广西地区一株新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及σC基因遗传进化分析

为了解广西地区新型鸭呼肠孤病毒(novel Duck reovirus, NDRV)的分子流行病学特征并揭示其遗传变异情况,试验采用RT-PCR方法对某鸭场送检的病料进行病原鉴定,将鉴定为阳性的样品接种于9～10日龄SPF鸡胚尿囊腔进行病毒的分离,对分离到的毒株的σC基因进行扩增、克隆和测序,并与参考毒株σC基因序列进行比对分析,绘制系统进化树。结果表明：分离到一株NDRV毒株,命名为NDRV-GX株。该分离毒株与NDRV代表毒株高度同源,核苷酸相似性为92.5%～100%,氨基酸相似性为94.2%～100%;而与番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus, MDRV)及禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)分离毒株的核苷酸相似性为26.7%～37.2%,氨基酸相似性为27.8%～38.1%;与MDRV、ARV分离毒株处于进化树的不同分支,而与其他NDRV代表毒株处于同一分支。说明该分离毒株为NDRV,与NDRV代表毒株具有相近的遗传演化关系,同属于基因2型。     

鹅源新型鸭呼肠孤病毒广西株G-NDRV-GX-2022全基因组分子特征的分析

为研究鹅源新型鸭呼肠孤病毒的全基因组分子特征及其广西流行株的进化特点,本研究采集广西地区3份发病鹅的肝脏、脾脏、肺脏及肾脏病料样品,采用多重荧光定量RT-PCR (RT-qPCR)检测番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(NDRV),并以NDRV阳性样品的核酸为模板,采用RT-PCR分段扩增其全基因组并测序,采用BioEdit软件分析其全基因组序列的相似性;采用NetNGlyc 1.0软件预测NDRVσC蛋白N-糖基化位点;通过Mega 7.0软件绘制σ系列基因的系统发育树及RDP5和SimPlot软件分析NDRV全基因组的重组事件。RT-q PCR结果显示,检出1份NDRV阳性样品,经测序及序列拼接,获得一条鹅源NDRV广西流行株G-NDRV-GX-2022全基因组序列,全长23 353 bp,分为L1～L3、M1～M3及S1～S4共10个基因;BlAST分析结果显示,G-NDRV-GX-2022株10个基因与GenBank中相应基因序列的相似性最高为91.2%～98.4%,对应的病毒株均源自中国广东、福建、山东、浙江及湖北等地的NDRV,宿主有野鸭、番鸭、绿头鸭等,表明G-...     

一株肉鸡呼肠孤病毒变异株的分离鉴定

旨在研究肉鸡呼肠孤病毒分离株致病与基因组变异情况。2017年从山东潍坊地区跗关节肿胀、出血严重商品肉鸡中收集病料,进行病毒分离,通过RT-PCR检测、电镜观察对病毒进行鉴定;将分离到的病毒回归商品肉鸡;设计18对引物对分离株全基因组扩增测序,并进行了遗传进化分析;将分离毒株与经典毒株S1133进行血清交叉中和试验。结果表明分离到一株禽呼肠孤病毒(命名为WF17),回归商品肉鸡能完全复制出临床症状,并能从试验鸡中重新分离到该病毒。该分离株基因组完全符合禽呼肠孤病毒基因组结构特点,主要抗原σC蛋白基因与台湾918株最接近,相似性为92.7%,与S1133株的相似性只有55.9%。WF17株与S1133株的抗原相关指数(R值)只有0.19。目前以S1133株为主的商品化疫苗无法对禽呼肠孤病毒变异株产生有效保护。     

1株新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

山东某鸭场疑似发生新型鸭呼肠孤病,从采集的病料组织样品中分离出1株病毒,经一步法RT-PCR扩增得到新型鸭呼肠孤病毒部分S3基因序列,克隆到p MD18-T载体中,经序列测定,与Gen Bank上的毒株序列进行比对,并做了该病毒的致病性试验。结果显示,该分离株与参照的新型鸭呼肠孤病毒同源性为100%,并对鸭具有一定的致病性。本试验成功分离获得1株新型鸭呼肠孤病毒山东地方流行毒株。     

新型鸭呼肠孤病毒DRV-XX株全基因组序列测定及分析

本研究自广东省新兴地区疑似新型鸭呼肠孤病料样品中分离出一株病毒,命名为DRV-XX株。利用RT-PCR方法对DRV-XX株进行全基因组序列扩增,拼接获得其全基因组(23 419 bp),对其10个基因节段进行分析显示,该分离株与禽呼肠孤病毒(ARV)及番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的相似性较低,而与国内新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck reovirus,NDRV)相似性较高(99%),表明该分离株为NDRV。对其10个RNA节段分别进行测序及遗传进化分析,其中S3基因序列分析显示,DRV-XX与MDRV共同构成一主干支,与其S1、S2、S4、M1、M3、L1基因的一致;而M2基因进化树显示,DRV-XX与ARV处于同一主干支;由L2、L3组基因分析显示,DRV-XX与ARV在同一主干支,并有MDRV参与其中,而另一主干支为MDRV。因此,推测DRV-XX株的不同基因组节段来源不同,可能是ARV和MDRV发生同义突变,也可能是基因重组的结果。该研究丰富了NDRV的基因库相关信息,也为广东地区NDRV的防制提供一定参考依据。     

新型鸭呼肠孤病毒QY株S3基因克隆与序列分析

参考GenBank新型鸭呼肠孤病毒（New-type duck reovirus,NDRV）S3基因序列设计合成一对引物,对新型鸭呼肠孤病毒QY株S3基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序.结果显示扩增产物为1 104 bp,与预期的目的片段大小一致.相似性分析QY株S3基因核苷酸序列与ARV代表株、MDRV代表株和DRV代表株,相似性分别59.4％ ～ 60.0％、61.1％～ 61.3％和96.7％～ 98.6％;氨基酸的相似性分别为67.6％～ 68.7％、68.1％～68.9％和95.4％～ 98.4％.表明QY株的S3基因具有不同于ARV和MDRV的特征,分离病毒QY株是不同于禽呼肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒的独立基因群.     

中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB株S4基因序列分析

应用非免疫番鸭胚增殖中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株,用LSTRIAZOL提取病毒RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增中国禽(番鸭)呼肠孤病毒YB分离株S4基因节段cDNA.将S4cDNA克隆到PMDl8-T载体上,并进行了鉴定和核苷酸序列测定.序列分析结果,克隆的S4cDNA共1 124bp,包括非编码区和完整的阅读框架.分子进化系统分析表明该毒株与禽呼肠孤病毒(鸡呼肠孤病毒)的亲缘关系较远,DRV-YB与DRV-89330同缘率为93.3%.     

山东地区新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

为了解山东地区肉鸭呼肠孤病毒的流行情况,从山东地区收集肉鸭坏死脾脏病料,经研磨处理,接种鸭胚,对分离病毒进行PCR扩增和σC基因测序分析。PCR扩增结果显示共分离得到6株病毒,测序结果显示,6株病毒σC基因核苷酸同源性为99.0%～100.0%,与新型呼肠孤病毒毒株核苷酸同源性为93.7%～99.3%。由此确定,分离的6株病毒均为新型呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)。该研究为山东地区NDRV的防控提供一定参考依据。     

新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及板蓝根合剂的预防效果评价

本研究对采自山东不同地区的疑似鸭呼肠孤病毒感染病料样品进行了病原的分离与鉴定,成功分离出5株鸭呼肠孤病毒,根据鸭呼肠孤病毒σC蛋白的基因序列,利用RT-PCR技术对分离株进行了鉴定。结果表明,分离株σC基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%～99.6%和94.4%～99.7%,与新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）的σC基因的核苷酸同源性为96.9%～98.6%。基于σC基因的遗传进化分析表明5个分离株均符合NDRV的分布特点,且与禽呼肠孤病毒（ARV）和番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的亲缘关系相对较远,均属于新型鸭呼肠孤病毒。进一步对板蓝根合剂的预防效果进行了研究,结果显示,板蓝根合剂药物-攻毒组的发病率显著低于攻毒组。本研究成功分离鉴定出5株NDRV,并发现板蓝根合剂对鸭呼肠孤病毒病具有良好的预防效果,能够有效抵抗NDRV的感染,这为今后新型鸭呼肠孤病毒病的预防提供了新的思路。     

一株鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及其致病性研究

为了确诊临床雏鸭"肝脾坏死症"的致病原,试验取患"肝脾坏死症"死亡雏鸭的肝脏和脾脏制备病料滤液,用其接种SPF鸭胚并分离病原,对分离病原进行相关研究。结果表明:病料滤液传至第6代时对鸭胚的有效致死率为94.44%,死亡鸭胚胚体有出血斑点,肝脏和脾脏有坏死灶;病原经RT-PCR扩增确诊为鸭呼肠孤病毒(DRV),基因片段与NCBI中10株水禽呼肠孤病毒比对同源性为95.5%～97.3%,将其命名为鸭呼肠孤病毒JS株;该病毒对氯仿不敏感,对1%鸡红细胞悬液无凝集性,对鸭胚的半数致死量为1×10~(-3.24)ELD_(50)/0.1 mL,对雏鸭的半数感染量为1×10~(-3.49)ID_(50)/mL;人工感染雏鸭5 d后扑杀,取肝脏和脾脏制做病理切片,病理切片显示肝脏和脾脏损伤明显。说明临床雏鸭患"肝脾坏死症"的致病原为鸭呼肠孤病毒,鸭呼肠孤病毒JS株可作为候选毒株用于该病的进一步防控研究。     

山东地区新型鸭呼肠孤病毒致病特点与变异分析

本研究将2011~2018年从山东地区分离到的8株新型鸭呼肠孤病毒进行了毒力和致病性试验,结果显示,8株毒株对鸭胚、鸭胚成纤维细胞、雏鸭的致病性基本一致,鸭胚毒价为10-5.00~10-6.00/0.1 m L,鸭胚成纤维细胞的毒价为10-5.33~10-6.30/0.1 m L;对8株毒株的主要抗原σC蛋白核苷酸和氨基酸序列进行比对分析,结果显示,核苷酸同源性为94.5%~99.6%,氨基酸同源性为95.0%~99.4%;通过绘制遗传进化树发现,与全国其他地区毒株相比,山东地区分离的这8株分离株处于一个独立分支,并且这8株分离株的遗传进化与时间有着密切的相关性,暗示山东地区新型鸭呼肠孤病毒随着时间的推移在不断发生着变异。     

鸭坦布苏病毒江苏XZ株的分离和鉴定

从江苏徐州地区分离到的以引起樱桃谷鸭产蛋下降和死亡为特征的1株病毒,命名为XZ株。对该病毒进行电镜观察、血凝试验、ELD₅₀测定、RT-PCR扩增特异性目的基因、序列比对分析和动物回归试验。结果显示,分离毒株能致死鸭胚和鸡胚,电镜下观察到球形病毒粒子,不具有血凝性,对病料和接毒鸭胚尿囊液进行RT-PCR,均可扩增出基因片段,其核苷酸序列与坦布苏病毒奉贤株的相似性最高,为98.7%,与其他坦布苏病毒的毒株也具较高同源性,为86%~98%。用鸭胚分离毒株接种健康产蛋鸭,能复制出同样的疾病。结果表明分离病毒为鸭黄病毒属的坦布苏病毒。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因片段的克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计合成一对引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序.结果显示扩增产物为300bp,与预期的目的片段大小一致,经PCR、酶切反应鉴定后克隆到pGEM-Teasy载体中,核苷酸序列经BLAST软件分析表明:番鸭呼肠孤病毒MW9170株S1基因的目的片段与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为91.7%,与鸡关节炎病毒S2基因同源性为68.7%,结果提示番鸭呼肠孤病毒MW9710株与鸡关节炎病毒亲缘距离较远.     

鸭肝炎病毒FC64株的全基因组序列测定与分析

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种鸭的重要传染病,弱毒苗可有效预防该病的发生.从临床上分离获得一株DHV强毒株,经SPF鸡胚传64代后,培育成为弱毒株,命名为FC64.为了对该弱毒疫苗进行遗传背景分析,测定了该毒株的全基因组序列,经分析表明,FC64属于血清1型DHV弱毒株,基因组长度为7 692 bp(未...     

一株樱桃谷种鸭胚源鸭3型星状病毒分离鉴定与序列分析

对广西某种鸭场送检的入孵后死亡樱桃谷种鸭胚用血琼脂平板进行细菌分离为阴性。应用RT-PCR方法进行禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、鸭甲肝病毒等10种病毒的检测,结果仅鸭星状病毒(DAstV)为阳性。用鸭胚从阳性样品中分离到一株病毒,命名为GX1806株。对该毒株RNA依赖的RNA聚合酶基因进行测序,结果显示与GenBank发布的鸭3型星状病毒(DAstV-3)CPH毒株序列同源性高达98%,与DAstV-1及DAstV-2毒株序列同源性在69%～72%之间,表明该批死亡樱桃谷种鸭胚存在DAstV-3感染。     

鸭甲型肝炎病毒JS2013株的鸭胚适应性与基因组分析

鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)是引起雏鸭病毒性肝炎的主要病原之一。本研究将2013~2015年分离的5株DHAV进行了鸭胚传代复苏,发现JS2013株的鸭胚适应性最好,可导致鸭胚在接毒后2~5d出现有规律的死亡。应用血凝试验和PCR方法进行了鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭圆环病毒(Du CV)等的检测,结果均为阴性。将DHAV JS2013株继续在鸭胚传代并测定其病毒滴度,发现其在5至8代之间病毒滴度稳定提升,第8代病毒的ELD50为10-7.5/0.1m L,但8至20代没有出现有规律的病毒滴度提升。为了揭示DHAV JS2013株的基因组特征,应用RT-PCR方法分9段扩增了病毒基因片段,通过序列拼接获得了全基因组序列,Gen Bank登录号为KP721458。同源比对发现,与DHAV JS2013株基因同源性最高的毒株属于基因I型DHAV。将其编码多聚蛋白的序列与同源性最高的10株已登录序列的DHAV毒株进行比对,发现存在8处氨基酸位点变异。该研究探明了DHAV JS2013株在鸭胚的增殖特性及其基因特征,为研制新型鸭肝炎病毒灭活疫苗奠定基础。     

2株3型鸭甲肝病毒广东分离株的鉴定与遗传进化分析

为了解广东省某两个养殖场发生的疑似鸭病毒性肝炎病例感染的病原体,试验对两个养殖场送检的2份病料采用RT-PCR、病毒分离和序列分析等方法对病毒进行鉴定;病料处理后接种10日龄SPF鸭胚、9日龄SPF鸡胚尿囊腔进行病毒分离,并扩增病毒全基因组及VP1基因,利用DNAStar 7.0和MEGAⅩ对分离株与GenBank中公布的相关病毒株序列进行同源性比对、氨基酸序列比对并构建系统进化树。结果表明：从病料中成功分离并鉴定2株3型鸭甲肝病毒(DHAV-3),分别命名为GD18株和GD21株;2份病料攻毒均未引起鸡胚的死亡与明显病变,但引起了鸭胚的发育不良,且GD21株可引起鸭胚死亡,死亡胚体出现全身性出血、充血等特征性病变;分离的2株DHAV-3均属于GⅠ基因型,且与之前在广东省流行的FS株、GD株和C-GY株等毒株亲缘关系较远,而与广东省外流行毒株SD株、JS株、CH株和EY株等亲缘关系较近。与参考株氨基酸序列比对,GD18株在第49位和第67位出现2个新的突变位点,而GD21株没有出现新的突变位点。说明在广东省内鸭群中可能存在由于引种或贸易过程而引入的DHAV-3新毒株的流行。     

广西新型鸭呼肠孤病毒流行毒株GX01-2020全基因组分子特征分析

为了解广西新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus, NDRV)流行毒株的分子遗传特征,采用RT-PCR分段进行全基因组序列扩增,经克隆、测序、拼接后,获得1株NDRV全基因组序列(命名为GX01-2020株)。结果显示,GX01-2020株基因组全长23 353 bp,分为10个片段,大小从1 194 bp(S4)至3 958 bp(L1)不等。同源性分析显示,GX01-2020株10个片段核苷酸同源性与NDRV代表毒株最高,为86.2%～99.4%,其中μB片段核苷酸同源性最低的毒株为番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus, MDRV),其他片段则为鸡源禽呼肠孤病毒(chicken-origin reovirus, CRV),说明不同片段来源祖先不完全相同。遗传进化分析显示,10个片段遗传进化树中,L2、L3片段中MDRV参考毒株及σA片段中NDRV参考毒株均形成两个进化分支,与其他片段不同,说明不同片段与参考毒株的遗传关系不尽相同。重组分析显示,GX01-2020株的L1片段存在重组信号,重组亲本毒株分别为北京MDRV＿J18株和福建DRV＿N...     

禽呼肠孤病毒C-98分离株M1基因的克隆及序列分析

参考GenBank发表的禽呼肠孤病毒M1基因序列设计2对引物（M1-1、M1-2）。应用RT-PCR扩增禽呼肠孤病毒内蒙古分离株C-98的M1基因序列。将纯化的目的基因片断与PMD19-T载体连接并转化DH5α感受态细胞，将经鉴定为阳性的重组菌送生物工程公司测序。结果表明,ARVC-98株M1基因片段长2283bp，具有完整的开放性阅读框架，编码732个氨基酸残基的μ1蛋白。ARVC-98分离株M1基因与ARV参考毒株M1的核苷酸同源性为89．1％～99．7％，与哺乳动物M1基因序列同源性较低，约为28％。     

鸭坦布苏病毒江西株的分离与鉴定

2015年9月,江西省乐平市等地相继暴发了以产蛋量大幅下降为特征的传染病,为了明确病因,对病原进行了鉴定、特异性目的基因片段扩增和动物回归等试验。结果显示:分离毒(命名为JX01株)能致死鸭胚和鸡胚,不凝集鸡红细胞;对病料和接毒鸭胚尿囊液进行RT-PCR,可扩增出特异性基因片段,其核苷酸序列与鸭坦布苏病毒BYD-1株的相似性为92.1%;用鸭胚分离毒接种300日龄蛋鸭,能够复制出产蛋量下降病例。分析表明,分离毒为鸭坦布苏病毒,该病毒是引起此次鸭病疫情的病原。