云南黄牛血液中阿卡斑病毒的分离鉴定及S基因序列分析

为了解阿卡斑病毒在云南师宗的流行情况及病毒的遗传特征,本研究在云南师宗设立哨兵动物,2014年5～11月每周1次连续采集血清、血液样品,血清用做AKAV抗体检测,血液在C6/36、BHK-21、MDBK和Vero细胞上进行病毒分离工作,用S基因特异引物对阳性分离物进行鉴定及序列分析。结果显示,15头哨兵动物共采集到28批420份血清、420份血液样品,其中有3头牛和1只羊感染AKAV,从这些样品中分离获得2株AKAV(编号09312D和09312H),它们在BHK-21和MDBK细胞上48 h产生明显CPE。2株新分离AKAV的S片段序列核苷酸同源性为100%,氨基酸同源性为100%,与所引用的9株其他不同地区分离的AKAV的S片段序列核苷酸同源性在83.8%～97.7%之间,氨基酸同源性在90.6%～99.6%之间,且新分离毒株处于同一进化小分支,具有高度亲缘性,形成了一个独立的次级分支,同时与其他2株中国AKAV分离株处于同一进化簇。结果表明,云南省师宗县为AKAV流行地区,病毒在当地活动频繁,新分离得到的2株病毒与其他AKAV毒株具有较高的核苷酸同源性和氨基酸同源性,提示亚洲太平洋地区AKAV病毒长期流行且关系密切,同时其氨基酸同源性高于核苷酸同源性也提示了AKAV S片段良好的氨基酸遗传稳定性。     

湖北省羊口疮病毒的分离鉴定

利用MDBK传代细胞系对湖北通山县某羊场疑似羊口疮(Orf)的黑山羊病料进行分离,通过病毒理化特性试验、动物回归试验和PCR等方法对分离的毒株进行鉴定。结果表明,病料悬液接种MDBK细胞后出现细胞病变,接种病料的羊只出现典型的Orf症状,扩增出羊口疮病毒(Orf virus)B2L基因,该毒株与台湾山羊株(EU935106.1、DQ904351.1)相似性最高(均为99%),亲缘关系最近。本研究成功分离鉴定到一株ORFV,命名为ORFV/HB/09。     

羊口疮病毒威海株的分离鉴定

利用犊牛睾丸原代细胞对山东省威海市某奶山羊养殖场疑似羊口疮（Orf）山羊病料进行病毒分离,通过细胞病变观察、病毒滴度和聚合酶链反应（PCR）等方法对分离毒株进行鉴定。结果表明,研磨处理的病毒液接种于犊牛睾丸原代细胞后盲传至第5代出现病变,测得第6代分离株病毒滴度为106．5 TCID50／mL。扩增羊口疮病毒特异性 B2L 基因,发现该毒株与34个羊口疮毒株核苷酸序列同源性高达99％,包括福建株（KC588399．1、KC568398．1）。本研究成功分离鉴定了羊口疮病毒山东威海株。     

阿卡斑病毒在云南省哨兵山羊的分离鉴定及其感染回溯分析

为了解云南省山羊中阿卡斑病毒(AKAV)的分子遗传特征及自然感染规律,本研究于2019年在云南省师宗县设立哨兵羊,定期采集血液样品,将核酸检测为AKAV阳性的样品接种BHK-21细胞进行病毒的分离,结果显示,从哨兵羊分离出3株AKAV(V287/YNSZ/2019、V288/YNSZ/2019和V289/YNSZ/2019),分离株可致BHK-21细胞出现圆缩、裂解的细胞病变(CPE)。对分离株经电镜观察可见病毒粒子呈球形,直径在100 nm～130 nm,表面有纤维状突起。通过PCR扩增其S、M与L基因,并测序与序列分析后分别构建S、M与L基因的进化树。结果显示分离的3株AKAV的S、M与L基因序列之间高度同源;系统发育分析结果显示,分离株与中国株亲缘关系最近,与其他亚洲株的亲缘关系次之,与澳大利亚及非洲株的亲缘关系最远;分离株的S及M基因归属于AKAV基因Ia型,L基因则与中国株共同形成"中国支系"。对定期采集的AKAV感染山羊血液中的病毒核酸及抗体进行动态监测,结果显示,AKAV核酸在感染动物血液中仅存在一周,而AKAV特异性抗体则可持续9周以上。本研究首次在中国云南山羊中分离到AKAV,并证实从感染动物血液中分离AKAV的最佳窗口期为病毒感染后的第1周,对有效开展AKAV的分离工作具有一定的指导意义。     

羊口疮病毒的分离与鉴定

本试验利用犊牛睾丸细胞、羔羊睾丸细胞、MDBK、BHK-21细胞对采自内蒙古赤峰的疑似羊口疮发病羊群的唇部痂皮组织进行接种传代,分离出1株病毒,通过透射电镜负染观察和PCR检测对该分离株进行鉴定。参照GenBank中羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059 (F1L)基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的F1L基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行了同源性比对分析,结果显示经透射电镜负染观察到典型的副痘病毒粒子,与参考毒株序列相比均具有较高的同源性,均为96%以上,结果表明该分离株为ORFV,命名为OV/nm-hd。     

牛细小病毒的分离鉴定及在不同细胞中的复制动力学研究

本研究旨在获得牛细小病毒分离株,并对牛细小病毒(BPV)在不同细胞中的复制动力学进行探讨,为牛细小病毒疫苗的开发筛选出合适的病毒株及适宜病毒扩增的细胞株。将96批次牛血清样品分别接种于BT细胞中,盲传3代,逐日观察细胞病变(CPE),对出现典型细胞病变的样品采用直接免疫荧光法检测;分离得到1株牛细小病毒,并且对这株病毒的红细胞凝集特性进行分析。通过将牛细小病毒接种在Vero、BT和MDBK 3种细胞中,筛选出适合牛细小病毒培养用的细胞株。结果,通过对96批次牛血清样品接种于BT细胞进行病毒分离培养,获得4株病毒阳性株,使用直接免疫荧光法检测,获得1株牛细小病毒,进行红细胞凝集试验,这株牛细小病毒能凝集豚鼠、马、人的红细胞,但不能凝集家兔、山羊和鸡的红细胞。这株牛细小病毒在BT细胞中可稳定传代,在MDBK和Vero细胞中盲传3代仍未检测到牛细小病毒。结果表明,通过细胞体外培养法分离得到1株牛细小病毒,可以作为牛细小病毒疫苗制备的病毒株,对这株牛细小病毒在不同细胞中的复制动力学的研究结果表明,BT细胞是最适合培养这株牛细小病毒的细胞,候选细胞株MDBK和Vero细胞不适合这株牛细小病毒的扩大培养。本研究为牛细小病毒疫苗的开发奠定了基础。     

传染性牛鼻气管炎病毒分离鉴定及特性分析

传染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)是牛的重要传染病病原,除能引起呼吸道疾病外,还可引起结膜炎、流产、脑炎和全身性感染。本试验从广东某牛场疑似IBRV感染牛中采取鼻拭子样品,用PCR和荧光PCR方法,初步诊断病牛感染IBRV。用MDBK细胞对初诊阳性病料进行病毒分离和鉴定,分离出1株传染性牛鼻气管炎病毒,命名为GD0109。细胞感染试验表明,该株病毒可以使MDBK细胞产生典型的圆缩、呈葡萄样聚集以及空洞等细胞病变。将GD0109与强毒的ATCCVR-2112TM株感染细胞裂解液分别接种MDBK细胞并盲传5代,对5代、10代、15代的病毒分别进行TCID50测定及中和试验,结果表明分离株和参考株VR-2112TM相似,提示该分离株为强毒株,并且具有良好的传代稳定性,为进一步疫苗生产打下良好的基础。     

牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL株的分离与鉴定

本研究从吉林某牛场表现严重腹泻症状濒死牛的胸腺病料样品中分离一株病毒,该病毒在MDBK细胞中盲传4代无细胞病变产生,而通过RT-PCR和间接免疫荧光试验、微量血清中和试验检测表明该分离病毒株为牛病毒性腹泻病毒(BVDV),并命名为BVDV-JL.将BVDV-JL株F4代细胞培养液(10<'7.13>TCID<,50>/...     

健康猪体内塞尼卡病毒的分离和鉴定

塞尼卡病毒(SVA)属于小核糖RNA病毒科塞尼卡病毒属,可以引起猪的水泡样病变、跛行和新生仔猪突然死亡等。为了解SVA的特性,本研究将从健康猪体内鉴定的SVA阳性样品接种BHK-21细胞分离SVA,采用PCR扩增其VP1基因,并分析其遗传变异特点。结果显示,10份SVA阳性样品中有2份(GXT91和GXT94)能够在BHK-21细胞增殖并产生明显的细胞病变,可达10^7.6TCID50/mL,其VP1基因与SVA参考株NC_011349的核酸同源性为90.2%~90.6%,推导氨基酸同源性为96.7%~97.1%,进化树显示新分离的GXT91和GXT94病毒株属于流行分支II。本研究为SVA的疫苗研制奠定了基础。     

基因2型牛病毒性腹泻病毒新疆及山东分离株的鉴定

将疑似为基因2型牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus genotyp02,BVDV-2)感染阳性的不同地区源病料样品接种马-达氏牛肾细胞(Mardin-Darby bovine Kidney,MDBK)单层细胞,进行病毒分离培养和传代.通过BVDV-2型特异性RT-PCR检测结果表明,共分离到2株细胞源BVDV-2病毒,命名为XJ-04和SD-06分离株.间接免疫荧光试验表明,上述分离的细胞源BVDV-2病毒能被鼠源BVDV-2重组E2蛋白抗血清或鼠抗BVDV-2单克隆抗体特异性识别,产生特异性胞内荧光.XJ-04和SD-06分离株分别盲传至13代和8代,光镜下观察到病毒感染的MDBK细胞内空泡化、细胞脱落、呈现拉网状的典型细胞病变.2株细胞源BVDV-2病毒感染的MDBK细胞制备超薄切片,在透射电镜下,细胞内质网中观察到约60 nm大小的病毒粒子.经差速离心、20%蔗糖垫底超速离心提纯的病毒粒子,经磷钨酸染色,负染电镜下观察到病毒有囊膜、粒子大小约60 nm的病毒颗粒.     

赤羽病病毒Gcaa465～704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465～704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc_aa465～704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc_aa465～704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。     

基因2型牛病毒性腹泻病毒河南株分离鉴定及全基因序列分析

河南某地区牛场部分牛出现呼吸道症状,伴随有怀孕母牛的流产,本研究使用细胞培养的方法于病死牛脾脏中分离得到1株BVDV病毒,命名为BVDV-HEN01。该病毒在MDBK细胞上生长,未发生固缩、拉网等病变,可确定该毒株为1株非致细胞病变毒株;下载若干条BVDV全基因序列,经MegaAlign软件比对在同源性较高的区域设计全基因组扩增引物10对,经鉴定该毒株为BVDV-2型毒株,并扩增出该毒株的全基因组;直接免疫荧光法测得病毒TCID₅₀为10^-4.1/0.1 mL。使用电镜观察病毒颗粒,颗粒的直径为50 nm左右。对分离株进行同源性分析并绘制系统进化树,发现HEN01株与我国SD1301株进化关系密切。本实验所分离的毒株为1株新的BVDV-2b亚型毒株,全基因组序列测定的完成对于反向遗传工程与疫苗的研发有重大意义。     

羊口疮病毒黑龙江省分离株的分离鉴定

为确定黑龙江大庆地区某羊场发生的疑似羊口疮(Orf)的病原,本研究采用MDBK细胞培养途径从病羊的口唇部位的痂皮病料中分离出1株病毒.通过电镜观察和IFA鉴定证明该分离株为Orf病毒,命名为OV/HLJ/04.其F1L基因核苷酸序列测定和进化分析显示,OV/HLJ/04与国内报道的山西株(HQ221964)的遗传关系密切,同源性达到98.2％.将该病毒分离株进行回归本动物试验,接种羔羊发生严重的羊口疮.     

1株猪源牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

从BVDV阳性仔猪病料中分离病毒,为开展猪源BVDV病原学研究奠定基础。将处理后BVDV阳性仔猪组织样品接种MDBK细胞,分离到1株猪源BVDV,命名为SD0803株。通过细胞培养、直接免疫荧光、5′-UTR与Npro PCR扩增、电镜观察、TCID50测定及对其分子进化特征加以分析。结果表明,该毒株在MDBK细胞上盲传至13代未出现细胞病变。在直接免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。PCR扩增分别获得5′-UTR与Npro预期大小DNA片段。电镜观察,病毒粒子略呈圆形,有囊膜,直径约50nm。病毒滴度为10-6.5 TCID50.0.2 mL-1。SD0803 5′-UTR、Npro序列进化分析显示,该分离株属于BVDV-1,与已知BVDV-1各亚型之间同源性较低,单独成一分支。结果表明,成功分离鉴定1株猪源BVDV SD0803,该毒株为非致病变型BVDV-1,极有可能为BVDV-1新的亚型。     

羊传染性脓疱病毒分离及生物学特性研究

用犊牛睾丸细胞及BK细胞,从内蒙古自治区达拉特旗发病的进口小尾寒羊痂块中分离到一株病毒,对其进行连续传代至病变稳定。通过对该分离株进行动物回归试验,在犊牛睾丸细胞及BK细胞中的增殖特性试验、病毒核酸类型鉴定试验、脂溶剂敏感试验及其它生物学特性试验、电镜观察等,初步鉴定该分离株为羊传染性脓疱病毒。     

牛病毒性腹泻病毒XC株的分离与鉴定

将BVDV阳性血清样品接种MDBK细胞,结果分离出1株BVDV。采用MDBK细胞培养法、直接免疫荧光、RT-PCR与TCID_(50)等方法对分离毒株进行鉴定分析。结果表明,分离株在MDBK细胞上盲传至10代均未出现细胞病变;在直接免疫荧光试验中呈阳性;RT-PCR扩增均获得5'-UTR、Npro预期大小DNA片段;分离株滴度为10~(-5.9)TCID_(50)/0.2 mL。进化分析显示,该分离株属于BVDV-1m。以上结果推断,成功分离鉴定1株BVDV,该分离株为非致细胞病变型BVDV-1m,命名为BVDV-1 XC株,为研究致病机理奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒分离及生物学特性研究

用犊牛睾丸细胞及BK细胞，从我国内蒙古自治区达拉特旗发病的进口小尾寒羊痂块中分离到1株病毒，对其进行连续传代至病变稳定。通过对该分离株进行动物回归试验，在犊牛睾丸细胞及BK细胞中的增殖特性试验、病毒核酸类型鉴定试验、脂溶剂敏感试验及其它生物学特性试验、电镜观察等，初步鉴定该分离株为羊传染性脓疱病毒。     

羊口疮病毒感染MDBK细胞的电子显微镜观察

为了研究羊口疮病毒(Orf V)粒子的形态,试验采用透射电镜对Orf V地方分离株感染的体外培养MDBK细胞进行了观察。结果表明:负染痂皮病料悬液的病毒粒子呈卵圆形线团样,表面呈绳索样缠绕结构,大小为150~200 nm×230~270 nm,病毒粒子外有双层被膜包裹;OrfV地方分离株感染MDBK细胞在48 h后可见细胞变圆、聚集、融合、拉网甚至脱落的细胞病变(CPE);超薄切片可见病毒粒子存在于细胞浆内,多呈椭圆形或卵圆形,获得囊膜成熟病毒粒子和未成熟病毒粒子的表面均呈现两种形态,即表面呈绳索样的病毒粒子和表面无绳索样的病毒粒子;细胞超微结构变化主要表现为细胞表面的微绒毛脱落,细胞浆空泡增多,内质网扩张呈囊状。说明OrfV能够在MDBK细胞内增殖。     

河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定

从河南省不同地区规模化肉牛场牛病毒性腹泻(BVD)疑似病例中采集病料,将处理好的6份病料接种MDBK细胞,并盲传4代,得到了两株可产生细胞病变的病毒,经测定该两株病毒的TCID50分别为10-6.59/0.1ml和10-6.51/0.1ml;琼脂扩散试验表明该两株病毒均能与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)OregonC24标准阳性血清反应,出现沉淀线,且均能被BVDV标准阳性血清中和;电镜观察到圆形、有囊膜、直径为40～60nm、囊膜表面有突起的病毒粒子,与BVDV颗粒基本一致。动物回归试验表明,用两株分离毒攻毒的2头3月龄犊牛均出现了和BVD自然病例相似的临床症状,并检测其抗原和抗体,结果均为阳性,从而确定分离的两株病毒均为BVDV,分别将其命名为HN-1和HN-2株。     

牛病毒性腹泻病毒LN-1株的分离鉴定及基因组序列分析

【目的】查明并掌握辽宁地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的流行特性及生物学特点,为BVDV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】采集辽宁省某养牛场疑似发生BVDV感染的病死牛脾脏组织,用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)及BVDV基因特异性引物进行RT-PCR鉴定,将组织液接种MDBK细胞分离病毒。对细胞进行细胞病变效应(CPE)观察后再通过电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定病毒,PCR扩增病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】BVDV特异性引物RT-PCR鉴定结果为阳性,在280 bp处有条带,与预期条带大小相符,其余病原特异性引物未扩增出条带,证明未感染其他病原;分离得到的毒株在MDBK细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒纯化后,...