规模化猪场的100份抗凝血和50份公猪精液样品进行检测,常规PCR检出27份占18％,荧光定量PCR检出123份占82％.表明荧光定量RT-PCR方法在检测猪瘟样品中具有潜在的应用价值,同时可检测猪群中猪瘟病毒持续性感染的状态存在.     

PRRSV、PCV2与CSFV多重SYBRGreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与猪瘟病毒(CSFV)3种病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了3对引物分别用于扩增PRRSV ORF7基因、PCV2ORF2基因与CSFV 5′端保守序列的部分片段。将测序正确的3段基因片段分别克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,PCV2、PRRSV与CSFV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为84.6、86.7、89.3℃,溶解曲线特异,灵敏度分别可达181、202、177拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本试验建立的PRRSV、PCV2与CSFV的荧光定量PCR检测方法实现了3种病毒的同时检测,能够对PRRSV、PCV2、CSFV混合感染的临床病料进行快速诊断。     

上海地区出现猪繁殖与呼吸综合征和2型猪圆环病毒混合感染

上海地区6个规模化猪场断奶后仔猪出现全身消耗性综合征，剖检的18头病仔猪都表现肺脏严重病变和淋巴结肿大出血。分别设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)N蛋白和2型猪圆环病毒(porcine circovirus type2，PCV-2)部分基因的特异性PCR引物，通过RT—PCR和PCR技术从患病猪肺脏组织均扩增出PRRSV和PCV-2的特异基因片段。结合临床症状和流行病学调查，证实上海地区出现PRRSV和PCV-2的混合感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中已登录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在Nsp7基因中的保守区域设计合成了1对特异性引物,通过反应条件的优化,建立了检测美洲型PRRSV的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法,同时与商品化荧光定量PCR试剂盒进行比对分析。结果表明,该方法特异性强,灵敏度高,能很好的区分美洲型猪繁殖与呼吸道综合征病毒和其他病毒。使用该方法对14份临床样品进行检测,阳性率85.7%,与商品化试剂盒符合率100%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。     

武汉地区猪场中5种病毒性疾病的病原检测与分析

为了分析2016—2018年武汉地区猪场中5种病毒性疾病的流行情况,试验采用RT-PCR和PCR方法对2016—2018年采集的1 324份患病猪的肺脏、肝脏、淋巴结、小肠、血液等病料组织进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)5种病原的检测,统计其阳性数、阳性率及总阳性率,并分析其混合感染情况。结果表明:采集的病料组织经CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PEDV特异性引物扩增均获得目的条带; CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2和PEDV的测序结果与GenBank中的参考株相比同源性均在96.8%～99.8%之间;经统计2016—2018年间猪场中CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2、PEDV总阳性率分别为23.0%、14.0%、6.8%、17.5%、10.6%,其中CSFV、PRRSV和PCV-2的阳性率较高,为该地区主要流行毒株;多重感染表现出逐年增高的趋势,且以二重感染为主,占检测总数的7.3%。说明武汉地区猪场中CSFV、PRRSV和PCV-2感染严重,并以多重感染为主。     

猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立能够猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)双重荧光定量PCR方法,试验比对了CSFV与ASFV的基因组序列,针对CSFV 5′-UTR和ASFV B646L保守靶序列,分别设计2条特异性引物及1条TaqMan探针,通过优化扩增体系和程序,建立可同时检测CSFV和ASFV的双重荧光定量PCR方法,并建立该方法的标准曲线,同时用敏感性试验、特异性试验和重复性试验对该方法进行评价,最后检验该方法的应用效果。结果表明：CSFV和ASFV标准曲线的相关系数(R²)分别为0.999和1,线性关系良好;CSFV与ASFV的最低检测浓度分别为1.3×10⁰ copies/μL和2.4×10⁰ copies/μL;与其他常见猪只病原检测无交叉反应;批间与批内变异系数均小于2%,稳定性良好。试验建立的方法对44份临床样本的检测结果与《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540—2011)和《非洲猪...