新疆青格达湖湿地鸟类中H5、H7亚型AIV和NDV流行病学监测

为了解新疆青格达湖湿地野鸟携带禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)情况,对青格达湖湿地鸟类进行了血样和喉肛棉拭子、组织、粪便样品采集。采用RT-PCR试验对喉肛棉拭子、组织、粪便样品进行了病原学检测,采用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验进行禽流感和新城疫血清抗体的检测,结果均为阴性。结果表明:所检测的样品并未携带AIV(H5、H7亚型)和NDV。     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

H5亚型禽流感病毒荧光检测试纸条的研制

为了对引起家禽重大经济损失和具有公共卫生意义的H5亚型禽流感病毒(AIV)进行快速超敏检测,本研究研制了针对HA蛋白的4株单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株,通过MAb的两两配对试验,以荧光量子点作为抗体标记生物材料,基于夹心法原理建立了H5亚型AIV荧光免疫层析检测试纸条。结果显示,该方法能够特异性检测出H5N1、H5N2等H5亚型AIV,而与H1N1、H3N2、H7N9、H9N2、NDV等其他病原无交叉反应;对标准检测抗原H5N1(Re-6)的最低检测量为1 ng/mL,比市售H5亚型AIV胶体金检测试纸条灵敏度高100倍;该方法的变异系数(CV)值在10%以内,与商品化的试剂盒检测结果符合率达99.8%。本文建立的H5亚型AIV荧光检测试纸条快速、敏感,检测结果准确可靠,为H5亚型禽流感的流行病学调查和快速诊断提供了基础。     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

引起鸡支气管阻塞的病毒类病原调查研究

为探寻可能引发鸡支气管阻塞的病毒类病原,试验采用RT-PCR方法检测了自河北及周边地区收集的43份有支气管阻塞病料样品中H5亚型禽流感病毒(AIV)、H7亚型AIV、H9亚型AIV、传染性支气管炎病毒(IBV)和新城疫病毒(NDV)等病毒类病原感染情况。结果显示,阳性样品共24份,总阳性率为55.8%(24/43),其中H9亚型AIV、IBV、H5亚型AIV、H7亚型AIV、NDV的阳性率分别为34.9%(15/43)、20.9%(9/43)、0(0/43)、0(0/43)、0(0/43),不存在H9亚型AIV和IBV的混合感染;自检测阳性样品中分离、鉴定了5株H9N2 AIV,HA蛋白裂解位点模式均为PSRSSR↓GLF,属于低致病性毒株,位于h9.4.2.5分支,3株分离毒株HA蛋白关键氨基酸位点模式与疫苗毒株WJ57完全一致,但5株分离毒株NA蛋白关键氨基酸位点模式与疫苗毒株WJ57不完全一致;自检测阳性样品分离、鉴定了4株IBV,S1蛋白裂解位点模式包括HRHRR和HRRRR,属于LX4型,均与疫苗毒株YX10 D90亲缘关系较近,与疫苗毒株Connecticut和H120亲缘...     

H3亚型禽流感病毒血凝素特异性单克隆抗体的制备

以H3亚型禽流感病毒(AIV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验(HI)筛选阳性杂交瘤细胞并克隆化。结果获得了4株针对H3亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,分别命名为1D7、1F9、5A4、5F5。这些单克隆抗体小鼠腹水HI效价为212～214。用H1、H6、H10亚型禽流感病毒各2株,H4、H5、H9和新城疫病毒(NDV)各1株进行特异性试验。结果表明:所有这些单抗仅与H3亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他亚型AIV及NDV反应。用28株H3亚型禽流感病毒进行排谱试验,结果证明:4株单抗均具有广谱性,其中1F9、5A4、5F5与受试的28株H3亚型AIV均反应,而1D7只与其中的26株反应。以上单抗将为控制畜禽及人类的流感提供必需的诊断试剂。     

表达分泌型与膜结合型HH7N9 AIV血凝素蛋白重组NDV载体疫苗的免疫原性比较

研究以新城疫病毒(NDV)弱毒株LX为载体,构建了一株表达H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)血凝素(HA)胞外区的重组病毒(LXs HA),并与一株前期构建的表达膜结合型HA的重组病毒(LXHAF)进行比较。生物学特性评价显示,两株病毒均为弱毒且在鸡胚中的繁殖性能较强。此外,LXs HA主要以分泌形式表达HA蛋白,而LXHAF则以膜结合形式表达HA。鸡的免疫试验显示,两株重组病毒在一次免疫后均能诱导针对NDV载体的血凝抑制抗体,但LXHAF能够诱导较高水平的H7N9 AIV特异性Ig Y抗体,而LXs HA不能诱导H7N9 AIV抗体应答。结果表明,表达膜结合型HA的重组病毒具有针对H7N9 AIV较好的免疫原性,而表达分泌型HA的重组病毒免疫原性较差。这为研发H7N9亚型禽流感载体疫苗提供新的信息与参考。     

Dot-ELISA检测H9亚型禽流感病毒的研究

本研究采用兔抗H9亚型禽流感病毒（AIV）IgG包被于硝酸纤维素膜,酶标羊抗兔IgG作二抗,建立检测H9亚型AIV的Dot-ELISA法。经方阵试验确定兔抗AIV IgG工作浓度为1∶400,酶标羊抗兔IgG的工作浓度为1∶400。作者建立的Dot-ELISA对AIV的最小检测量为3.35×10-9g。Dot-ELISA与HA和HI、AGP及病毒分离法相比,检测63份临床疑似H9亚型AIV病料,Dot-ELISA检出32份(57.14%),HA和HI检出15份(23.81%),AGP检出11份(17.46%),病毒分离检出38份(60.30%)。用抗H9亚型AIV阳性血清可以阻断Dot-ELISA阳性反应,诊断膜片与鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合征病毒不出现阳性反应,证明Dot-ELISA特异性好。分别置室温(25 ℃左右)、4 ℃和-20 ℃下保存1个月后,膜片诊断效果不变,对照反应均成立,该方法重复性好（重复符合率为93.9%）,操作简便（3 h内可完成）,不需要特殊检测仪器,结果客观,肉眼易于判断,是微生物和传染病及寄生虫病诊断标准化的新技术之一。     

抗H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定

利用纯化的H9N2亚型禽流感尿囊液病毒免疫原免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法检测培养上清是否对H5N1亚型AIV及NDV反应,筛选只针对H9N2亚型AIV的阳性细胞株,经克隆获得1株较高亲和力的杂交瘤细胞株,命名为4E7,用其制备的腹水ELISA效价达到2×105,Western-blotting证明单抗4E7经鉴定为针对75KD血凝素的单抗,HI效价为1:27,且不与新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、传染性脑脊髓炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H5N1亚型禽流感病毒发生交叉反应,具有较好的特异性。IgG亚型为IgG1。     

嵌合NDV-HA病毒样颗粒的制备与鉴定

新城疫和禽流感是严重危害养禽业的两大动物疫病,其中基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)仍是当前的主要优势流行株。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒结构蛋白装配而成的空心颗粒,不携带核酸,具有良好的安全性和免疫原性。本试验将AIV HA胞外域与NDV F基因胞内、跨膜域融合构建FcH9融合序列;进一步通过利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有FcH9序列的重组杆状病毒rBV-FcH9,与实验室已构建rBV-M和rBV-HN共感染Sf9细胞,收集感染细胞上清,经蔗糖密度梯度离心法纯化嵌合VLPs。血凝血抑试验结果显示嵌合VLPs中HN和HA效价均为28;Western blot分析表明该VLPs可以与特异性阳性血清发生反应;透射电镜观察该VLPs具有典型的病毒粒子结构正,形态大小与野生型NDV相似。结果表明:本试验成功制备了包含有HN和HA蛋白的嵌合VLPs,为研制新型NDV-AIV二联疫苗候选株奠定基础,并为当前新城疫与H9N2亚型禽流感的防控提供策略。     

新城疫-禽流感(HH9N2亚型)二联灭活疫苗免疫效果评估

为筛选适合父母代种鸡场的新城疫(ND)-禽流感(H9N2 AI)二联灭活疫苗(以下简称"新流"),研究选择A、B、C、D、E、F 6个公司的"新流"产品,分别在7、21日龄对SPF鸡进行两次颈部皮下免疫。免疫后定期采集血清,通过血凝与血凝抑制试验(HI)集中检测H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)和新城疫病毒(NDV)抗体,绘制HI抗体曲线。免疫后48 d用106EID50H9N2AIV攻毒,定期采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况。结果表明:两次免疫"新流"产品后,H9N2AIV和NDV抗体效价在46日龄达到最高峰,在49日龄开始下降。攻毒后,免疫C和D公司"新流"的SPF鸡H9N2 AIV排毒时间最短。研究结果为鸡场选择疫苗提供了科学依据。     

新城疫-禽流感(H9N2亚型)二联灭活疫苗免疫效果评估

为筛选适合父母代种鸡场的新城疫(ND)-禽流感(H9N2 AI)二联灭活疫苗(以下简称"新流"),研究选择A、B、C、D、E、F 6个公司的"新流"产品,分别在7、21日龄对SPF鸡进行两次颈部皮下免疫。免疫后定期采集血清,通过血凝与血凝抑制试验(HI)集中检测H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)和新城疫病毒(NDV)抗体,绘制HI抗体曲线。免疫后48 d用106EID50H9N2AIV攻毒,定期采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况。结果表明:两次免疫"新流"产品后,H9N2AIV和NDV抗体效价在46日龄达到最高峰,在49日龄开始下降。攻毒后,免疫C和D公司"新流"的SPF鸡H9N2 AIV排毒时间最短。研究结果为鸡场选择疫苗提供了科学依据。     

北美H7亚型禽流感病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

H7N9亚型禽流感病毒(AIV)对家禽养殖业和公共卫生的持续威胁提示我们应加强对H7亚型流感病毒的监测。根据血凝素(HA)基因的分子遗传进化特点,H7亚型AIV分为欧亚和北美两个进化分支,我国自然分离到的H7亚型AIV均属于欧亚分支,但是目前我国尚未检测到北美H7亚型AIV。本研究通过分析NCBI数据库中H7亚型AIV HA基因序列,设计特异性引物,建立了针对北美H7亚型AIV HA基因的实时荧光定量PCR检测方法。该方法仅针对北美分支H7亚型AIV HA基因出现特异性扩增曲线,不能检出欧亚分支H7亚型AIV、其他亚型(H3、H5和H9)流感病毒以及新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;检测方法的灵敏度可达53 Copies/μL。该检测方法的建立为监测北美H7亚型AIV提供了良好的技术支撑,可用于外来AIV的监测。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白重组新城疫病毒的构建以及密码子优化的HA免疫增强作用

为构建表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白重组新城疫病毒(NDV)及比较密码子优化的HA免疫增强作用,本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,分别构建了表达野毒型H5N1亚型AIV HA蛋白和密码子优化的HA蛋白的重组NDV,并分别命名为rL-H5HA和rL-optiH5HA。对拯救的重组病毒进行RT-PCR、间接免疫荧光和western blot鉴定,结果表明,两种重组病毒均可以在BHK-21细胞中以及鸡胚成纤维细胞稳定地表达HA蛋白。此外,rL-optiH5HA在体外增殖能力及在体内刺激产生抗体均显著高于rL-H5HA。本研究表明,密码子优化的HA重组NDV具有明显的免疫增强作用。本研究为研制安全、有效的新型禽流感疫苗提供了实验依据。     

H5、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒的多重RT-PCR检测

根据Genbank注册发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因和新城疫病毒(NDV)的HA基因序列,设计多对引物,每种病毒各筛选出一对特异性好、灵敏度高的引物,其中FP1/FP2扩增H5亚型AIVHA基因片断长为545bp;P3/P4扩增H9亚型AIVHA基因片断长为321bp;P11/P22扩增NDVHA基因片断长为672bp。用RT-PCR方法,通过特异性试验、灵敏度试验,H5、H9亚型AIV和NDV引物的灵敏度分别达到了1:104、1:108、1:104稀释度,与传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性喉气管炎(ILTV)、传染性鼻炎(IC)、霉形体(MS)、H1N1猪流感等抗原无交叉反应。实验结果表明,本研究建立了检测H5、H9亚型AIV和NDV的多重RT-PCR方法,混合引物的最佳退火温度为50℃,鉴定检测仅需4小时。     

新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗对不同日龄雏鸡的免疫效力研究

为评估新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗的免疫效力,采用该疫苗分别免疫7、14、21日龄的SPF雏鸡和商品雏鸡,免疫后21 d采血测定新城疫病毒(NDV)HI、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)HI及禽腺病毒(FAdV)中和抗体,并用禽腺病毒(Ⅰ群,4型)强毒攻击。结果显示:免疫后各不同日龄免疫组SPF雏鸡的NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为8.2 log_2～8.5 log_2、8.8 log_2～9.6 log_2和9.7 log_2～10.3 log_2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10);21日龄SPF鸡免疫后3个月,试验鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体分别达7.2 log_2、7.8 log_2和11.3 log_2,FAdV攻毒保护率均为100%(10/10);不同日龄免疫组普通雏鸡NDV HI、H9 AIV HI及FAdV中和抗体效价分别为6.7 log_2～7.6 log_2、7.9 log_2～8.7 log_2和9.8 log_2～10.3 log_2,FAdV攻毒保护率均达到100%(10/10)。表明该疫苗可对不同日龄SPF雏鸡和商品雏鸡产生良好的免疫力,对雏鸡免疫持续期达3个月。     

HA蛋白S227N突变对H7N9亚型禽流感病毒生物学特性与疫苗免疫原性的影响

某些种类H7N9亚型禽流感疫苗诱导的血凝抑制(HI)抗体较低,可能与诊断抗原受体结合特性和HI试验的敏感性有关.本研究主要评价H7N9亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白受体结合区第227位丝氨酸(S)到天冬氨酰(N)的突变对病毒复制、受体结合特性与免疫原性的影响.结果显示,S227N突变对H7N9亚型AIV的复制性能无明...     

新城疫病毒和禽流感病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的制备

为了建立一种简便、快速而且能同时检测新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)的方法,本试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,分别标记NDV单克隆抗体6C4和AIV单克隆抗体制备免疫检测探针。在硝酸纤维素膜上,用微定量喷头喷好2条病毒检测线(T线)和1条羊抗鼠抗体质控线(C线),制备复合型免疫层析检测试纸条。结果在10 min内,可同时检测出两种病毒。试纸条检测NDV的灵敏度比HA试验结果提高8倍;AIV重组抗原的检测灵敏度为1.7μg/mL。两种病毒互相测试,未出现交叉反应。用缓冲液对照测试结果为阴性。在密封、干燥、低温的条件下,试纸条的灵敏性与特异性没有明显变化。说明本研究建立的NDV和AIV免疫层析检测法具有特异、灵敏、稳定、操作简单等特点,符合现场快速检测的要求。     

我国H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白145和153位抗原位点变异分析

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)易发生抗原漂移,但识别我国H9N2亚型AIV流行株抗原差异性的关键抗原位点还不清楚.选取两株血凝抑制(HI)效价高的H9N2亚型AIV单克隆抗体2E4与2D6对A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)毒株施加抗体压力制备单抗逃逸突变株,鉴定抗原位点...     

鲁北地区商品肉鸭AIV和NDV抗体效价的检测与分析

为了解鲁北地区商品肉鸭中禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的母源抗体、免疫抗体消长规律,分析在养殖过程中潜在的疫病风险,选择了三个规模化鸭场,分别采集了不同日龄鸭的血液样品,通过血凝试验和血凝抑制试验检测了AIV H5亚型(Re-6,Re-8)、H9亚型、H7亚型和NDV的抗体情况。结果表明:三个鸭场的AIV H5亚型和NDV抗体效价均处于较高水平,说明AIV H5免疫后的抗体能够产生有效保护,AIV H9亚型母源抗体在肉鸭12日龄左右消失,存在被感染的隐患;仅有两份血清样品检测到AIV H7亚型抗体效价,其余都为0;NDV在鸭群中存在不同程度的隐性感染。建议做好对AIV和NDV的抗体监测工作,并为防控相关疾病做好技术与产品储备。