貉细小病毒SD1607株的分离鉴定及VP 2基因序列分析

从疑似患细小病毒性肠炎的貉子肠道组织样品中分离到一株貉细小病毒(RDPV-SD1607)。为研究其分子遗传特征,对该分离株VP2基因进行克隆序列分析,结果显示,RDPV-SD1607的VP2序列与RDPV-HB3的相似性最高,为99.49%,属于CPV-2亚型;利用其核苷酸序列建立系统进化树发现,RDPV-SD1607处于犬细小病毒分支,且处于CPV-2亚型和CPV-2a亚型分支之间。结果表明,RDPV-SD1607株与犬细小具有共同的遗传起源,推测其可能正处于CPV-2亚型向CPV-2a亚型进化的中间状态,或是CPV适应貉而形成的新毒株。     

貉细小病毒分离鉴定及其VP2基因序列分析

本研究从山东省某貉养殖场发病貉粪便样品中分离到一株貉细小病毒(raccoon dog parvovirus,RDPV)。为了解该毒株的特性及其致病特点,对发病貉粪便处理后接种F81细胞,收获病毒液进行VP2基因序列分析、理化特性研究以及貉人工感染试验。结果显示:该分离株与RDPV参考株核苷酸同源性高达99.4%,属于犬细小病毒2型(CPV-2);对氯仿等不敏感,耐酸耐热,符合细小病毒特征;分离毒株对貉具有较强的致病力。结果表明,山东省仍存在RDPV流行且致病性有增强风险,须针对性研发RDPV疫苗,加强对RDPV流行的控制。本试验为RDPV流行病学研究提供了数据支持。     

貉细小病毒LN10-1株分离鉴定及其免疫原性研究

为研制貉细小病毒性肠炎疫苗,筛选出针对貉细小病毒性肠炎免疫原性好、安全高效的疫苗备选株,应用CRFK细胞从辽宁省发病貉的粪便中分离病毒,并通过形态学、血清学、分子生物学、动物回归及免疫接种等方法对分离株进行鉴定。鉴定结果表明成功分离出1株貉细小病毒,命名为LN10-1株。其VP2基因核苷酸序列与猕猴源猫泛白细胞综合征病毒株(BJ-22/2008/CHN株)相似性高达99.7%。VP2蛋白上决定宿主范围的2个氨基酸位点发生了突变。VP2基因种系发生分析显示,LN10-1株位于猫泛白细胞综合征病毒(Feline panleukopenia virus,FPLV)、蓝狐细小病毒(Blue fox parvovirus,BFPV)、水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)组成的食肉类动物细小病毒聚类分支与由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)组成的聚类分支。由LN10-1株制备的灭活疫苗免疫结果显示,接种28d细小病毒中和抗体滴度可达到1∶256以上。推测LN10-1株可能正处于FPLV与CPV进化的中间状态,或是CPV适应新宿主(貉)而形成的一种新病毒,可以作为针对貉细小病毒性肠炎灭活疫苗的候选株。     

一株貉源犬细小病毒CPV-CL01株的分离鉴定

为了探究河北某貉养殖场引起貉肠炎的病原,以便采取针对性防控措施,解决当前貉肠炎发病率高、死亡率高的问题.本研究对采集的病料进行了常规处理,离心取上清液,采用血凝试验、细胞接种、传代培养、分离毒PCR鉴定、序列分析、动物回归等方法进行试验研究,结果表明,貉肠炎病料上清液有血凝性,血凝值为1∶128,接种猫肾细胞(F81细...     

犬细小病毒北京分离株的鉴定及其全基因组序列分析

首先对疑似犬细小病毒(CPV)感染的病犬粪便进行特异性PCR扩增,经目的片段测序分析,初步证明为CPV感染。将该病犬粪便处理物接种F81细胞,自第3代起,细胞出现典型CPE。对该株病毒进行电镜观察、理化特性试验、HA-HI及基因型等方面鉴定,证明该分离株为CPV,命名为CPV/BJ-L1株。该分离株的血凝效价为1∶512,其血凝性能被特异性抗体抑制;Reed-Muench法测定分离株病毒TCID_(50)为10-5.15/0.1 mL;电镜观察可见25nm左右的病毒颗粒;动物回归试验显示,攻毒犬能复制出CPV的典型临床症状和病理变化;对分离株的全基因组(包含两端完整的发夹结构序列)进行克隆、测序与分析。结果表明,BJ-L1为CPV-2a亚型,与GenBank中的21株CPV全基因序列核苷酸同源性为98.8%~99.8%,且与国内近期分离毒株高度同源。对2006-2014年北京市CPV分离株VP2基因进行序列分析,结果显示,CPV流行株的变异具有某种时间相关性。     

犬细小病毒JL-M13株的分离鉴定及全基因组序列分析

将检测为犬细小病毒(CPV)阳性的病料经处理后接种F81细胞盲传3代并获得一株细小病毒,命名为JL-M13。应用重叠PCR技术从JL-M13中扩增出5条核苷酸序列,拼接后进行序列分析。结果表明,所获病毒核酸基因组大小为4 621bp,与其他犬细小病毒的基因相似性为98.2%~99.4%。系统发育树分析表明,JL-M13与CPV-2毒株(EF011664.1)相似率最高,与Type-2型犬细小病毒疫苗株相距较远。     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

竹鼠源细小病毒分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】了解并掌握广西地区竹鼠细小病毒(Bamboo rat parvovirus, BRPV)的生物学特性及遗传变异情况,为BRPV的防控提供理论依据和技术支撑。【方法】用养殖场患病死亡的竹鼠病料制备组织上清液,采用Vero细胞同步接毒法进行病毒分离,通过细胞病变观察、PCR、透射电镜观察及血凝试验等方法鉴定,设计合成特异性扩增引物对BRPV全基因组序列进行测序分析。【结果】分离获得的病毒可在Vero细胞上稳定生长增殖,感染细胞变长、变梭或成拉丝状;病毒纯化后经电镜观察可见呈立体对称、无囊膜、直径20～25 nm的病毒粒子;经PCR鉴定、凝集试验及全基因组测序表明,分离株为BRPV。本研究共获得3株BRPV(GenBank登录号：MF497824、MF497825、MF497826),毒株基因组全长约4 758 bp,全基因组序列比对发现,其与蝙蝠源细小病毒关系较近。BRPV基因编码氨基酸遗传特征与其宿主特异性有很强的相关性,NS1基因编码氨基酸变异与蝙蝠及大鼠源细小病毒更接近,与其处于同一分支,核苷酸相似性为96.9%～97.6%,氨基酸相似性为97.5%～98.4%。其中第257...     

犬细小病毒CPV-QD12株的分离鉴定与序列分析

本试验成功分离了1株犬细小病毒,采用PCR、理化特性检验、HA及HI等方法对其进行了鉴定,并对其编码区全基因序列进行了分析。取临床患出血性肠炎幼犬粪便经无菌处理后同步接种F81猫肾细胞分离病毒,盲传至第4代开始出现典型的细胞病变。该病毒可凝集猪的红细胞,血凝效价为28,可被犬细小病毒单克隆抗体特异性中和而产生血凝抑制现象;病毒效价为105.5TCID50/m L;毒株对氯仿和胰酶不敏感,且耐酸耐热。经病毒理化特性试验及犬细小病毒单克隆抗体的血凝抑制鉴定其为犬细小病毒,通过PCR检测及编码区全基因的扩增、测序和序列比较,证实所分离毒株为CPV-2a亚型,并将其命名为CPV-QD12株,与2013年分离自中国江苏省的CPV-2a型犬细小毒株CPV-JS2及2011年分离自中国广西的CPV-2a型毒株CPV-JQ686671.1的编码区核苷酸相似性为99.6%,具有较近的亲缘关系。该研究可为诊断和防控犬细小病毒病提供参考。     

犬细小病毒山东流行株分离鉴定及其全基因组测序分析

为了解山东地区犬细小病毒的流行及其变异情况,应用F81细胞从山东地区送检的发病犬粪便中分离出4株细小病毒,根据PCR和电镜技术对其进行鉴定,并对分离株的全基因组进行克隆测序与序列分析。结果表明:所分离到的4株病毒均能在F81细胞上产生明显的细胞病变,经PCR及电镜观察鉴定为犬细小病毒,分别命名为QN1/QN2/QN3/QN4株。全基因组分析结果显示,除QN3株的基因组全长为4 756 nt外,其余3株均为4 757 nt;4个分离株之间全序列核苷酸同源性为99.31%,与GenBank登录的10株具有代表性的CPV核苷酸序列比对,同源性为98.2%⁹9.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%99.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%⁹9.9%,氨基酸序列同源性为98.1%99.9%,氨基酸序列同源性为98.1%¹00%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,同属于NewCPV-2a亚型。     

犬细小病毒宁夏株的分离与鉴定

本试验采集宁夏地区疑似犬细小病毒感染病犬的粪便拭子,经过预处理后同步接种胎猫肾细胞(FK81),盲传3代后发现FK81细胞出现明显的细胞毒性改变(CPE)。冻融收获病毒后,对分离出来的病毒进行电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)检测、特异性PCR鉴定及VP2全基因序列扩增分析,成功分离培养出1株犬细小病毒(CPV)。     

猪细小病毒SY-99株VP2基因的序列分析

克隆并测定猪细小病毒SY－99株VP2基因，与NADL－2（4973）株、NADL－2（5075）株、Kresse株和US－1株VP2基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较与分析，发现PPV SY－99株与Kresse株VP2基因核苷酸和氨基酸同一性最高，推测SY－99株可能为一强毒株。     

果子狸源细小病毒分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

【目的】探究果子狸源细小病毒流行特点及其VP2基因遗传变异情况,为细小病毒防治提供理论依据和技术支撑。【方法】采用猫肾细胞(CRFK细胞)对患有肠炎的果子狸肠道组织样品进行病毒分离,通过血凝试验、免疫荧光试验鉴定分离的病毒,并对病毒VP2基因进行PCR扩增和遗传进化分析。【结果】分离到的毒株在CRFK细胞中培养出现细胞脱落、崩解和破碎等典型细小病毒细胞病变效应(CPE);血凝试验结果显示,此病毒可凝集猪红细胞,血凝效价为1∶512;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的CRFK细胞内可观察到亮绿色荧光,而对照细胞没有荧光。将分离毒株命名为MPCPV-SX。VP2基因进化树分析发现,其与犬细小病毒处于同一分支,位于CPV-2和CPV-2a型之间,同时VP2氨基酸的87和101位显示为CPV-2型,而300和305位氨基酸则与CPV-2a型一致。【结论】本研究成功从果子狸肠道组织样品中分离出1株细小病毒MPCPV-SX,其VP2基因是介于CPV-2和CPV-2a之间的中间型,表明细小病毒通过果子狸等野生动物跨越宿主流行传播,可能在细小病毒遗传进化方面起到一定的过渡作用。     

一株犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析

采集病犬的粪便,经处理后接种狗肾传代细胞系（MDCK）,培养96h无任何细胞病变,盲传到第3代时细胞系出现明显的细胞脱落,核圆缩,形成CPE（cytopathic effect）。继续传代到第7代。第1、2代的细胞培养物不能凝集猪的红细胞,第3代以后的细胞培养物可以凝集猪的红细胞。采用PCR技术,在各代次的培养物中均能扩增得到特异性的DNA片断,经序列测定后鉴定为犬细小病毒,定名为BJY06。为进一步研究该分离株的遗传演化情况,扩增得到了VP2基因的全序列。经序列测定,用DANStar软件分析表明BJY06毒株为CPV-2a亚型,所得到的VP2基因全长1755bp,含有完整的阅读框架,编码584个氨基酸。与其它亚型的毒株相比较核苷酸的同源性为98.3%～99.6%。氨基酸同源性为97.1%～100%。     

狮源猫细小病毒分离鉴定及其VP2基因序列分析

为对疑似感染猫细小病毒的非洲狮进行确诊,了解猫细小病毒的流行特点,通过猫肾细胞（F81细胞）对非洲狮粪便样品进行病毒分离并通过PCR鉴定,对检测到的细小病毒进行VP2基因扩增和分析。结果显示：成功从非洲狮粪便中分离出1株细小病毒,将其命名为FPV CHN-HN-1。该病毒接种到F81细胞上,能使细胞出现拉丝、脱落现象。该分离株与参考的26株细小病毒分离株相似性为97.8%~100%,其中与分离株JN-FPV-96（MZ836373.1）、TZ-FPV-112（MZ836368.1）、FPV-SH2003（MW811187.1）和BJ051（MT270580.1）相似性高达100%;与其他7株猫源细小病毒同属一个分支,与JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPV-SH2003、BJ051遗传距离最近,与其他参考毒株遗传距离较远。本研究为细小病毒病的诊断和治疗提供了依据,也为后期疫苗的研制打下了基础。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因克隆及变异分析

对北京昌平地区分离的9株犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)进行VP2基因克隆测序,并利用生物信息学软件,将克隆的VP2基因与GenBank公布的国内外部分毒株序列相比较,绘制系统进化树,分析9株CPV VP2蛋白亲水性和抗原指数.结果表明,分离毒株与参考毒株核苷酸和氨基酸同源率在97%以上.通过序列比对与分析,确定其中有8株为New CPV-2a,1株为CPV-2,表明该地区目前主要以New CPV-2a流行为主.9株分离株在进化树上都能找到亲缘关系较近的毒株,没有形成新的分支.9株VP2蛋白亲水性高的区域抗原指数相应就高,不同株之间总体差别很小,主峰相同.     

犬细小病毒DD株的分离鉴定和VP2基因序列分析

本实验室对从疑似犬细小病毒感染的发病犬分离的病毒采用同步培养法接种猫肾细胞（CRFK）增殖,通过PCR试验、IFA试验和VP2基因测序分析等方法进行鉴定并分型,获得一株犬细小病毒强毒株,命名为CPV-DD株。对分离病毒进行PCR扩增,可扩增出特异性DNA片段（1 163 bp）;盲传至第6代时,病毒液的HA效价为1∶1...     

犬细小病毒昆明流行株的分离鉴定与VP2基因序列分析

为了解昆明市犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)流行及抗原变异情况,有针对性地筛选疫苗及研发新疫苗,本研究从昆明市部分宠物医院收集6份疑似CPV粪便样品进行病毒分离培养,对获得的疑似病毒液进行PCR、免疫荧光试验(IFA)、血凝效价测定、TCID50测定及VP2基因序列分析。结果显示,分离的1株病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变(CPE),PCR扩增产物大小为164bp,IFA鉴定感染的F81细胞出现绿色荧光,血凝效价为1∶512,病毒TCID50为10-4.375/0.1mL,VP2基因PCR扩增条带大小为1 755bp。对分离株VP2结构蛋白进行测序分析,判定该分离株为CPV-2a亚型,与标准毒株存在5个变异氨基酸位点,属于变异株。将测序结果与商品化疫苗株及国内参考株序列进行比对分析,结果显示与弱毒苗Intervet/vaccine/06和Pfizer/vaccine/06核苷酸同源性均为98.7%;与国内参考毒株序列同源性为98.2%～99.5%,与ANTU-1和WH02/06株同源性最高;与ANTU-1株、WH02/06株及BJ01株亲缘关系最近,位于进化树的同一簇。本研究对监测CPV的遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。     

鹅细小病毒吉林株的分离鉴定及其全基因序列分析

从患病鹅的病料中分离鉴定了2株鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV),命名为CH株和LS株。参考NCBI中多株GPV全基因序列,分段设计5对引物,对分离株的全基因序列进行PCR扩增、测序、拼接,并使用生物学软件对全基因序列进行比对和分析。遗传进化分析显示,CH株与LS株处于同一分支且相邻,表明具有较近的亲缘关系。由此推测,两株病毒可能起源于同一原始毒株。