新城疫病毒复制对其溶瘤作用影响的初步分析

本研究旨在明确新城疫病毒（NDV）溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检测NDV在各细胞系的蛋白表达水平;利用流式细胞术检测NDV感染对各细胞系的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明,NDV在三个细胞系内的基因组复制水平和蛋白表达水平没有显著差异,但对三个细胞系的溶瘤作用存在明显差异;进一步流式细胞术检测发现,NDV感染能诱发HEK293T和HCT116的细胞周期发生G1期停滞,但对A549的细胞周期没有明显影响;此外,NDV感染24 h后,A549细胞以早期凋亡为主,而HCT116细胞以坏死/晚期细胞凋亡为主。NDV的溶瘤作用并不依赖于其复制水平,而且NDV对不同类型肿瘤细胞的溶瘤作用存在不同机制。     

新城疫病毒复制对其溶瘤作用影响的初步分析

本研究旨在明确新城疫病毒(NDV)溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检测NDV在各细胞系的蛋白表达水平;利用流式细胞术检测NDV感染对各细胞系的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明,NDV在三个细胞系内的基因组复制水平和蛋白表达水平没有显著差异,但对三个细胞系的溶瘤作用存在明显差异;进一步流式细胞术检测发现,NDV感染能诱发HEK293T和HCT116的细胞周期发生G1期停滞,但对A549的细胞周期没有明显影响;此外,NDV感染24 h后,A549细胞以早期凋亡为主,而HCT116细胞以坏死/晚期细胞凋亡为主。NDV的溶瘤作用并不依赖于其复制水平,而且NDV对不同类型肿瘤细胞的溶瘤作用存在不同机制。     

TRAIL和HN基因融合表达重组腺病毒的构建及其对DT40细胞的抑瘤作用

分析携TRAIL和HN基因的重组腺病毒在DT40细胞中的表达规律及杀伤肿瘤细胞的生物学效应。通过RT-PCR分别从鸡外周血淋巴细胞和新城疫病毒(NDV)LaSota株中扩增出TRAIL和HN基因,通过定点突变和重叠延伸拼接法实现TRAIL和HN基因的2A连接,将获得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭载体中,与pAdeasy-1载体在BJ5183细菌内同源重组,构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-TRAIL和pAd-TRAIL-2A-HN,将质粒线性化后转染AD293细胞,包装后的重组腺病毒,经RT-PCR检测、荧光显微镜观察和病毒滴度测定后,将获得的重组腺病毒体外转染禽淋巴白血病DT40细胞,通过RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的感染性和外源基因的表达情况,采用流式细胞仪检测重组腺病毒对DT40细胞生长的影响以及Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-2A-HN对DT40细胞的凋亡作用。PacⅠ酶切证实同源重组成功;RT-PCR、荧光显微镜检测证实重组腺病毒质粒成功导入AD293细胞中且具有良好的感染性,滴度为1.9×1010PFU/mL;Western blot检测结果显示,TRAIL-linker-HN基因能够在DT40细胞中稳定表达并对DT40细胞产生细胞毒作用,且诱导细胞的凋亡率为29.52%,表明TRAIL-linker-HN具有双基因抑瘤的协同效应。     

溶瘤病毒在犬肿瘤治疗中的研究进展

溶瘤病毒疗法是利用病毒治疗恶性肿瘤的一种较有前景的新型生物疗法。溶瘤病毒不仅能直接特异性感染和溶解肿瘤细胞，也能刺激肿瘤部位的免疫反应来间接地溶解肿瘤组织细胞，且对正常组织细胞无杀伤或仅有较弱的杀伤作用，从而能达到理想的抗肿瘤效果。文章综述了溶瘤病毒的发展史及溶瘤病毒介导肿瘤消融术的机制，分析麻疹病毒、犬瘟热病毒、新城疫病毒、仙台病毒等8种病毒作为抗肿瘤药物在体外试验、异种移植肿瘤动物模型试验、肿瘤患犬治疗试验等不同阶段对各种犬肿瘤细胞的杀伤效果，提示溶瘤病毒疗法可能是一种安全可靠的恶性肿瘤治疗新方法，但真正将溶瘤病毒疗法应用在犬肿瘤临床治疗中时病毒肿瘤特异性、病毒使用剂量等问题仍需解决，本综述可为溶瘤病毒在犬肿瘤临床治疗中的安全使用提供新的思路和技术途径。     

受体相互作用蛋白1(RIP1)对BCG诱导小鼠巨噬细胞凋亡的调控作用

旨在通过构建受体相互作用蛋白1(RIP1)腺病毒干扰载体,研究其对BCG诱导的RAW264.7细胞凋亡相关指标的影响,以探讨其在BCG诱导RAW264.7凋亡过程中的调控作用。笔者构建RIP1腺病毒干扰载体,并转染感染BCG的小鼠RAW264.7细胞系,利用流式细胞仪检测各处理细胞凋亡率、细胞线粒体膜电位、细胞活性氧水平及细胞周期等指标,并用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示:BCG感染显著上调了RIP1的蛋白表达水平并提高了小鼠巨噬细胞RAW264.7的凋亡率,当RIP1被干扰后,BCG感染后的RAW264.7细胞凋亡率和活性氧水平显著降低,而促凋亡蛋白Bax表达量显著下调,线粒体膜电位和抑凋亡蛋白表达量上调。同时,BCG感染后细胞周期滞留于G_1期。BCG感染可有效上调RIP1表达量并诱导RAW264.7细胞凋亡。RIP1通过下调BCG感染后RAW264.7细胞的线粒体膜电位,上调活性氧含量并提高凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值,使细胞周期阻滞于G_1期从而参与诱导细胞凋亡。     

表达RGD和MEL重组沙门氏菌的构建及其对B16细胞凋亡作用的研究

为研究融合表达肿瘤靶向肽(RGD)和蜂毒肽(MEL)双基因重组减毒沙门氏菌对小鼠黑色素瘤B16细胞的体外抑瘤作用,本实验将RGD-MEL基因片段克隆至pEGFP-N1载体,将重组载体导入减毒沙门氏菌LH430,构建了重组沙门氏菌LH430/pEGFP-RGD-MEL,经PCR技术、质粒双酶切鉴定后采用阳性重组菌株侵染体外培养的小鼠黑色素瘤B16细胞,提取细胞总RNA经反转录后采用PCR检测目的基因RGD-MEL转录情况,western blot检测目的蛋白RGD-MEL以及凋亡蛋白Caspase-3、Bcl2、Bax的表达;流式细胞术检测B16细胞凋亡情况。结果显示:导入RGD-MEL基因的减毒沙门氏菌LH430侵染B16细胞后,目的基因RGD-MEL高效表达;经重组菌株侵染的B16细胞凋亡蛋白Caspase-3、Bcl2、Bax表达水平均显著增高(p<0.05);重组沙门氏菌诱导B16细胞的凋亡作用较PBS组显著增强(p<0.05)。本研究为细胞穿膜肽和细菌联合治疗肿瘤提供实验支持,并为后续动物试验奠定了研究基础。     

mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒对B16动物模型的抑瘤作用

为探讨双启动子调控HN基因重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN对小鼠黑色素瘤动物模型的抑瘤作用,试验构建B16裸鼠皮下移植瘤模型,采用HEK293细胞扩增重组腺病毒,进行纯化和滴度检测。将重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-mTyrp-HN、Ad-GFP和PBS通过尾静脉注射裸鼠,冰冻切片观察裸鼠肿瘤内GFP绿色荧光表达情况,通过肿瘤生长和裸鼠存活情况计算抑瘤率,探究其在体内的抗肿瘤作用。结果显示:重组腺病毒在HEK293细胞中扩增,滴度分别为10^11.250,10^12.250,10^10.625,10^12.125,10^12.250 TCID50/mL;肿瘤组织中能观察到黑色素细胞,证明皮下黑色素移植瘤模型构建成功;重组腺病毒对脏器无损伤,且在双启动子组脏器中没有观察到黑色素细胞的肝肺转移;通过尾静脉注射重组腺病毒后能够在肿瘤中观察到荧光表达;与其他组相比双启动子组重组腺病毒不但能抑制黑色素瘤的生长,而且能延长裸鼠的生存期,抑瘤率为55.5%。因此,该重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN具有靶向性,并且可以抑制肿瘤生长,可为黑色素瘤的治疗提供参考。     

携带Apoptin及hTERT启动子的双重特异性重组腺病毒的构建及鉴定

从质粒pMT-E1a和pIRES-neo中获得目的基因E1a和PolyA并连接入质粒pKS-hTERTp,用XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后连接入线性化的pAd-Apoptin,获得穿梭载体pAd-apoptin-PolyA-hTERTp-E1a。穿梭载体pAd-ApoptinPolyA-hTERTp-E1a和腺病毒骨架质粒(pAd5)共转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a,采用RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,MTS法检测病毒对A549细胞的抑制作用;绘制重组腺病毒生长曲线,监测重组腺病毒在细胞内的复制能力。结果显示:构建出的重组腺病毒中包含有了目的基因Apoptin和E1a,并且目的基因在细胞中正确的表达;MTS结果显示重组腺病毒对A549具有抑制作用,且抑制作用具有一定的时效及剂效关系;重组腺病毒具有在A549细胞中正常复制的能力。结果表明:成功的构建出了具有特异性杀伤和特异性复制能力的双重特异性重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a。     

gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响

为了解gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响,将人工合成的gga-miR-155模拟物、gga-miR-155抑制物以及阴性对照瞬时转染MDCC-MSB1细胞。然后采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MDCC-MSB1细胞中gga-miR-155的表达水平,CCK-8法检测转染后细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测MDCC-MSB1细胞的细胞周期与凋亡的变化,Transwell检测MDCC-MSB1细胞的迁移、侵袭能力的变化。结果显示,gga-miR-155模拟物可显著上调MDCC-MSB1细胞gga-miR-155表达水平,促进MDCC-MSB1细胞增殖,细胞G1期细胞减少,S和G2期细胞增加,同时凋亡减少,迁移、侵袭能力增加;gga-miR-155抑制物可显著下调MDCCMSB1细胞gga-miR-155表达水平,抑制MDCC-MSB1细胞增殖,细胞G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时凋亡增加,迁移、侵袭能力下降。结果表明,gga-miR-155可促进MDCC-MSB1细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。     

鸡TGFβ1对MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响

旨在探讨鸡TGFβ1对MDCC-MSB1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。作者将构建的鸡TGFβ1过表达载体、干扰表达载体以及相应阴性对照转染MDCC-MSB1细胞,然后检测转染后各组细胞鸡TGFβ1的表达水平、细胞增殖能力、细胞周期与凋亡,细胞的迁移与侵袭能力。结果显示,与相应阴性对照相比,转染TGFβ1过表达质粒可显著上调MDCC-MSB1细胞的TGFβ1表达水平,显著抑制MDCC-MSB1细胞的增殖,且使G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时增加细胞凋亡率,降低细胞的迁移与侵袭能力;转染TGFβ1干扰表达质粒可显著下调MDCC-MSB1细胞的TGFβ1表达水平,显著促进MDCC-MSB1细胞的增殖,G1期细胞减少、S和G2期细胞增加,同时降低细胞凋亡率,增加细胞的迁移与侵袭能力。结果表明,鸡TGFβ1可抑制MDCC-MSB1细胞增殖、迁移与侵袭,促进其凋亡。     

咖啡酸锗对小鼠U14瘤的抑制作用及细胞凋亡机制的研究

为了研究咖啡酸锗对小鼠U14瘤的抑制作用及其细胞凋亡机制,试验采用MG-P染色、透射电镜和免疫组化方法观察了U14瘤细胞的凋亡及瘤细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达情况。结果表明:MG-P染色及透射电镜观察可见,咖啡酸锗试验组出现较多的凋亡细胞,可见典型的细胞凋亡形态特征;免疫组化试验显示,咖啡酸锗各剂量组能下调Bcl-2蛋白表达(P0.05),上调Bax蛋白表达(P0.01或P0.05)。说明咖啡酸锗能抑制小鼠U14瘤的生长,并能诱导U14瘤细胞凋亡,这可能是其发挥抗肿瘤作用的主要机制之一。     

microRNA-133诱导绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞的研究

为了探明microRNA-133(miR-133)在诱导脐带间充质干细胞分化为成肌细胞过程中的作用,试验采用脂质体法以化学合成的miR-133转染绵羊脐带间充质干细胞并进行续培养。当细胞呈现成肌细胞的形态特征时,采用qRT-PCR法、免疫荧光法和流式细胞术分别检测转染细胞中成肌细胞特异性基因Desmin与Myf5 mRNA的相对表达量、成肌细胞标记蛋白Desmin与MyoD的表达情况及表达成肌细胞标记蛋白的细胞比率。结果表明:转染并续培养后第28天,续培养的细胞有序生长并呈现融合趋势;qRT-PCR检测可见,转染细胞中成肌细胞特异性基因Desmin及Myf5 mRNA的相对表达量明显提高;与未转染细胞相比,转染细胞特异性表达成肌细胞标记蛋白MyoD和Desmin;此外,转染细胞中表达MyoD和Desmin的细胞比率分别为99.3%和99.0%。说明miR-133在绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞过程中发挥重要作用。     

猪A型塞内卡毒株CH-01-2015的溶瘤效果

为探究猪A型塞内卡毒株(SVA) CH-01-2015的溶瘤效果，本试验以SVA CH-01-2015为研究对象，在体外通过显微镜观察和细胞活性测定检测该毒株对前列腺癌细胞(PC-3)、非小细胞肺癌细胞(H1299、A549)、子宫内膜癌细胞(Ishikawa)、胶质瘤细胞(U251)和宫颈癌细胞(Hela)共6种肿瘤细胞的杀伤情况，通过病毒复制动力学测定检测SVA CH-01-2015在不同肿瘤细胞中的复制情况；在体内，通过PC-3裸鼠荷瘤试验检测SVA CH-01-2015的溶瘤效果，通过免疫组化和组织病理学染色检测肿瘤组织中病毒的复制以及治疗后肿瘤组织的形态变化。体外试验结果显示，与对照组细胞相比，感染SVA CH-01-2015的PC-3、H1299和Ishikawa肿瘤细胞被显著裂解，而U251、A549和Hela肿瘤细胞形态无显著变化；且与对照组细胞相比，SVA CH-01-2015毒株能极显著杀伤PC-3、H1299和Ishikawa肿瘤细胞(P<0.01),对U251、A549和Hela肿瘤细胞几乎无杀伤作用(P>0.05);以感染复数(MOI)为1的SVA...     

捻转血矛线虫半胱氨酸蛋白酶对山羊PBMCs免疫功能的影响

旨在探究捻转血矛线虫半胱氨酸蛋白酶(Hc58)对山羊外周血单个核细胞(PBMCs)免疫功能的影响。采集健康山羊血液,分离出PBMCs和单核细胞,分别以质量浓度为0、10、20、40μg·mL-1的重组蛋白Hc58与细胞体外共培养,采用硝酸还原酶法测定不同浓度Hc58对单核细胞分泌一氧化氮(NO)的影响;采用流式细胞术检测重组蛋白对单核细胞吞噬FITC-dextran能力的影响;采用荧光定量PCR检测PBMCs中IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β的mRNA转录情况;采用迁移小室研究重组蛋白对PBMCs迁移的影响;采用流式细胞术检测不同浓度Hc58对PBMCs凋亡的影响。研究表明重组蛋白Hc58显著促进山羊单核细胞分泌NO;并且增强了山羊单核细胞的吞噬能力;Hc58显著上调IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表达量;Hc58显著提高山羊PBMCs凋亡比例,也使PBMCs迁移率增加。捻转血矛线虫半胱氨酸蛋白酶能通过多种途径影响宿主PBMCs发挥免疫作用。     

溶瘤病毒治疗犬类癌症的研究进展

溶瘤病毒疗法是一种有前景的癌症治疗新策略。溶瘤病毒治疗主要依赖于非致病性病毒株的参与,在原发和转移肿瘤细胞中表现出选择性的病毒复制,造成细胞病理反应和特异性免疫反应,从而导致肿瘤细胞的裂解死亡,同时对正常细胞和组织却没有破坏作用或影响较小。已有大量研究对天然病毒和基因改造病毒(如腺病毒、犬瘟热病毒、呼肠病毒、牛痘病毒及重组病毒等)的溶瘤机制、给药途径、治疗效果及安全性等方面进行了广泛探讨。论文综述溶瘤病毒在治疗犬类癌症中常用的病毒种类,分析溶瘤病毒在肿瘤治疗中的研究现状,将有助于溶瘤病毒在犬类癌症治疗中的制剂开发。     

血小板凝血酶蛋白1对犬乳腺肿瘤细胞体外生物学特性的影响分析

本研究旨在深入探讨血小板凝血酶蛋白1(THBS1)对犬乳腺肿瘤细胞CHMp的影响,并阐明其影响犬乳腺肿瘤发生发展的作用机制。通过构建THBS1慢病毒稳定过表达和THBS1沉默表达的犬乳腺肿瘤细胞CHMp细胞系,采用CCK-8试验、划痕试验、Transwell试验、原位荧光检测和流式细胞术检测THBS1对CHMp细胞增殖、迁移、侵袭、细胞凋亡和细胞周期情况的影响;通过qRT-PCR和Western blot检测THBS1对CHMp细胞凋亡相关因子(p53、Bcl-2、Bax)表达情况的影响,验证THBS1对CHMp细胞凋亡通路的影响。结果显示,过表达THBS1能有效增强犬乳腺肿瘤细胞CHMp的增殖、迁移和侵袭能力,并且减少CHMp细胞的凋亡数量,而沉默THBS1后结果与之相反;流式细胞术得出THBS1能够影响CHMp细胞的细胞周期分布;经qRT-PCR和Western blot检测发现,在THBS1过表达后,p53和Bcl-2的表达量均明显增高,Bax的表达量明显减少,在沉默THBS1后结果与之相反。结果表明,THBS1的异常表达能够影响犬乳腺肿瘤细胞CHMp的增殖、迁移、侵袭以及细胞周期;此外,THBS1能够通过影响细胞凋亡因子p53、Bcl-2和Bax的表达来影响CHMp细胞凋亡相关通路,进而影响犬乳腺肿瘤的发生发展。     

蜂毒素抗肿瘤作用研究进展

蜂毒是蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌的透明液体,蜂毒素是蜂毒的主要活性成分,具有抗肿瘤、免疫调节、抗高血压、抗菌、抗炎作用。总结蜂毒素抗肿瘤的作用机制,发现蜂毒素能抑制肿瘤血管的生成,诱导瘤细胞凋亡,也可直接杀伤瘤细胞,还能增加瘤细胞对放疗的敏感性,同时对机体免疫功能具有增强作用。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。     

RNAi沉默接触蛋白-1对犬乳腺肿细胞系CHMm增殖及迁移的影响

为探究接触蛋白-1(CNTN1)对体外培养的犬乳腺肿瘤细胞CHMm增殖及迁移能力的影响,本研究利用RNAi技术沉默CNNT1基因在犬乳腺肿瘤CHMm细胞中的表达,采用CCK8法检测CHMm细胞增殖能力、细胞划痕法检测CHMm细胞迁移能力,western blot检测CHMm细胞中E-cadherin蛋白含量。结果显示CNTN1沉默后,对犬乳腺肿瘤细胞CHMm增殖无明显影响,但能够导致使细胞迁移能力显著减弱,细胞中E-cadherin蛋白含量明显增加。研究表明CNTN1对犬乳腺肿瘤CHMm增殖调节无明显作用,对犬乳腺肿瘤细胞CHMm作用主要是通过降低E-cadherin蛋白的表达增强体外培养的肿瘤细胞迁移力,为犬乳腺肿瘤的治疗提供新的靶点。     

绵羊胚胎肌源性干细胞的生物学特性

为研究绵羊胚胎肌源性干细胞的生物学特性,取30日龄的绵羊胚胎,采用联合酶消化法及差速贴壁法分离培养获得均质的肌源性干细胞,并对其进行一系列生物学特性检测。结果显示,绵羊肌源性干细胞能传代培养至35代以上;免疫荧光染色和RT-PCR鉴定肌源性干细胞表面标记物Sca-1、CD34、CD144和Desmin呈阳性表达;生长曲线和细胞周期结果显示绵羊肌源性干细胞具有较强自我更新能力;通过不同的诱导方法可以将肌源性干细胞成功地诱导为肝样细胞和胰岛样细胞,Schiff染色和双硫腙染色均呈阳性,RT-PCR检测肝样细胞特异性标记物AFP和ALB以及胰岛样细胞特异性标记物Insulin均呈阳性表达,进一步证明了其诱导分化潜能。结果表明,本试验成功地分离培养获得了均质并具有较强自我更新潜能的绵羊肌源性干细胞,这种干细胞具有向肝样细胞和胰岛样细胞分化的潜能,这为临床治疗提供了潜在的理论基础和大量的种子细胞。