猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)分离鉴定及其与欧、美PRRSV抗原的比较

在我国吉林省某地猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）抗体阳性猪群的４头２日龄弱仔猪实质脏器中分离到２株ＰＲＲＳＶ。间接荧光抗体试验（ＩＦＡ）结果表明,ＰＲＲＳＶ（ＬＶ．ＶＲ－２３３２）抗血清与２个分离株呈阳性反应;分离到病毒的弱仔猪血清与参考株（ＬＶ．ＶＲ－２３３２）也呈阳性反应;而分离株与ＨＣＶ、ＰｒＶ、ＰＰＶ、ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ和ＨＥＶ无交叉抗原。以上试验证明,我们已成功地分离到２株地方性ＰＲＲＳＶ。进一步用六种ＰＲＲＳＶ单抗（Ａ～Ｆ）进行ＩＦＡ试验,结果２个分离株与ＶＲ－２３３２的荧光反应谱相同。说明它们之间在抗原结构上具有同源性。     

中国结东地区猪生殖—呼吸道综合征病毒（S1株）ORF5—7基因特？…

本研究对我国华东地区猪生殖和呼吸综合征病毒分离株Ｓ１主要结构蛋白基因进行了ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ测序分析。结果表明，长度为１５２０ｂｐ ＤＮＡ序列含有３个阅读框ＯＲＦｓ，即ＯＲＦ５，ＯＲＦ６和ＯＲＦ７，ＯＲＦ５和ＯＲＦ６及ＯＲＦ６和ＯＲＦ７间有部分碱基重叠，且与欧洲一美洲型ＰＲＲＳＶ相似。     

中国华东地区猪生殖-呼吸道综合征病毒(S_1株)ORF_(5～7)基因特征研究

本研究对我国华东地区猪生殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）分离株Ｓ１主要结构蛋白基因（ＯＲＦ５～７）进行了ＰＣＲ扩增和ＤＮＡ测序分析。结果表明，长度为１５２０ｂｐＤＮＡ序列含有３个阅读框ＯＲＦｓ，即ＯＲＦ５、ＯＲＦ６和ＯＲＦ７，ＯＲＦ５和ＯＲＦ６及ＯＲＦ６和ＯＲＦ７间有部分碱基重叠，且与欧洲型和美洲型ＰＲＲＳＶ相似。ＯＲＦｓ推导的氨基酸序列与美国ＶＲ２３３２和欧洲ＬＶ毒株同源性分析为９９％～１００％和５９％～７８％。ＯＲＦｓ预测的蛋白质分子量、等电点、糖基化位点、亲水性分布图及跨膜螺旋区与ＶＲ２３３２毒株相似。     

应用间接免疫荧光法检测禽网状内皮组织增生病病毒抗体的研究

用禽网状内皮组织增生病病毒（ＲＥＶ）感染ＳＰＦ鸡胚次代成纤维细胞涂片为抗原,建立了检测ＲＥＶ抗体的间接免疫荧光法（ＩＦＡ）。确定了待检血清稀释度１∶６４和兔抗鸡ＩｇＧ荧光抗体的稀释度１∶３２的工作浓度。应用该ＩＦＡ方法对人工感染ＲＥＶ的２０只３０日龄ＳＰＦ鸡进行了检测,接种后４天时均呈阴性反应,７天时８只鸡呈阳性反应,１４天２０只全部呈阳性的反应。通过对ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＡＬＶ、ＭＤＶ、ＣＩＡＶ、ＡＩＶ等标准阳性血清的交叉试验,证明该方法特异性强。应用该ＩＦＡ方法对我国辽宁、山东、黑龙江省部分鸡群进行ＲＥＶ抗体检测,证明该方法特异性强、敏感性高,适于在生产中推广应用。     

我国马流感病毒不同分离株实验感染SPF鸡的研究

本试验分别用马流感病毒吉林株、青海株和北京株人工感染ＳＰＦ鸡，通过ＨＩ价测定、临床观察，病毒分离以及病理观察，证明马流感病毒可在ＳＰＦ鸡体内激发短期的免疫应答，在各实质器官引起轻微的损害，但无明显临床症状，病毒分离阴性。     

狂犬病病毒糖蛋白基因主要功能区的克隆和序列比较分析

对我国不同来源的狂犬病野毒株８２０２、ＢＲＶ、ＭＲＶ以及无毒疫苗株ＳＲＶ９的Ｇ基因４０５～１１４４位核苷酸序列进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆和序列测定，并应用计算机对其进行了分析比较。结果证明，鹿源８２０２株与中国人用疫苗株为同源株（同源性达９７．０％），因此我国鹿狂犬病极可能是人用疫苗毒株污染所致；同地不同动物分离的ＭＲＶ株和ＢＲＶ株为亲缘关系较远毒株，表明ＢＲＶ引起的牛狂犬病不是由于ＭＲＶ感染所致；疫苗株ＳＲＶ９与３个野毒株同源性在８３％～８４％之间。３个野毒株８２０２、ＢＲＶ、ＭＲＶ及疫苗株ＳＲＶ９的糖基化位点和抗原决定簇内某些氨基酸亦不同。由计算机建立的系统树首次证明我国存在着狂犬病病毒基因亚型。８２０２、ＭＲＶ、ＳＲＶ９和其他对照株的同源性在８５．３％以上，为Ⅰａ亚型；ＢＲＶ与它们的同源性仅为８２．３％，被分为Ⅰｂ亚型。从而证明我国存在亲缘关系较远的狂犬病野毒株     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的…

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒）、对病毒进行纯一提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆人ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ Ｉ双酶切法、ＰｓｔＩ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，ａｑｔ     

不同启动子对重组痘苗病毒表达狂犬病病毒糖蛋白基因的影响

以血凝素（ＨＡ）基因为侧翼，将狂犬病病毒糖蛋白基因ｃＤＮＡ置于不同类型的痘苗病毒复合启动子下游，构建了４种表达质粒。重组表达质粒转染已感染ＷＲ株痘苗病毒的ＢＨＫ２１细胞，并通过鸡红细胞吸附试验，筛选、纯化出与表达质粒对应的４组ＨＡ－重组痘苗病毒：ｖＳＦＪ１－１０ＲＶｇｐ，ｖＳＦＪ２－１６ＲＶｇｐ，ｖＲＪ１－１０ＲＶｇｐ，ｖＲＪ２－１０ＲＶｇｐ。经间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）鉴定，从４组重组病毒中每组各鉴定出１株阳性重组病毒。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示，重组病毒感染的ＢＨＫ２１细胞裂解物上清中有１种蛋白与抗ＲＶＧＰ的ＭｃＡｂ发生特异反应，分子量为６９０００。在重组病毒感染早期，ＲＶＧＰ的表达量以ｖＳＦＪ１－１０ＲＶｇｐ最高；而在感染晚期，则以ｖＳＦＪ２－１６ＲＶｇｐ最高。４株重组病毒免疫小鼠，均能够不同程度地诱导小鼠产生抗ＲＶＧＰ特异性抗体。     

应用IIF筛选抗口蹄疫和抗猪水泡病病毒单抗的研究

应用间接免疫荧光方法（ⅡＦ）进行筛选，获得３株稳定分泌特异性抗口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）单抗的杂交瘤细胞的２株稳定分泌特异性抗猪水泡病毒（ＳＶＤＶ）单抗的杂交瘤细胞。ＩＩＦ重复测试阳性和阴性杂交瘤细胞上清，结果完全相符。ＩＩＦ特异性试验表明，３株抗ＦＭＤＶ单抗只与ＦＭＤＶ反应，而不与相关的ＳＶＤＶ和ＰＤ１５细胞反应，反之２株抗ＳＶＤＶ单抗只与ＳＶＤＶ反应，而不与ＦＭＤＶ和ＰＤ１５细胞反应。实验证明，Ｉ     

微量PCR检测鸡马立克氏病病毒早期感染

为了建立一种监测鸡群马立克氏病病毒（ＭＤＶ）早期感染的微量ＰＣＲ方法,根据血清Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）基因组ＢａｍＨＩ－Ｌ片段的核酸序列设计了１对寡核苷酸引物,用含０．３ＵＴａｑ酶的１０μＬ反应体系分别扩增了ＭＤＶ１型（京－１株、ＭＤ１１／７５ｃ株）、ＭＤＶ２型（ＳＢ－１株）和ＨＶＴ（ＦＣ－１２６株）的核酸,并用京－１株感染细胞ＤＮＡ作了敏感性试验。结果显示,该引物对ＭＤＶ１型病毒特异,京－１株和ＭＤ１１／７５ｃ株都扩增到４２５ｂｐ的核酸条带,而ＳＢ－１株、ＦＣ－１２６株和正常ＣＥＦ细胞的ＤＮＡ都没有得到任何条带;敏感性试验结果表明,微量ＰＣＲ能够检测到０．１ｐｇ的京－１株感染细胞ＤＮＡ;对京－１株感染鸡,在接种后第５天就能在血液细胞中检测到ＭＤＶＤＮＡ。微量ＰＣＲ可望成为监测鸡群ＭＤＶ早期感染的一种快速、有效的方法。     

猪生殖和呼吸综合征中国分离株ORF7基因的克隆及鉴定

本研究利用对应于ＡＴＣＣＶＲ－２３３２及ＬＶＯＲＦ７基因保守序列的１对均为２８个碱基的引物１００１１ＰＣＳ、１０１０ＰＣＲ对ＰＲＲＳＶ中国分离株Ｂ１３进行ＲＴ－ＰＣＲ，结果扩增出了１条包括完整ＯＲＦ７基因的５１０ｂｐ的ＤＮＡ片段。纯化此扩增产物，并对其进行ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ双酶切，与用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ双酶切及碱性磷酸酶处理的ＰＵＣ１８载体连接。转化大肠杆菌。结果得到了１个Ｂ１３ＯＲＦ７基因与ＰＵＣ１８载体的重组质粒ＰＵＣ１８Ｂ１３ＯＲＦ７１０。通过ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ及ＰＣＲ证明此重组质粒即为Ｂ１３ＯＲＦ７基因与ＰＵＣ１８载体的重组质粒。从而为ＯＲＦ７基因及所表达的核衣壳蛋白进一步研究奠定了基础。     

PCR法检测血清I型马立克氏病病毒及其敏感性试验的研究

以人工合成的针对血清Ｉ号马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）Ａ抗原基因（ｇＡ）部分序列的两端寡聚核苷酸为聚合酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对马立克氏病病毒血清Ｉ型（京－１株，ＭＤ１１／７５Ｃ株）；２型（ＳＢ－１株）；３型（火鸡疱疹病毒的ＦＣ１２６株）毒株和ＧＡ株ＢａｍＨＩ Ｂ片段的ＰＡＣＹ１８４克隆重组质粒ＤＮＡ进行基因扩增反应及其敏感性试验。结果表明，该引物不仅对ＭＤＶ１具有较强的特异性，而且由此引物引导     

猪生殖—呼吸道综合征病毒（PRRSV）分离鉴定及其与欧,美PRRSV …

在我国吉林省某地猪生殖呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）抗体阳性猪群的４头２日龄弱仔猪实质脏器中分离到２株ＰＲＲＳＶ,间接荧光抗体试验（ＩＦＡ）结果表明,ＰＲＲＳＶ（ＬＶ．ＶＲ－２３３２）抗血清与２个分离株呈阳性反应;分离到病毒的弱仔猪血清与参考株（ＬＶ．ＶＲ－２３３２）也呈阳性反应,而分离株与ＨＣＶ,ＰｒＶ,ＰＰＶ,ＴＧＥＶ,ＰＥＤＶ和ＨＥＶ无交叉抗原,以上试验证明,我们已成功地分离到２株地方性ＰＲ     

狂犬病病毒不同毒株蚀斑特性的动态学研究

应用已建立了狂犬病病毒的蚀斑方法，对狂犬病病毒的强毒株鹿８２０２株，弱毒株Ｆｌｕｒｙ及无毒变异ＳＲＶ９的蚀斑特性做了比较研究，发现不同的狂病病毒株其蚀斑特性存在一定的差异。     

用PCR技术从同一兔出血症病料扩增和检出2种病毒核酸

应用 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术，对兔出血症病毒核酸作了鉴定。分别设计合成 ２ 对 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增特异性引物，即按兔出血症病毒中国分离的 Ｎ Ｊ株核酸序列合成 １ 对引物（ Ｎ Ｊ引物），按德国分离的 Ｆ Ｒ Ｇ 株核酸序列合成另 １ 对引物（ Ｆ Ｒ Ｇ 引物），进行 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ。从纯化的病毒核酸样品和感染 Ｄ Ｊ Ｒ Ｋ 细胞的病毒核酸样品中，均扩增出 ２ 对引物范围内的特异性核酸片段， Ｎ Ｊ引物扩增产物为 ３６４ ｂｐ， Ｆ Ｒ Ｇ 引物扩增产物为 ５１３ｂｐ。模板用 Ｒ Ｎａｓｅ 消化后，仍出现 ３６４ ｂｐ 带，用 Ｄ Ｎａｓｅ Ｓ１ 消化，则此带消失；反之，用 Ｄ Ｎａｓｅ Ｓ１ 消化，出现５１３ ｂｐ 带，用 Ｒ Ｎａｓｅ 消化，则此带消失，证实前者模板为 Ｄ Ｎ Ａ，后者为 Ｒ Ｎ Ａ。 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交试验证实， Ｐ Ｃ Ｒ扩增出的核酸片段与各自的地高辛标记特异性探针发生强阳性杂交反应。由此认为，在兔出血症病毒感染中，同时存在着 ２ 种不同核酸型的病毒。     

鸡传染性法氏囊病病毒经饲料传播的研究

用病毒分离、血凝与血凝抑制试验、琼脂扩散试验、夹心ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ及ｃＤＮＡ探针斑点杂交试验等六种方法对一起罕见疫情的传入途径进行了调查。病毒分离和ＲＴ－ＰＣＲ试验证明，这是由于鱼粉中污染有鸡传染性法氏囊病病毒所致。本研究结果提示，ＲＴ－ＰＣＲ是进行鸡传染性法氏囊病病毒传播途径研究的首选方法，应加强饲料的兽医卫生监督管理，探讨把重要疫病病原列入质检项目的可行性。     

网状内皮组织增殖病病毒感染鸡红细胞免疫功能的动态变化

对１日龄ＳＰＦ鸡分别腹腔接种３株禽网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ）的ＲＥＶ－Ｔ，ＤＩＡ和Ｃ４８株，测得试验鸡红细胞补体（Ｃ３ｂ）受体花环率自接种后１１ｄ起显著低于对照组；而红细胞免疫复合物（ＩＣ）花环率从接种后２５ｄ起（３２ｄ除外），又显著高于对照组。接种不同ＲＥＶ毒株的鸡红细胞Ｃ３ｂ受体花环率和ＩＣ花环率的变化程度不一致，表明不同毒株引起的免疫抑制程度不同。     

鸡传染性支气管炎可疑病料的病毒分离及初步鉴定

１９份鸡传染性支气管炎可疑病料通过ＳＰＦ鸡和鸡胚感染试验，血凝试验，气管环培养感染试验，单克隆抗体ＥＬＩＳＡ和电镜形态学观察，初步证明其中１３份病料含ＩＢ病毒，在用其中９份接种８－９周龄ＳＰＦ鸡进行的发病试验中，全部呈现临床症状，其中３份引起高死亡率（６０－８０％），接种后５周从存活鸡采血作ＩＢＶ血凝抑制试验，结果均为阳性。     

从疑似IBD病鸡的法氏囊组织中分离到1株ARV

从暴发类似传染性法氏囊病（ＩＢＤ）的江苏省某鸡场采集病鸡法氏囊组织制成组织悬液，接种鸡胚卵黄囊，部分鸡胚３～５ｄ死亡，部分鸡胚不死亡但有病变。用感染胚卵黄囊和绒尿膜混合物，接种鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），盲传３代后，发现以合胞体为特征的细胞病变（ＣＰＥ）。感染细胞做超薄切片电镜观察，可见细胞浆内病毒粒子呈整齐的晶格状排列。用免疫沉淀法提取病毒抽提核酸，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，可见规律排列的１０条带，呈３－３－１－３排列。与禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）参考毒株Ｓ１１３３株的核酸谱带的数目和位置相同。血清学试验与ＡＲＶ呈阳性反应，与传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）呈阴性反应。证明分离病毒为ＡＲＶ     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物