FGF4在牛早期胚胎发育过程中的表达

应用实时荧光定量PCR和免疫荧光染色技术对成纤维生长因子4(FGF4)在牛早期胚胎发育各个阶段的表达和定位规律进行研究。结果表明,FGF4mRNA及蛋白在牛MⅡ期卵母细胞及各阶段早期胚胎均有表达,其表达量由强到弱依次为桑椹胚、囊胚、8-细胞胚、MⅡ期卵母细胞、4-细胞胚、2-细胞胚;从定位来看,FGF4在MⅡ期卵母细胞及8-细胞期前的各阶段早期胚胎的细胞质和细胞核中均有表达,而8-细胞期及之后的桑椹胚和囊胚期仅分布于细胞质。结果提示,FGF4在牛的早期胚胎发育过程中可能发挥重要作用。     

早期胚胎体外培养微流控芯片的制备及初步应用

利用微流控芯片模拟输卵管微环境,探讨物理性刺激对早期胚胎发育的影响,为解决早期胚胎体外囊胚发育率较低、胚胎质量差的问题提供帮助。本实验采用一次铸造成型制备微流控芯片培养装置,并应用培养装置对小鼠1-细胞期胚胎进行培养,观察胚胎体外发育率。结果表明,利用微流控芯片培养组与对照组2相比,2-细胞胚胎发育率差异不显著(P0.05),但是,在8-细胞胚胎发育率、桑葚胚发育率和囊胚发育率都差异显著(P0.05)。此外,囊胚内总细胞数显著提高(P0.05)。结论:一次铸造成型微流控芯片制作方法简便易行且培养液不易外漏,这种培养装置能显著提高小鼠早期胚胎体外囊胚发育率和胚胎的质量。     

小鼠胚胎母源基因转向合子基因组的转换起始点

为研究母、父源基因以及合子基因在动物胚胎早期发育中发挥功能的重要时间节点,本实验利用转增强型荧光蛋白(EGFP)基因小鼠(♀/♂),分别与野生型小鼠进行交配,收集受精后的胚胎于倒置荧光显微镜下观察,寻找EGFP基因在不同胚胎发育阶段时间节点表达的特征,作为直观判断母源基因向合子基因的转换时间起始点的生物标志。结果发现:从EGFP转基因母鼠获得的5枚卵母细胞/原核胚中表达了EGFP基因,在荧光显微镜下表现出绿色荧光;而从野生型母鼠获得的20枚胚胎到2-细胞(2-cell)期后开始表现出绿色荧光,随着胚胎的发育,出现荧光的胚胎数量逐渐增多,达到5枚。综上,EGFP基因可以作为小鼠胚胎发育过程中合子基因的标志物,小鼠胚胎发育过程中母源基因向合子基因转换的时机在胚胎发育的2-cell期。     

自噬调节因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育过程中的表达分析

旨在探究自噬调节因子Atg5和Beclin1在胚胎早期发育过程中的表达模式及胚胎的不同生产方式对两种因子表达的影响。本研究将6~8周龄雌性小鼠进行超数排卵,分为2组,一组收集小鼠卵母细胞,孤雌激活处理后进行体外培养;另一组超排小鼠与公鼠1：1合笼,第2天收集小鼠受精卵进行体外培养;分别在2细胞期、4~8细胞期、桑葚胚期和囊胚期收集不同阶段小鼠孤雌激活胚胎和自然受精胚胎。提取RNA和蛋白,通过实时荧光定量PCR、Western blot等方法检测自噬关键因子Atg5和Beclin1的表达,通过间接免疫荧光法检测Atg5和Beclin1在小鼠囊胚中的表达定位。结果显示,小鼠自然受精和孤雌激活胚胎在发育各时期均可表达Atg5和Beclin1,表达量在胚胎发育的早期呈现出较高的水平,其中二者的表达在小鼠自然受精胚胎中从2细胞期起逐渐降低,而在孤雌激活胚胎的4~8细胞阶段表达量最高,与同期自然受精胚胎差异极显著（P<0.01）;从4细胞期开始,各时期孤雌激活胚胎中Atg5和Beclin1蛋白表达水平均高于自然受精胚胎,差异极显著（P<0.01）;在囊胚中,滋养层细胞和内细胞团中均可检测到Atg5和Beclin1蛋白的荧光,但内细胞团中的荧光强度高于滋养层细胞,且Beclin1蛋白在孤雌激活胚胎囊胚内细胞团中荧光强度高于自然受精胚胎。自噬关键因子Atg5和Beclin1在不同来源小鼠胚胎早期发育各时期均有不同程度的表达,提示自噬对早期胚胎发育的调控作用与胚胎的生产方式存在一定关联,研究结果为进一步探索细胞自噬参与哺乳动物胚胎发育的生理调控提供理论依据。     

KDM2B在小鼠卵母细胞及早期胚胎发育过程中的表达分析

本研究旨在分析KDM2B在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达规律,为KDM2B在卵母细胞减数分裂及胚胎发育过程中的生物学作用奠定基础。选择20只6～8周龄小鼠为试验动物,收集GV期、MⅡ期卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、囊胚各阶段胚胎,根据GenBank上已公布的小鼠(Mus musculus)KDM2B序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测KDM2B在胚胎各阶段mRNA的表达水平;通过免疫荧光染色定位KDM2B蛋白在胚胎各阶段的分布。结果显示,GV期卵母细胞KDM2B mRNA的表达量极显著高于MⅡ期(P<0.01);在2-细胞、4-细胞和8-细胞mRNA表达量较低,囊胚期其表达量极显著升高(P<0.01);卵母细胞成熟过程中,KDM2B在GV期主要表达于细胞核中,MⅡ期卵母细胞核中的荧光信号极显著减弱(P<0.01),早期胚胎发育过程中,KDM2B蛋白在2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎中均不表达,囊胚期重新表达于细胞核。综上表明,本研究成功建立KDM2B在小鼠卵母细胞及胚胎细胞中的时空及时序表达模式,关于KDM2B参与调控减数分裂与胚胎发育过程具体的作用机制有待进一步研究。     

卵母细胞成熟和受精研究的最近进展

本文就培养液中加促性腺激素对于卵母细胞成熟和体外受精的影响进行了探讨。加有LH+E_2、FSH+E_2,及不加激素培养胚胎处理间,合子发育至桑葚胚和囊胚的百分率差异不显著。用不同类型的细胞单层协同培养对于早期胚胎发育的影响试验观察到,在输卵管细胞和子宫细胞组合构成的单层中培养的胚胎比在颗粒细胞单层上培养的胚胎发育更快。有几篇关于分离刺激胚胎发育的输卵管因子的报道认为,在输卵管壶腹部条件培养液中,小鼠1—细胞受精卵发育较好,且证明一种低分子量组分在胚胎发育中起了重要作用。     

牛磺熊脱氧胆酸对黄牛体外受精早期胚胎发育的影响

旨在研究牛磺熊脱氧胆酸(Tauro ursodeoxychollc acid,TUDCA)对黄牛体外受精(IVF)早期胚胎发育的影响。采用RT-PCR法检测黄牛IVF胚胎早期发育各时期XBP-1mRNA剪接激活情况,随后分别用添加不同浓度(0、100、250、500、1 000μmol·L-1)TUDCA的培养液培养胚胎,分别统计胚胎分裂率、囊胚率、囊胚细胞总数及囊胚细胞凋亡率,采用qRT-PCR法分析囊胚内质网应激相关基因Grp78、Chop、Bax、Bcl-2的表达情况。结果表明,在胚胎的4-细胞、桑椹胚、囊胚检测到XBP-1mRNA明显剪接;IVF胚胎经不同浓度TUDCA培养后各组间的胚胎分裂率差异不显著(P0.05),但500μmol·L-1 TUDCA组提高了胚胎的囊胚发育率及囊胚细胞数(P0.05),并降低了囊胚细胞凋亡率(P0.05);qRT-PCR检测表明,500μmol·L-1 TUDCA处理组下调了囊胚Chop基因的表达,且上调了Bcl-2基因的表达(P0.05),而Grp78与Bax表达与对照组相比差异不显著(P0.05)。综上表明:早期胚胎体外发育过程中,存在内质网应激反应;胚胎培养液中添加500μmol·L-1 TUDCA,可以降低内质网应激反应,有利于促进黄牛胚胎发育。     

超低温冷冻对小鼠桑椹胚多能性因子Oct-4表达的影响

本实验旨在探讨昆明白小鼠桑椹胚超低温冷冻后Oct-4表达的变化与胚胎发育潜力的关系。胚胎采用OPS法冷冻,即胚胎于10%EG+10%DMSO溶液中预处理30 s,然后再移入玻璃化溶液(EDFS30)中处理25 s,以OPS为承载器投入液氮中。毒性组胚胎未投入液氮,其他过程与冷冻组相同,新鲜胚胎为对照组。胚胎解冻后,检测Oct-4 mRNA与蛋白的表达,通过观察其形态正常率、囊胚发育率和囊胚细胞数来综合判断其体外发育能力。结果表明:冷冻组和毒性组较桑椹胚中Oct-4 mRNA的表达量对照组相比显著降低(P<0.05),蛋白表达量3组间无显著差异。桑椹胚处理后的形态正常率以及桑椹胚培养48 h后的囊胚发育率(96.67%～100%)和囊胚细胞数(89.67～92.33)3组间无显著差异。结果显示,玻璃化冷冻保存小鼠桑椹胚后多能性基因Oct-4 mRNA表达的变化并未影响其体外发育潜力。     

RAD18基因在小鼠胚胎中的表达分析

为了研究RAD18基因在小鼠胚胎发育过程中的表达模式,试验以体外培养的FVB小鼠胚胎为材料,采用定量RT-PCR及免疫荧光技术分析RAD18基因在小鼠胚胎中的表达水平。qRT-PCR结果表明,RAD18基因在小鼠植入前各时期胚胎中均有表达,其中与1-细胞期胚胎相比,其在2-细胞、8-细胞期胚胎中表达水平较高(P0.01),在桑葚期和囊胚期胚胎中表达量显著下降(P0.01)。免疫荧光方法检测结果表明RAD18蛋白在在小鼠植入前各时期胚胎中均有表达。说明RAD18基因在小鼠植入前胚胎中均有表达,推测其与小鼠胚胎的早期发育密切相关。     

不同发育阶段小鼠胚胎S、M—期卵裂球的检测以及低温对胚胎细胞DNA合成的影响

利用放射自显影技术检测了小鼠着床前胚胎(4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚)不同发育阶段(早、中、晚)S期和M期卵裂球的比率，并研究了低温(4℃)对小鼠胚胎发育及DNA合成的影响。结果显示，早期和中期4-细胞胚胎S期卵裂球比率较高，分别是75%、92%，没有M期卵裂球，晚期4-细胞胚胎S期卵裂球比率较低(30%)，M期卵裂球比率为11%；早期和中期8-细胞胚胎S期卵裂球比率仍很高，分别是73%、80%，M期卵裂球分别为0、2.5%，晚期8-细胞胚胎S期卵裂球比率增至64%，M期卵裂球减少至9%；早、中、晚期桑葚胚的S期卵裂球比率分别是77%、72%和79%，M期卵裂球的比率分别是5%、3%和3%；早、中、晚期囊胚的S期卵裂球比率分别是78%、74%和77%，M期卵裂球的比率分别是4%、3%和4%。4℃的低温对小鼠早期胚胎的发育和DNA合成都没有明显影响；4-细胞、8-细胞胚胎和桑葚胚经低温处理及培养后其囊胚形成率和平均卵裂球数分别是62%和(26±6)个、54%和(25±7)个、87%和(34±8)个；4-细胞、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚经低温处理后S期卵裂球比率分别是97%、77%、70%和74%。     

hTERT永生化牛乳腺上皮细胞核移植胚胎的早期发育

为了研究供核细胞端粒酶基因的激活是否影响核移植胚胎的早期发育,试验采用转染端粒酶基因的牛乳腺上皮细胞与正常乳腺上皮细胞分别作为供核细胞进行核移植,检测重构胚卵裂率、囊胚发育率和孵化胚发育率及囊胚细胞数的差异。结果表明:2种细胞都可被牛卵母细胞重编程,各项指标差异均不显著。说明供核细胞人端粒酶催化亚基水平的高低对植入前阶段的核移植胚胎发育无显著影响,推测牛早期核移植胚胎可以调节端粒酶基因的表达和端粒的延伸,无需外源人端粒酶催化亚基活性。     

卵母细胞质移植对兔原核胚体外发育的影响

卵母细胞胞质中存在着大量的母源性信息，正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由这些母源性信息所控制。为了评估卵胞质含量对早期胚胎发育的影响，以假显微注射兔原核胚为对照，采用显微注射技术将兔原核期胚胎去除或增加一定量的细胞质：试验一，增加5％和20％的细胞质；试验二，移入5％小鼠MⅡ期卵母细胞胞质。胚胎经显微操作后进行R1／R2序贯培养。结果显示，（1）增量5％组胚胎的2细胞胚（72．00％）、8细胞胚（60．00％）、桑椹胚（58．00％）和囊胚（54．00％）的发育率均显著（P〈0．05）高于增量20％组胚胎（分别为47．62％、35．71％、33．33％和30．95％），但与对照组之间无显著差异（P〉0．05）；囊胚细胞数在2个增量组和对照组3者之间也无显著差异（P〉0．05）。（2）将5％小鼠MⅡ期卵胞质移入兔原核胚后，各阶段胚胎发育率和囊胚细胞数与增量5％组、对照组相比均无显著差异；早期胚胎经PCR检测，在2细胞胚（5／5）、8细胞胚（5／5）和桑椹胚（5／5）均全部检测到了供体小鼠mtDNA的D—loop区3’端片段，而在囊胚却仅有1枚（1／5）能够检测到。结果表明，增加少量细胞质不会对兔原核胚的体外发育造成显著影响，但胚胎发育率随着细胞质体积的增加有下降趋势，而异种卵胞质对兔原核胚的发育没有明显影响，在囊胚期虽仍能检测到异种卵胞质中mtDNA的存在，但异种mtDNA会随胚胎发育而逐渐减少。     

体细胞克隆的小鼠胚胎在附植前后发育的研究

采用成年小鼠的卵丘细胞核、胎儿成纤维细胞作核供体细胞来进行核移植,研究小鼠卵母细胞的去核程序和影响重构胚附植前发育的激活条件;随后将重构胚与供体细胞系共培养后获得囊胚阶段的小鼠重构胚,并将其移植到受体鼠体内后获得了24%克隆胚胎。结果表明,小鼠卵母细胞质能够进行重编程来支持早期的胚胎发育。     

转sMTPGH基因小鼠胚胎的体外培养

采用纯化的羊金属硫蛋白 (s MT)启动子指导的猪生长激素 (PGH )基因 (s MTPGH)为显微注射片段 ,将其导入小鼠受精卵原核 ,比较了几种不同培养液对导入外源基因的小鼠胚胎体外发育的影响。结果表明 ,改进的 M16培养液(用 m M16表示 )能有效克服 2 -细胞阻断现象 ,并使转基因胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在 m M16培养液的基础上 ,再加入表皮生长因子 (EGF) ,可使 1-细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在 3种培养液 (M16、m M16、m M16 EGF)中 ,转基因胚胎突破 2 -细胞阻断期的比率分别为 12 %、6 8%、90 % ,发育到囊胚期的比率分别是 0 %、2 0 %、4 3%。采用 PCR方法检测 5 7枚经体外培养发育至囊胚的显微注射胚胎 ,4枚扩增出阳性条带 ,外源基因在囊胚期胚胎的滞留率为 7%。     

黄牛卵母细胞和早期胚胎组蛋白乙酰化转移酶1表达模式研究

为探讨卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中组蛋白乙酰基转移酶(HAT1)的表达规律,研究应用实时定量PCR技术,检测了广西本地黄牛卵母细胞和附植前胚胎HAT1基因的表达情况。结果表明:HAT1基因在黄牛生发泡期(GV)卵母细胞、第2次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞、体外受精(IVF)胚胎2～4细胞、8～16细胞、桑葚胚和囊胚中的相对表达量分别为1.00、0.56、0.08、0.55、0.43和0.31,在孤雌激活(PA)胚胎的2～4细胞、8～16细胞、桑葚胚和囊胚中的相对表达量分别为0.55、0.55、0.48和0.46。HAT1在GV期相对表达量最高,在IVF胚胎中2～4细胞表达量最少(P<0.05)。由此可见,HAT1基因在黄牛卵母细胞成熟和早期胚胎阶段均有表达,GV期HAT1基因的表达最高,PA胚胎HAT1基因的表达较稳定。     

HSPA9B在牦牛体外受精胚胎中的表达

本试验旨在研究热休克蛋白70-9B(heat shock 70 000protein-9B,HSPA9B)在牦牛早期体外受精胚胎中的表达差异及其与体外受精胚胎发育的关系。在正常生理条件下,采集青海高原牦牛卵巢,捡取质量良好的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs),进行体外受精和体外培养,采取实时荧光定量(RT-qPCR)和间接免疫荧光技术,检测HSPA9B在不同时期体外受精胚胎中的表达差异及其蛋白分布。实时荧光定量结果表明,HSPA9B在2~4细胞期胚胎中的相对表达量,分别是在桑椹胚和囊胚中的6.693 4、5.227 4倍,HSPA9B在4~8细胞期胚胎中的相对表达量分别是在2~4细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚中的1.136 8、9.089 7和5.937 2倍。间接免疫荧光染色结果表明,在2~4细胞期胚胎、4~8细胞期胚胎和桑椹胚中,胞核HSPA9B的相对表达量较胞质弱,在囊胚中胞核HSPA9B的相对表达量较胞质强。由此得出结论:通过基因水平研究,发现HSPA9B在牦牛早期各时期的体外受精胚胎中存在表达差异,HSPA9B在2~4、4~8细胞期胚胎中的相对表达量与其在桑椹胚和囊胚中的相对表达量差异性极显著(P0.01),提示:可能是HSPA9B在胚胎早期发育中发挥重要作用;通过蛋白水平研究,发现HSPA9B在2~4细胞期胚胎、4~8细胞期胚胎和桑椹胚中,胞核HSPA9B的表达量较胞质的表达弱,在囊胚中胞核HSPA9B的表达量较胞质的表达强,结果表明,在体外培养的环境应激条件下,牦牛体外受精胚胎发育至囊胚时,HSPA9B蛋白的分布可能发生了移位。     

牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养的研究

探讨了人工合成培养液ＣＲ１ａａ和小鼠胎仔成纤维细胞对牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明，牛体外受精卵在ＣＲ１ａａ液中的卵裂率达７６．２％，８细胞胚的比率达４４．８％。小鼠胎仔成纤维细胞能够显著促进牛体外受精的早期囊胚以上胚胎的发育。牛体外受精后第５、６天的早期胚胎分别与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，在受精后第７天发育至囊胚以上的比率分别达１９．８％和２４．６％；受精后第８天，孵化的囊胚比例分别达５．２％和７．５％。实验表明，受精后第５、６天的牛体外受精早期胚胎与小鼠胎仔成纤维细胞共培养，可显著提高扩张囊胚和孵化囊胚数量。小鼠成纤维细胞对胚胎发育的支持作用取决于胚胎发育阶段     

胚胎干细胞显微注射对小鼠和猪胚胎发育影响的研究

旨在为小鼠和猪多能性干细胞嵌合体制作提供参考,探讨胚胎干细胞(Embryonic stem cells或Embryonic germ cells,ES/EG)显微注射及受体胚胎发育时期等对胚胎发育的影响。对小鼠ES细胞和猪EG细胞分别进行研究:(1)将小鼠ES细胞分别注入小鼠桑椹胚和囊胚,比较不同发育时期受体胚胎体外培养的发育率和孵化率,以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的发育率和孵化率。结果表明,显微注射后的桑椹胚体外培养发育率和孵化率分别为94.7%和70.2%,囊胚率分别为84.6%和80.8%,注射后桑椹胚体外培养发育率极显著高于囊胚(P0.01),但注射后囊胚体外培养孵化率极显著高于桑椹胚(P0.01);未注射胚胎(注射胚胎)的体外培养发育率和孵化率分别为96.6%(89.9%)和67.8%(75.2%),未注射胚胎发育率极显著高于注射胚胎(P0.01),但注射胚胎孵化率极显著高于未注射胚胎(P0.01)。(2)将猪EG细胞分别注入猪桑椹胚、早囊、囊胚及孵化囊胚,比较不同发育时期受体胚胎移植后妊娠率以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的孵化率,并对猪EG细胞显微注射针和固定针的规格进行了探讨。结果表明,显微注射的桑椹胚、早囊及囊胚移植后妊娠率为67%,而显微注射的孵化囊胚移植妊娠率为0,桑椹胚、早囊及囊胚移植后受体母猪妊娠率极显著高于孵化囊胚(P0.01),由桑椹胚、早囊及囊胚注射后移植获得了两头嵌合体仔猪;显微注射和未显微注射的猪胚胎其孵化率分别为47.54%和72.97%,未注射胚胎孵化率极显著高于注射胚胎(P0.01)。确定猪EG嵌合体制作过程中,注射针外径约为30μm,内径约为25μm;固定针外直径约为130~150μm,内径约为40μm。嵌合体制作时,胚龄宜早不宜迟,桑椹胚显微注射更易操作,而且导入的时期较早,ES/EG细胞在嵌合体组织中可以有很高的贡献率,故选择桑椹胚进行注射。在本试验条件下,显微注射对小鼠胚胎发育影响不大,对猪胚胎影响较大,说明猪胚胎显微注射条件需要进一步优化。     

转sMTPPGH基因小鼠胚胎的体外培养

采用纯化的羊金属硫蛋白（sMT)启动子指导的猪生长激素（PGH)基因(sMTPGH)为显微注射片段，将其导入小鼠受精卵原核，比较了几种不同培养液对导入外源基因的小鼠胚胎体外发育的影响。结果表明，改进的M16培养液（用mM16表示）能有效克服2－细胞阻断现象，并使转基因胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在mM16培养液的基础上，再加入表皮生长因子（EGF），可使1－细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在3和培养液（M16,mM16,mM16 EGF)中，转基因胚胎突破2－细胞阻断期的比率分别为12％，68％，90％，发育到囊胚期的比率分别是0％，20％，43％。采用PCR方法检测57枚经体外培养发育至囊胚的显微注射胚胎，4枚扩增出阳性条带，外源基因在囊胚期胚胎的滞留率为7％。