传染性法氏囊病毒VP2蛋白嵌合新城疫病毒样颗粒的构建和鉴定

将传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)强毒株的保护性蛋白VP2替换新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白胞外域部分,利用杆状病毒表达系统,构建了含有IBDV候选抗原表位VP2蛋白的重组杆状病毒rBV-VP2,并通过间接免疫荧光试验鉴定杆状病毒蛋白表达正确。rBV-VP2与NDV-HN、NDV-F、NDV-M组装成病毒样颗粒(cVLPs),形成含有IBDV候选抗原表位的IBD-ND二联病毒样颗粒(IBD-ND cVLPs),利用Western blot鉴定cVLPs各组分蛋白,证明IBD-ND cVLPs各组分组装正确。IBD-ND cVLPs的构建可为我国养禽业提供一种绿色、安全且可一针多防的IBD-ND二联病毒样颗粒疫苗候选株。     

新城疫与H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒的构建与鉴定

为了构建新城疫与H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒(cVLP),试验以目前流行的基因Ⅶ型新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒为研究对象,通过昆虫杆状病毒表达系统构建了3种重组杆状病毒,分别为rBV-M、rBV-HN及r BV-FHA,并以适当比例感染悬浮昆虫Sf9细胞,经蔗糖密度梯度纯化后获得嵌合型病毒样颗粒,同时采用新城疫和H9亚型禽流感标准阳性血清对嵌合型病毒样颗粒进行血凝和血凝抑制试验。结果表明:嵌合型病毒样颗粒以新城疫病毒M蛋白作为颗粒骨架,插入了新城疫病毒HN蛋白和经F蛋白胞内域融合的禽流感病毒HA蛋白,在电镜下观察纯化的嵌合型病毒样颗粒具有完整的囊膜结构及纤突,该颗粒具有结合两种阳性血清的能力。说明试验成功构建了包含有新城疫病毒M蛋白、HN蛋白和H9亚型禽流感病毒HA蛋白的嵌合型病毒样颗粒,并且保留了良好的生物学活性。     

新城疫病毒样颗粒疫苗研究进展

病毒样颗粒是指利用异源宿主系统表达的病毒,结构蛋白自行组装成不含病毒基因组、不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒。病毒样颗粒具备构象逼真、安全、稳定、可刺激体液和细胞免疫应答、作为载体表达其他抗原以及可设计成区分自然感染与免疫接种等诸多优点。有研究表明,新城疫病毒样颗粒可用来研制针对新城疫流行变异株的高效疫苗。作者就新城疫病毒样颗粒相关研究进展进行较为详尽的综述,以期为中国新城疫病毒样颗粒疫苗的研究提供参考。     

嵌合NDV-HA病毒样颗粒的制备与鉴定

新城疫和禽流感是严重危害养禽业的两大动物疫病,其中基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)仍是当前的主要优势流行株。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒结构蛋白装配而成的空心颗粒,不携带核酸,具有良好的安全性和免疫原性。本试验将AIV HA胞外域与NDV F基因胞内、跨膜域融合构建FcH9融合序列;进一步通过利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有FcH9序列的重组杆状病毒rBV-FcH9,与实验室已构建rBV-M和rBV-HN共感染Sf9细胞,收集感染细胞上清,经蔗糖密度梯度离心法纯化嵌合VLPs。血凝血抑试验结果显示嵌合VLPs中HN和HA效价均为28;Western blot分析表明该VLPs可以与特异性阳性血清发生反应;透射电镜观察该VLPs具有典型的病毒粒子结构正,形态大小与野生型NDV相似。结果表明:本试验成功制备了包含有HN和HA蛋白的嵌合VLPs,为研制新型NDV-AIV二联疫苗候选株奠定基础,并为当前新城疫与H9N2亚型禽流感的防控提供策略。     

GPI锚定蛋白介导嵌合新城疫病毒样颗粒的组装

当前嵌合病毒样颗粒(chimeric VLPs,cVLPs)策略主要基于融合序列的基因转染水平,但该方法存在多基因表达操控困难、锚定蛋白无法定量等问题。糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)是一种蛋白与细胞膜结合的方式,改造的GPI锚定蛋白可以被定量嵌合至真核细胞膜表面。因此,本研究以可溶性蛋白、Ⅰ型跨膜蛋白、Ⅱ型跨膜蛋白为嵌合对象,以GPI锚定方式将外源蛋白嵌合至新城疫病毒样颗粒(NDV VLPs)表面。流式细胞术检测可见GPI锚定蛋白可锚定至各真核细胞表面,并且与孵育时间呈正相关性;各组装GPI-cVLPs在电镜观察下具有完整的病毒粒子结构,与野生型NDV相似;经Western blot检测分析各GPI-cVLPs与NDV阳性血清和His单抗发生反应。综上,该GPI锚定策略能有效将外源蛋白嵌合至NDV VLPs,可为NDV VLP载体平台的应用奠定基础。     

嵌合布鲁菌BCSP31病毒样颗粒的免疫效果评价

新城疫病毒样颗粒已开发成一种高效递送外源蛋白的载体平台。本研究在小鼠模型中开展了嵌合布鲁菌BCSP31病毒样颗粒(BCSP31-cVLPs)免疫原性及其保护效力评价。体内试验数据表明,BCSP31-cVLPs能有效激活脾脏中树突状细胞,进而促进初始型CD3^+CD4^+ T的活化。ELISA法检测小鼠血清结果表明,BCSP31-cVLPs可刺激机体产生针对重组BCSP31蛋白的特异性抗体水平,且呈剂量依赖性。流式细胞术检测结果显示,BCSP31-cVLPs可激活T细胞并使其分化。攻毒结果表明,BCSP31-cVLPs具有与疫苗株M5相当的免疫保护效力。本研究为新型布鲁菌疫苗的研制提供了数据支撑,并扩展了新城疫病毒样颗粒疫苗载体平台的应用。     

绵羊痘P32蛋白嵌合型病毒样颗粒的构建及免疫原性评价

基于病毒样颗粒生产平台,以绵羊痘病毒P32蛋白为研究靶点,通过GPI锚定策略将P32蛋白锚定至新城疫病毒样颗粒囊膜表面制备嵌合型病毒样颗粒cVLP-P32。透射电镜可见近圆形的病毒粒子上布满纤突,Western blot结果显示各组分蛋白均正确表达。随后以BALB/c小鼠和绵羊为试验动物,评价cVLP-P32的免疫原性,ELISA结果显示cVLP-P32能够诱导小鼠及绵羊产生较高滴度的特异性抗体;流式细胞术分析结果显示,与可溶性GPI-P32蛋白相比,cVLP-P32可诱导小鼠激发更强的CD3~+CD4~+T及CD3~+CD8~+T细胞免疫应答。     

基因Ⅶ型新城疫病毒样颗粒作为疫苗候选株的免疫效果

利用昆虫细胞/杆状病毒表达载体系统,将已构建编码新城疫病毒(NDV)M、F和HN结构基因的3种单顺反子重组杆粒共感染悬浮培养的Sf9细胞以大量制备新城疫病毒样颗粒(ND VLPs)。收集细胞培养上清经超速离心浓缩,蔗糖密度梯度纯化后,利用Western blot检测和透射电镜观察。结果显示,3种目的蛋白均正确表达且组装形成与原病毒粒子形态相似的颗粒,测定其血凝活性效价可达12log2。动物试验结果表明,与LaSota灭活油乳苗相比,将纯化后的病毒样颗粒以含25μg蛋白的剂量或联合佐剂免疫商品蛋鸡后能产生较高水平的HI抗体,且可有效减少攻毒鸡只口咽、泄殖腔途径的排毒时间,从而减少病毒在健康鸡群中的传播感染机会;表明所研制的基因Ⅶ型ND VLPs可作为疫苗候选株具有很大的防控优势。     

内含NDV核酸的耐核糖核酸酶病毒样颗粒作为荧光定量RT-PCR内标的制备与鉴定

为制备检测新城疫病毒的实时荧光RT-PCR病毒样颗粒内标,扩增MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白序列,将其定向插入pET32a载体的相应位置,双酶切和PCR鉴定,构建pET32a-MS2重组质粒;根据新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测的目标片段,采用化学合成和klenow酶连接技术制备内标片段,将内标片段插入pET32a-MS2重组质粒,构建pET32a-MS2-IC重组质粒,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,经RNase和DNase消化后,采用荧光RT-PCR检测耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标的含量。结果表明,制备了高表达量耐核糖核酸酶病毒样颗粒内标,可用于新城疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立。     

新城疫病毒F、NP、M和HN基因在昆虫细胞内的共表达

为构建杆状病毒转移载体，通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的StuⅠ位点和NP基因上的XbaⅠ位点进行突变，扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段，将其克隆到pMD18-T载体，再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病毒转移载体pAeAB4上，F基因和M基因均在p10启动子的操控之下，NP基因和HN基因构建到两个polyhedrin启动子下游，构建重组杆状病毒转移载体pAeAB4-F-NP-M-HN。pAeAB4-F-NP-M-HN与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rBae-F-NP-M-HN。重组杆状病毒感染Sf9细胞，72h后收集细胞和培养上清。Western blot分析显示：M、NP、F和HN蛋白在培养上清中得到了共表达，大小与预期结果一致；感染细胞内只检测到了HN蛋白的表达。这表明M、NP、F和HN蛋白在昆虫细胞内共表达可以自我装配成病毒样颗粒，并且以出芽的方式释放到培养基中。该重组杆状病毒的获得为研究新城疫病毒各结构蛋白之间的相互作用和确定病毒粒子出芽的驱动力等方面奠定了基础。     

基于F和HN蛋白的基因Ⅶ型新城疫病毒嵌合疫苗的构建及免疫效力评估

【目的】 试验旨在构建一种基因Ⅶ型新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）嵌合疫苗,并对其免疫效力进行评估。【方法】 利用反向遗传学技术,以含有禽偏禽腮腺炎病毒2型（Avian metaavulavirus-2,AMAV-2） Y2株基因组的重组质粒pT7-Y2为模板,将Y2株的F和HN蛋白的胞外区替换为基因Ⅶ型NDV HB0901株的F和HN蛋白的胞外区,将HB0901株的F蛋白裂解位点突变为LaSota弱毒株的F蛋白裂解位点,构建嵌合重组病毒rY2-FHNR株。对rY2-FHNR株的增殖特性、致病力及遗传稳定性等生物学特性进行检测,并通过接种2周龄SPF鸡评估rY2-FHNR株的免疫原性及其免疫血清与Y2株的交叉反应性,利用NDV NP蛋白的间接ELISA方法对免疫血清进行检测,验证其鉴别诊断效果。【结果】 试验成功获得了嵌合重组病毒rY2-FHNR株,生物学特性检测结果显示,rY2-FHNR株在鸡胚中的增殖滴度和致病性符合弱毒特征,其鸡胚传代的遗传稳定性良好。rY2-FHNR株可诱导机体产生针对NDV的抗体,且免疫血清不与rY2株抗原发生交叉反应。通过NDV NP ELISA抗体检测方法可以实现区分疫苗免疫与野毒感染。【结论】 本试验研发了一种基因Ⅶ型NDV嵌合候选疫苗,为基因Ⅶ型NDV的监测、防控和净化提供了技术支撑。     

表达绿色荧光和红色荧光蛋白重组新城疫病毒的构建

试验旨在探究以新城疫病毒为载体进行多联疫苗的构建。通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(Ds Red)基因用T2A肽串联后克隆入嵌合新城疫病毒AI4-2FHN的P和M基因之间,获得重组质粒p AI4-2FHN-GRFP。该质粒与p CI-NP、p CI-P和p CI-L 3个辅助质粒共转染至稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR细胞后,获得可同时表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组新城疫病毒。拯救病毒在SPF鸡胚中繁殖传代,通过RT-PCR验证,并检测重组病毒的生物学活性和外源蛋白的表达效率。结果显示:重组病毒在鸡胚内传3代后,鸡胚尿囊液HA效价稳定在8 log_2,感染细胞24 h、36 h、48 h后在荧光显微镜下观察到EGFP与Ds Red的荧光亮度逐渐增强,且相同时间内红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白表达量相似。重组病毒的构建为新城疫病毒作载体用于多联多价疫苗的研发提供了参考。     

表达H5N1亚型禽流感HA、NA、 M1基因的重组杆状病毒的鉴定

为证实插入了禽流感HA、NA、M1、M2、NP基因的重组杆状病毒的表达物为具有禽流感形态的病毒样颗粒,对表达产物进行电镜、Western Blot、ELISA检测。蔗糖密度梯度离心纯化表达产物,电镜观察,可见禽流感病毒样颗粒;以Western Blot方法用HA、NA、M1抗体检测表达产物和纯化产物,可见特异性条带;NA多抗为捕获抗体、HA单抗为检测抗体建立夹心ELISA方法,检测表达产物,结果为阳性。结果显示,插入了禽流感HA、NA、M1、M2、NP的重组杆状病毒能够表达禽流感病毒样颗粒。     

兔出血症病毒衣壳蛋白N端携带双串联卵清蛋白T细胞表位嵌合体的构建与表达

在兔出血症病毒(RHDV)主要结构蛋白VP60的N端插入双串联卵清蛋白(OVA)CD8+T细胞表位(OVA第257-264位氨基酸),研究外源片段对VP60蛋白表达及病毒样颗粒(VLPs)装配的影响,分析VP60作为载体的可行性和对外源基因长度的耐受性。通过分子生物学方法将双串联OVA CD8+T细胞表位(257-264aa)插入至RHDV衣壳蛋白VP60基因序列的N端,得到重组VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,并命名为DN。经RT-PCR、间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blot方法鉴定嵌合蛋白DN的表达,利用电镜观察嵌合蛋白病毒样颗粒的形成。结果表明嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,且可形成与RHDV VLPs类似的病毒样颗粒。本研究为VP60作为载体系统,有效提呈外源片段的研究提供了重要依据,同时也为VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

新型高致病禽流感疫苗研制成功

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（国家禽流感参考实验室）的科研人员选择我国自行培育．免疫效果良好的一株新城疫病毒弱毒疫苗为载体，采用国际先进的反向基因操作技术．经过近四年努力，在国际上首次研制了表达H5亚型高致病力禽流感病毒抗原基因的重组新城疫病毒活载体双价疫苗。     

哈兽研新禽流感疫苗明年有望上市

从哈兽研获悉．经过近4年努力。该所国家禽流感参考实验室科研人员选择我国自行培育、免疫效果良好的一株新城疫病毒弱毒疫苗为载体，采用国际先进的反向基因操作技术，在国际上首次研制成功表达H5亚型高致病性禽流感病毒抗原基因的重组新城疫病毒活载体双价疫苗。预计这一新型双价疫苗12月末可正式进入产业化，明年1月有望投放市场。     

哈兽研研制出新禽流感疫苗

农业部昨天宣布，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（国家禽流感参考实验室）的科研人员选择我国自行培育、免疫效果良好的一株新城疫病毒弱毒疫苗为载体，采用国际先进的反向基因操作技术，经过近四年努力，在国际上首次研制了表达H5亚型高致病力禽流感病毒抗原基因的重组新城疫病毒活载体双价疫苗。     

应用重组杆状病毒表达NDVF糖蛋白和预防ND

用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）和家蚕核型多体病毒（ＢｍＮＰＶ）构建的杂合杆状病毒表达了鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｄ２６株的融合（Ｆ）糖蛋白，将编码Ｆ蛋白的基因插入宿主范围扩展的改良杆状病毒表达载体，重组杆状病毒ＨｙＦ１２１感染的草地贪夜蛾（ｓｆ）细胞中，表达的Ｆ蛋白定位于细胞表面，ＨｙＦ１２１感染吞蛹后，用感染蚕蛹制取抗ＮＤＶ的亚单位疫苗，这种亚单位疫苗接种鸡后可抵抗ＮＤＶ强毒的攻击。     

信息之窗

我国研制成功新型高致病性禽流感疫苗农业部14日宣布,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(国家禽流感参考实验室)的科研人员选择我国自行培育、免疫效果良好的一株新城疫病毒弱毒疫苗为载体,采用国际先进的反向基因操作技术,经过近四年努力,在国际上首次研制了表达H5亚型高致病力禽流感病毒抗原基因的重组新城疫病毒活载体双价疫苗。农业部有关负责人表示,新型疫苗与现有疫苗相比具有巨大优越性:一是可以实现一次免疫即可预防高致病性禽流感和新城疫两种重大禽病。二是安全性更高、使用更方便。三是更适用于肉禽的免疫。四是生产成本低廉,可以…     

含伯氏疏螺旋体OspA、OspC蛋白VLPs的构建及鉴定

莱姆病是一种经蜱传播的人兽共患病,随着人们经济的发展,伴侣动物的不断出现增加了人与动物经蜱传播莱姆病的风险,而当前并未有治疗莱姆病的有效方法,因此研制莱姆病疫苗成为一大热点。为了更好地预防莱姆病的发生,本研究通过替换新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白(haemagglutinin-neuraminidase protein,HN)胞外域的方式,利用昆虫杆状病毒表达系统分别构建了含伯氏疏螺旋体候选抗原表位外膜蛋白A(outer surface protein A,OspA)、外膜蛋白C(outer surface protein C,OspC)的新城疫病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),形成了含有伯氏疏螺旋体抗原表位的新城疫病毒样颗粒,为之后研制莱姆病疫苗提供了新思路、新想法。