赤羽病病毒RT-PCR检测方法的建立

利用BHK 2 1细胞繁殖赤羽病病毒 (AKV)美国株 ,以 30 %蔗糖垫底超速离心浓缩病毒。根据病毒SRNA序列设计 3对引物 ,初步建立了检测AKV的RT PCR方法 ,850bp扩增产物的序列与已知序列同源性 99%以上。人工攻毒鼠检测特异灵敏。     

白条鸡传染性法氏囊病病毒RT-PCR检测方法的建立和初步应用

设计了一对特异性引物,对具有临床症状、病理变化明显和AGP检测呈阳性的病鸡屠体的肺脏和鼻腔粘液进行RT-PCR扩增。结果显示,6个样品的肺脏全部扩增出特异性基因片段,阳性符合率为100%,鼻腔粘液有5例扩增出阳性基因片段,符合率为80%。将建立的RT-PCR检测方法用于市售白条鸡的检测,90只随机样品中有7只扩增出阳性片段,检出率为7.78%。本试验建立的RT-PCR检测方法为肉食品原料卫生的检验提供了新的技术手段。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用

犬瘟热(CD)发病率近年来在我国呈明显上升趋势,对早期CD诊断方法的发展和完善,有利于指导临床及时治疗,对于控制CD的蔓延有重要意义.根据GenBank中CDV核衣壳蛋白(N)基因序列,设计合成一对特异性寡聚核苷酸引物,提取CDV疫苗株的总RNA进行反转录和PCR,建立RT-PCR检测方法,并应用于临床病例的诊断,同时和CDV抗原快速诊断试纸进行比较.结果显示:RT-PCR有很好的敏感性和特异性,适合对CDV进行早期快速诊断和流行病学调查.     

犬瘟热病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立犬瘟热病毒(CDV)的一步法RT-PCR检测方法,并将其应用于临床实践检测。本研究根据GenBank上已登录的CDV基因序列,设计一对特异性引物,建立CDV一步法RT-PCR检测方法,并将该方法应用于临床检测。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,可用于CDV感染的早期诊断和病原监测。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEVN基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法。应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1168bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株的序列同源性达到95%～97%;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的TGEV-N-cDNA;对猪传染性胃肠炎(TGE)的病料进行RT-PCR鉴定,可检测出TGEVN基因片段。结果表明建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查。     

鸡大肝大脾病病毒RT-PCR检测方法建立的初报

<正> 鸡大肝大脾病是主要发生于商品代肉用种鸡的一种传染性疾病。1980年最先在澳大利亚发现,1988年Handinger等对该病进行了描述。血清学调查表明在英国、美国和新西兰也有一些鸡群感染。单松华等通过血清学调查证实我国部分地区已存在该病。该病自发现以来一直以琼脂免疫扩散试验作为免疫学     

RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立与应用

建立RT PCR检测猪瘟病毒的方法。根据已发表的猪瘟病毒E2基因 (囊膜糖蛋白gP55基因 )序列 ,设计合成了一对特异性引物 ,扩增片段的大小为 50 7bp ,用RT PCR技术对石门系标准株和 1 0株分离株进行检测。结果这对引物对标准株和 1 0株分离株均能扩增出与预期大小相符 50 7bpRT PCR产物 ,而对其他 6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该RT PCR可检出 1 0 0pg的猪瘟病毒RNA模板 ,对人工感染猪不同组织样品进行检测 ,结果对白细胞抽提的核酸样品检出率最高为 1 0 0 % (2 4 / 2 4 ) ,其次为扁桃体、脾、肾 ,检出率为 83 3 % (2 0 / 2 4 ) ,再者为淋巴结 ,检出率为66 7% (1 6/ 2 4 )。对送检的 1 9份疑似猪瘟的病死猪病料组织进行RT PCR检测 ,结果有 1 6份样品为猪瘟病毒阳性。兔体交叉反应试验结果RT PCR阳性的 1 6份病料中 ,有 1 4份样品被判为含有猪瘟病毒 ,其他病料兔体交叉反应试验结果全为阴性     

塞内卡病毒A的RT-PCR检测方法的建立和应用

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,可引起成年母猪水疱性病变,并导致新生仔猪死亡。为建立SVA的快速检测方法,本研究对NCBI发表的40株SVA的基因序列进行同源比较,选择保守区域设计了3对引物P1、P2和P3,从中筛选出最佳扩增引物,通过对引物浓度、退火温度、延长时间、循环次数进行优化,成功建立了SVA的RT-PCR检测方法。用该方法检测SVA、脑心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应,具有良好的特异性。敏感性试验结果显示,病毒检测限可达1TCID50,比国外文献报道的检测方法灵敏性更高。用该方法检测山东省的100份猪组织样品,阳性率为2%。本研究所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,为SVA的快速检测及流行病学调查提供了有效的技术手段。     

猪瘟病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、特异、灵敏的检测猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）巢式RT-PCR（nested RT-PCR）方法,本研究参照GenBank中公布的CSFV E2基因保守区域序列设计2对特异性引物,以CSFV总RNA为模板,优化反应条件,建立CSFV nested RT-PCR方法,对其进行特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了应用检测,并对阳性PCR产物进行克隆测序鉴定。结果表明,本研究成功建立了CSFV nested RT-PCR检测方法,能够特异性地扩增CSFV,但对ST正常细胞对照和其他8种病原对照未扩增出任何条带;稳定性和重复性好;敏感性高,最低检测病毒含量为1 TCID₅₀;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,PCR阳性产物克隆测序结果表明均为CSFV E2基因片段。本研究成功建立了CSFV nested RT-PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测,为CSF的早期检测诊断提供了特异、灵敏的方法。     

火龙果主要病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

建立快速而稳定的火龙果病毒病分子检测体系,为火龙果病毒病的分子生物学鉴定提供技术支持。本文以感病的火龙果茎为研究材料,根据火龙果主要病毒病Pitaya virus X（PiVX）、Schlubergera virus X（SchVX）、Cactus virus X（CVX）及Zygocactus virus X（ZyVX）的保守序列设计特异性引物,运用RT-PCR技术进行扩增,将目的片段回收、克隆和测序。结果表明四种病毒序列与NCBI数据库里相应病毒核苷酸序列均具有较高的一致性。利用梯度稀释法依次将cDNA稀释为2、22、23、24、25、26、27倍,对各病毒灵敏度进行分析,结果显示,能检测出大部分病毒的火龙果cDNA最低浓度是45.75 ng·μL-1。应用该方法对贵州省罗甸县部分火龙果生产园内植株进行病原检测,结果显示该检测体系能特异、灵敏、稳定地检测出PiVX、SchVX、ZyVX及CVX这四种病毒。     

赤羽病病毒套式RT-PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank中已发表的赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了3条特异性引物,建立了检测AKAV的套式RT-PCR方法。特异性试验表明,该方法可以特异扩增出AKAV的S基因片段,但从牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)等13种对照病毒中均不能扩增出目的条带。敏感性试验表明,套式RT-PCR能够扩增10-5稀释度的病毒RNA(核酸含量约1.18 ng/μL),比普通RT-PCR高出1 000倍。用此方法检测130份奶牛血清样品与1份流产胎儿病料,均未检测到阳性样本,但AKAV在血清模拟样品中可被有效检出。研究结果表明,该方法灵敏、特异,为AKAV的检测提供了一个快速、有效的手段。     

动物狂犬病病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

以GenBank收录的多基因型狂犬病病毒(RV)N基因序列为参考,设计了简并的PCR引物,建立了能够有效扩增7种基因型RV基因组片段的巢式RT-PCR(nested RT-PCR)方法,命名为RVN371.该方法能够检测到4.6个TCID50的SRV9固定毒,对犬、猪、蝙蝠及牛的狂犬病阳性脑组织样品均表现出良好的特感性:扩增产物目的带位置正确,未见非特异性扩增条带.对比试验表明,RVN371对街毒脑组织样品检测的灵敏度较乳鼠脑内接种试验(MIT)高出100倍;在对3种鼠脑固定毒、12种犬脑街毒样品的检测中,与RV检测的金标方法--免疫荧光试验(FAT)完全符合.RVN371为动物狂犬病的实验室诊断和流行病学研究提供了有利的工具.     

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为同时检测猪源临床样本中的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV),基于这两种病毒的5'UTR序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种检测CSFV和BVDV的双重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、最低检出限和重复性等进行了评价。结果显示,该方法只对CSFV和BVDV呈现特异性扩增,对猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,对阳性标准对照CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA,最低可分别检出27、36和32拷贝/μL。该方法的组内和组间试验Ct值变异系数介于0.11%～1.20%,具有良好的重现性。对152份猪组织样本用该方法进行CSFV和BVDV核酸检测,结果检出CSFV阳性样本16份,BVDV阳性样本3份,CSFV和BVDV双阳性样本1份,与国标和OIE《陆生动物诊断试验和疫苗》相应的荧光RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重荧光RT-PCR方法可用于临床样本中的CSFV和BVDV检测,从而为猪瘟防制和净化提供了一种有效的技术手段。     

检测鹿黏膜病病毒LDR-PCR方法的建立

为准确特异灵敏地检测鹿黏膜病病毒,本研究建立了一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计1对LDR探针,LDR探针两端各连有1段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,本方法可以特异地检测BVDV,最低检测限为101个拷贝。此方法的建立为BVDV基础研究和临床应用提供了良好的技术平台,为进一步开发高通量的多病原检测技术提供了技术基础。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5＇端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针，建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株，未能检测出牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞；对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析，与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50／mL，整个试验流程只需2h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本，两种方法的检出率分别为17．4％和13．5％，两者符合率为95．7％（198／207）；荧光RT-PCR的检出率高于ELISA，两者差异显著。结果表明，建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

兔出血病病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速检测兔出血病病毒,参照RHDV-TP株VP60基因序列(GenBank Ac-ession AF453761),在其5′端设计一对引物,扩增片段为386 bp,建立了检测兔出血病病毒的RT-PCR检测方法。经过对反应参数的优化,确定了反应的最佳条件。该方法在含多种已知病原的病料中,可特异性检出RHDV,检测病料的最高稀释度为10-5倍,且有很好的稳定性。临床样品检测结果显示,该方法的敏感性要高于血凝抑制试验,从而建立了RHDV特异、敏感的RT-PCR检测技术,可应用于RHDV临床诊断及流行病学调查。     

鸡传染性支气管炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速准确检测鸡传染性支气管炎病毒的方法,根据鸡传染性支气管炎病毒的核衣壳蛋白基因进行引物和探针设计,建立了一种能够检测鸡传染性支气管炎病毒的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法进行特异性和灵敏度检测,同时与国家标准检测方法进行对比。结果显示,本检测方法特异性好,不与其他相关病毒发生交叉反应,灵敏度可达到10-4 ng/μL,与国标检测方法的符合率达100%。结果表明,本研究建立的检测方法可以准确鉴定鸡传染性支气管炎病毒,具有良好的应用前景。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立

试验根据GenBank上发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白基因序列,设计合成了一对寡聚核苷酸引物,扩增大小为245 bp的目的片段,建立起PEDV N基因的RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法具有很强特异性和很高的敏感性,可作为猪流行性腹泻临床快速诊断的一种方法。     

犬瘟热病毒一步RT-PCR检测方法的建立

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核蛋白(N)基因的相对保守区序列设计了1对特异性寡聚核苷酸引物,在国内首次建立了CDV一步RT-PCR检测方法。该法可以特异地扩增出N基因265 bp大小的目的片段,可以检测到0.043 6μg/mL的总RNA,与两步法RT-PCR的敏感性相当。对25例犬瘟热临床疑似病例样品,一步法RT-PCR检测出17份阳性,与两步法RT-PCR的阳性符合率达94.4%,胶体金检测试纸条检测出13份阳性。研究结果表明,建立的CDV一步法RT-PCR检测方便、敏感、特异,适用于CDV临床病料的检测和分子流行病学调查。