紫花苜蓿MsFPS基因超表达载体的构建及烟草转化

采用RT-PCR技术获得紫花苜蓿的法呢基焦磷酸合成酶基因,并连接到含有35S启动子和GUS基因的载体pBI121上,成功构建植物表达载体pBI-FPS.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得7株卡那霉素抗性苗,对其中的4株进行PCR检测,证明目的基因已经整合到烟草基因组中.进一步对这4株进行RT- PCR和组织化学染色法检测,初步证实目的基因在烟草中可以表达,说明已成功获得能够表达MsFPS基因的转基因烟草.     

捻转血矛线虫Hc38基因保守结构域所在片段的克隆及原核表达

参照捻转血矛线虫Hc38基因核酸序列(登录号:AY749124)的保守结构域设计1对引物,采用RT-PCR方法从绵羊捻转血矛线虫雌性成虫中扩增出约429 bp的cDNA序列,将其克隆到pMD19-T中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定.与AY749124序列同源性为99%.进一步将克隆基因与原核表达载体pPRO EX HTa构建重组表达载体,经IPTG诱导,能在DH5a细菌中表达了相对分子质量约17 000的融合蛋白.经Western blot等检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与捻转血矛线虫阳性血清发生特异性反应.     

犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因的原核表达

克隆了犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因并构建原核表达系统,并对表达产物进行了初步的血清学鉴定。利用PCR技术扩增犬布氏杆菌RM6/66参考株Omp31基因,然后将其克隆到pGEMT-easy载体上进行测序。测序正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot分析融合蛋白的免疫反应性。结果构建了犬布氏杆菌Omp31基因的原核表达载体pET-Omp31,并且在大肠杆菌中成功表达融合蛋白,经Western Blot鉴定该蛋白能被犬布氏杆菌阳性血清所识别。犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31的表达成功,为犬布氏杆菌病血清学诊断方法的建立提供了基础资料。     

新城疫病毒HN基因的克隆及在苜蓿中的表达

为了克隆新城痤病毒LaSota株HN基因,构建原核重组表达质粒pBI121-HN,使HN基因在苜蓿中表达,将新城疫病毒LaSota株接种于鸡胚,培养、纯化后收获鸡新城痤病毒,提取病毒RNA,经反转录后通过PCR扩增HN基因,克隆得到重组质粒pBI121-HN,井其通过电转化导入根癌农杆菌中,以根癌农杆菌为介导将HN基因导入苜蓿细胞.最终成功构建了重组表达质粒pBI121-HN,并通过根癌农杆菌转染苜蓿细胞将其在苜蓿中成功表达.本试骑为家禽的植物件苜蓿疫苗的研究奠定了基础.     

牛分支杆菌HBHA基因的克隆及原核表达

应用PCR技术扩增牛分支杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因并原核表达牛分支杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对该基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET28a(+)-HBHA,并转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经0.6mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,采用镍离子亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot检测表达结果。结果表明,牛分支杆菌HBHA基因完整的ORF全长600bp,编码199个氨基酸。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含有12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核及线粒体中,蛋白空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主。成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HBHA并在大肠埃希菌中得到了高效表达,分子质量大小为28ku,主要以可溶性形式存在。说明牛分支杆菌HBHA蛋白是一种抗原指数较高的亲水性蛋白,在原核系统能高效的表达,为进一步研究提供了理论基础。     

捻转血矛线虫Hc38基因部分功能域的原核表达与鉴定

为原核表达捻转血矛线虫Hc38基因的保守结构域,本研究参照GenBank中Hc38基因序列设计引物,扩增出Hc38基因的保守结构域序列,命名为HcP,将其克隆到表达载体pET32a中,并转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和western blot结果表明,HcP基因在大肠杆菌中高效表达,表达的重组蛋白分子量约为49.4 ku,并且表达产物能够与感染捻转血矛线虫的山羊血清产生特异的免疫印记条带,具有良好的反应原性.     

紫花苜蓿LEA基因超表达载体的构建及烟草转化

运用已克隆的紫花苜蓿MsLEA3-1基因构建植物超表达载体,将MsLEA3-1插入带有启动子rolD和终止子nos的表达载体pKYLX7中,酶切鉴定表明,目的基因已正确地插入载体中。用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得25株卡那霉素抗性苗,对其中的4株进行PCR检测,全都扩增出目的条带;进一步对这4株进行Southern杂交检测和RT-PCR检测,发现4株系均有杂交带出现且均发生了基因转录,说明已成功获得能够表达MsLEA3-1基因的转基因烟草。     

口蹄疫病毒VP1基因在转基因拟南芥种子中的表达及活性检测

构建了FMDV VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438/VP1,在根癌农杆菌GV3101的介导下,通过浸花法转化拟南芥花序,转基因拟南芥通过卡那霉素抗性筛选后,进行了目的基因PCR扩增和ELISA检测,对ELISA筛选的阳性植株进行Western blot检测,并对转基因拟南芥后代进行了目的基因PCR分析.结果表明,种子特异性表达载体p7SBin438/VP1构建正确,FMDV结构蛋白VP1编码基因已整合进拟南芥基因组并获得表达,表达蛋白具有免疫反应活性,转基因拟南芥后代分析表明VP1基因已经遗传给后代.本试验为将FMDV免疫基因向豆科植物种子中的转化提供了依据.     

紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及烟草转化

根据已经克隆得到的MsZIP基因(GenBank序列号:HQ911778),合成编码区cDNA,构建植物超表达载体PBI-MsZIP。将MsZIP基因插入到含有启动子35S和终止子nos的载体PBI121中, 酶切鉴定表明,目的基因已经正确的插入到载体中,超表达载体构建成功。采用CaCl₂冻融法将其转入农杆菌中,然后采用农杆菌介导的方法转化烟草(Nicotiana tobacum),共得到12株抗性烟草苗,选取其中长势良好的3株进行分析。结果表明:转基因烟草的PCR, RT-PCR和Southern-blot检测均得到了与目的条带大小一致的片段,说明已经成功获得了能够表达MsZIP基因的转基因烟草;进一步对转基因烟草进行组织化学染色分析,该基因在根、茎、叶中都可以表达。本试验为MsZIP基因功能的研究提供了理论依据和试验材料。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因转基因玉米植株的构建及鉴定

为构建猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因转玉米植株,本研究以玉米自交系"丹598"和"H99"的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对卡那霉素的敏感性试验,确定了卡那霉素40mg/L～56mg/L为愈伤组织适宜选择压。利用农杆菌介导法将TGEV S基因导入玉米自交系中,并对农杆菌转化系统的条件进行了优化。结果表明,根癌农杆菌EHA105的菌液OD600nm值为0.5～0.6时,侵染20min为农杆菌转化的最适条件。并对转化的愈伤组织进行分化诱导出苗后进行PCR和Southern blot检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。     

斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因的克隆及原核表达

为了筛选斯氏副柔线虫抗原基因用于血清学诊断和免疫防治研究,对斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因序列进行了生物信息学分析,RT-PCR扩增获得了Pj-CPR基因,构建重组表达质粒pETCPR后,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中并诱导表达获得重组蛋白rCPR。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,重组蛋白rCPR大小为17.6ku,主要以包涵体的形式表达,能与感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中IgG特异性结合,具有良好的抗原活性,可用于斯氏副柔线虫病血清学诊断方法和免疫防控研究。     

农杆菌介导的药百合鳞片遗传转化体系的建立

本试验以药百合鳞片高频再生体系为基础,研究了农杆菌介导的药百合鳞片遗传转化的几个影响因素。结果表明,预培养5 d有利于转化;共培养3 d并且添加100 μmol/L乙酰丁香酮有利于提高转化频率并抑制了农杆菌的过度生长;在侵染阶段添加150 μmol/L乙酰丁香酮,农杆菌侵染液pH 值5.7、光吸收值0.8,侵染时间10 min为最佳遗传转化体系。再生植株经gus基因的瞬时表达检测及hpt基因PCR检测证明载体已成功整合到药百合基因组中。     

紫花苜蓿MsZAT10基因的克隆及其在烟草中的功能验证

C2H2型锌指蛋白ZAT10在植物应对外界非生物胁迫中具有重要的作用。克隆得到紫花苜蓿C2H2型锌指蛋白MsZAT10基因。该基因开放阅读框全长762 bp,编码253个氨基酸。ZAT10蛋白含有2个单C2H2型保守结构域,有典型的QALGGH保守基序,属于C2H2型锌指蛋白。氨基酸序列比对和进化树分析表明,紫花苜蓿MsZAT10与蒺藜苜蓿MtZAT10亲缘关系最近,其氨基酸的相似性为76%。构建植物表达载体pCBM-MsZAT10,通过农杆菌介导法转化到烟草,经过草丁膦(PPT)抗性筛选和聚合酶链式反应(PCR)鉴定,获得25株阳性植株。荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明,MsZAT10基因在转基因株系中得到表达。选取3个转基因株系进行抗逆性分析,在-4 ℃条件下处理2 h,转MsZAT10基因烟草叶片的萎蔫程度和相对电导率均低于野生型烟草。在0 ℃条件下处理5 h,转MsZAT10基因烟草与野生型烟草相比积累更多的脯氨酸和可溶性蛋白,但丙二醛(MDA)含量要低于野生型烟草。另外,在300 mmol·L^-1 NaCl溶液中处理4 d,转MsZAT10基因烟草的打孔叶圆片仍保持绿色而野生型烟草明显失绿。以上结果表明MsZAT10基因在提高烟草对低温和盐胁迫的抗性方面具有重要的作用。     

鸭源鸡杆菌flfA基因的克隆表达及抗原性分析

用PCR方法从鸭源鸡杆菌中国分离株PDS-RZ-1-SLG中扩增flfA基因,并运用生物信息学软件分析鸭源鸡杆菌菌毛蛋白FlfA的二级结构、表面可及性与B细胞优势表位簇;将目的基因插入原核表达载体Pet28a(+),经PCR、酶切及测序鉴定成功构建重组表达质粒pET28a(+)-FlfA,然后转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组质粒表达;SDS-PAGE和Western blot鉴定FlfA的表达及抗原性。结果显示:成功获得与预期大小一致的573bp的flfA基因;FlfA蛋白结构分析显示其二级结构以无规则卷曲为主,表面存在很多抗原表位;PCR及酶切等鉴定表明重组表达质粒pET28a(+)-FlfA构建成功。SDS-PAGE分析显示,经IPTG诱导表达获得相对分子质量约20 000的重组蛋白;Western blot分析结果显示重组菌毛蛋白能被兔抗rFlfA多抗血清和鸡抗鸭源鸡杆菌血清识别,抗原性良好;而且,rFlfA多抗血清与菌毛蛋白具有良好反应性。     

捻转血矛线虫脂肪酶基因表达与生物学特性分析

选取捻转血矛线虫脂肪酶(Lipase)进行基因克隆、表达并对其生物学特性进行探究。PCR克隆捻转血矛线虫lipase基因,构建表达载体,获得融合蛋白质,采用Western blot检测该蛋白质的抗原特性;酯类酶解反应检测该融合蛋白质脂肪酶活性;实时定量PCR检测该基因在捻转血矛线虫不同发育阶段的转录情况;间接免疫荧光试验检验该抗原蛋白质在虫体组织的定位情况。结果表明,去除lipase基因信号肽序列后,基因片段长864bp,融合蛋白质大小50ku;该融合蛋白质在37℃左右、pH为7的条件下酶活力最高;雄性成虫lipase转录量相对虫体其他阶段最高;该抗原蛋白质主要表达于虫体表皮和肠腔。Lipase具有较好的抗原性,可能与捻转血矛线虫发育和宿主免疫调节有关,深入研究捻转血矛线虫Lipase的特性对寻找新的免疫保护性抗原和药物靶标具有意义。     

Lyz-GFP双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化

利用农杆菌介导法将溶菌酶(Lyz)与绿色荧光蛋白(GFP)基因转入"甘农1号"杂花苜蓿(Medicago sativa Martyn)和"甘农3号"紫花苜蓿(Medicagosativa L.)品种中,获得含有该双元基因的苜蓿转基因愈伤组织;采用荧光检测和PCR扩增技术,检测到溶菌酶Lyz和绿色荧光蛋白GFP基因在苜蓿愈伤细胞中的表达;研究该双元基因在苜蓿品种"甘农1号"和"甘农3号"中转化的若干影响因素,确定适宜的转化条件以期提高基因转化效率。结果表明:75 mg·L^-1的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长具有显著抑制效应;300mg·L^-1头孢霉素能够有效地抑制农杆菌LBA4404的生长;OD₆₀₀值为0.4-0.5的农杆菌适宜的侵染时间是10min;经预培养3-4d的材料侵染后再共培养3d之后,在愈伤组织诱导培养基MS₊2,4-D 2.0mg·L^-1+KT0.5 mg·L^-1+0.6%琼脂+2.5%蔗糖的培养基上诱导出抗性愈伤组织;"甘农1号"和"甘农3号"的抗性愈伤组织诱导率分别为35%和32%。     

猪圆环病毒2型去核定位信号ORF2基因的原核表达与初步应用

根据PCV2-871病毒株的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去核定位信号的Cap基因（ORF2）。通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切位点将其克隆到表达载体pQE-32中,转化大肠杆菌M15。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定,表明去核定位信号的Cap蛋白可以大量表达。Western blot、ELISA鉴定蛋白活性。继而。以重组蛋白为抗原包被ELISA板,对28份临床样品进行检测。结果表明,该蛋白具有良好的抗原活性,可以作为抗原应用于临床样品的检测。     

转露地菊CgDREB22基因的烟草抗逆性分析

DREB转录因子是AP2/ERF转录因子的一个亚家族,主要参与植物对干旱、高盐和低温等逆境的分子应答机制。前期研究从露地菊中分离出一个CgDREB22基因,构建植物过表达载体并用农杆菌介导法转化烟草。对获得的T₁代转基因烟草种子和幼苗进行高盐(150 mmol·L^-1 NaCl )、干旱(150 mmol·L^-1甘露醇)、低温(4 ℃)等处理,进而观察表型并测定相关生理指标。结果表明:在低温、干旱和高盐胁迫下,转基因烟草幼苗鲜重和根长都低于野生型;在高盐和干旱胁迫下,转基因烟草幼苗脯氨酸含量、抗氧化物酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)]活性均显著低于野生型。综上说明,露地菊CgDREB22基因在植物受到非生物胁迫的过程中起负调控的作用。     

粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶基因的克隆、表达及定位分析

虾青素金属蛋白酶是一种广泛存在于多种动物体内的金属蛋白酶，研究表明该蛋白酶在寄生线虫的入侵和生长发育过程中发挥重要作用。但目前对粪类圆线虫虾青素金属蛋白酶(Ss-AST-1)还所知甚少，研究旨在对该酶编码基因(Ss-ast-1)进行鉴定和表达分析，为进一步研究其功能奠定基础。利用生物信息学方法对Ss-ast-1基因进行序列分析，通过转录组数据分析Ss-ast-1在各个发育阶段的转录水平，转基因技术进行虫体内表达定位分析。通过体外原核表达重组蛋白，Western blot分析其抗原性。采用免疫荧光组织化学方法对Ss-AST-1在粪类圆线虫幼虫体内的定位进行研究。结果显示：Ss-ast-1基因全长1 905 bp,编码634个氨基酸；转录组分析该基因在iL3期的表达水平最高。定位分析表明该蛋白在虫卵细胞的细胞核和细胞质均有表达；体外表达重组蛋白的大小约67.5 kDa, Western blot分析表明多克隆抗体可以较好的识别全虫蛋白中的Ss-AST-1。免疫荧光结果显示Ss-AST-1在幼虫体内表达并分布幼虫的头部和体壁。Ss-ast-1属于虾青素金属蛋白酶家族，其可能在寄生虫入侵过程中...     

紫花苜蓿DExD/H box RNA解旋酶基因的克隆与分析

基于紫花苜蓿(Medicago sativaL.)盐胁迫抑制消减杂交文库中的一条EST序列,使用RACE技术克隆得到一条1678 bp的cDNA序列.核酸序列分析表明该cDNA序列包含一个1281 bp的最大开放阅读框,编码426个氨基酸,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)RNA解旋酶RH15和RH56的氨基酸序列相似性在90％以上,将该基因命名为MsRH(GenBank序列号:JX508648).对此基因编码蛋白进行结构域预测表明其含有明显的DEXDc和HELICc结构域,预测其为DExD/H box RNA解旋酶.洋葱(Allium cepa)表皮细胞亚细胞定位分析表明MsRH定位于细胞核.为进一步研究此基因的功能,构建了MsRH基因的超表达载体pBI-MsRH,使用农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tobacum),筛选得到5株具有卡那霉素抗性再生烟草植株.PCR和RT-PCR检测结果表明MsRH基因成功插入烟草基因组中并表达.使用250mMNaCl处理7d后,转基因烟草中脯氨酸含量低于野生型烟草,而丙二醛和相对电导率则高于野生型烟草.初步试验结果表明转MsRH基因烟草对盐敏感性升高.