马铃薯PPR蛋白家族基因SoDIPPR的克隆及其在干旱条件下的表达特征分析

 【目的】PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白家族在植物的生长发育、细胞器形成、细胞质雄性不育的育性恢复、RNA的编辑加工、细胞核与细胞器之间信号传递、逆境防御等方面具有重要作用。研究旨在了解PPR蛋白家族SoDIPPR基因在马铃薯中的表达情况及其在干旱胁迫下的作用。【方法】以抗旱马铃薯二倍体品系H145为材料,利用cDNA-AFLP技术寻找与抗旱性密切相关的基因cDNA片段,利用RACE技术克隆其基因全长cDNA,并利用半定量RT-PCR和Northern杂交法研究其在干旱条件下的表达情况。【结果】从抗旱马铃薯二倍体品系H145中克隆了一个836 bp全长cDNA序列,命名为SoDIPPR,该序列开放阅读框长为588 bp,编码195个氨基酸序列。序列分析表明,SoDIPPR蛋白存在PPR结构域、激酶结合区、和C端SMR（small MutS related protein）区域。SoDIPPR蛋白序列与GenBank数据库中的其它PPR蛋白进行同源序列比对,构建系统进化树,发现SoDIPPR 与其它14个高等植物的PPR蛋白同源性为57%～82%,与苜蓿DNA错配修复蛋白MuTs2、水稻盐诱导蛋白（Q9LS25）和叶绿体RNA结合蛋白（Q75IP8）的同源性达69%～82%。半定量RT-PCR和Northern杂交结果表明,SoDIPPR基因在干旱胁迫下叶片和根系里的表达量明显增加,说明SoDIPPR基因在马铃薯抗旱中起一定作用。在持续干旱条件下,SoDIPPR基因在抗旱品系H145与干旱敏感品系H214中表达模式不同。【结论】马铃薯SoDIPPR基因编码的蛋白与其它植物PPR家族蛋白同源性较高,SoDIPPR基因参与马铃薯对干旱胁迫的应答反应,可能对抵抗干旱胁迫有一定作用。     

不同氮肥管理条件下钾对寒地水稻抗病性及产量的影响

【目的】研究氮钾施用与水稻抗病性的关系,证实钾提高水稻抗病性的作用。【方法】设计不同的氮钾组合,进行田间小区试验,调查稻瘟病发病情况并考种测产。【结果】相同施氮条件下,随着钾肥施用量的增加,稻瘟病的病穗率降低。实地氮肥管理条件下,与不施钾处理相比,施钾处理稻瘟病发病率降低了25.8%～30.2%;在钾肥用量相同的情况下,与农民习惯施肥相比,实地氮肥管理的发病率分别降低了33.1%和34.9%,均达到了5%的显著水平。实地氮肥管理条件下,钾肥施用量为60 kg•ha-1和90 kg•ha-1的处理与农民习惯施肥和不施钾处理相比,产量分别增加了13.0%和16.1%,均达到5%的显著水平。【结论】高氮并且集中施在生育前期,施钾肥抗病性提高不明显。氮肥用量适当条件下,施钾能提高水稻抗病能力,增加水稻结实率、千粒重和产量。     

高氮条件下不同水稻品种抗病差异研究

对高氮条件下不同水稻品种稻瘟病与纹枯病的发病情况及对产量性状的影响进行了分析。结果表明,高氮处理稻瘟病和纹枯病的病情指数和发病率均高于对照,且差异明显,说明高氮条件有利于稻瘟病和纹枯病的发生;高氮处理大多数品种齐穗期晚于低氮处理,高氮处理平均株高高于低氮处理,但高氮处理平均有效穗数及千粒重均低于低氮处理,平均单株总重二者无差异。     

水稻Ossp1基因的亚细胞定位及其干旱条件下的表达

sp1基因是叶绿体蛋白质输入调控的关键基因,本研究通过生物信息学分析、Real time PCR分析、瞬时表达分析等方法,对sp1在水稻中的同源基因Ossp1进行了结构和功能预测、组织表达和干旱响应性分析以及亚细胞定位分析。生物信息学分析结果显示,水稻Ossp1基因位于7号染色体,基因登录号为Os07g0647800,序列全长1 032 bp,SP1蛋白由343个氨基酸残基组成,信号肽序列位于氮端,蛋白质分子中有2个跨膜区域。Real time PCR分析结果显示,Ossp1在水稻叶片中表达量最高,其次为叶鞘,根中最低,此外,Ossp1在叶片中的表达具有明显的干旱响应性,受到干旱胁迫诱导后,表达量显著提高。采用瞬时表达进行亚细胞定位结果显示,SP1蛋白定位于水稻叶绿体。上述结果显示了Ossp1基因与水稻叶绿体及干旱胁迫响应的关系,为Ossp1基因功能的深入研究提供了基础。     

水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的克隆及表达分析

利用5′-RACE方法克隆了在水稻与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)互作过程中下调表达的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的全长序列。通过生物信息学方法分析了该基因及编码蛋白质的结构特征,OsCtBP-A由424氨基酸组成,N端具有2-Hacid_dh_C保守结构域,C端具有植物CtBPs家族特有的NLS和PEST基序,氨基酸序列与拟南芥和牵牛花CtBPs同源物的同源性为63%;基因启动子区推测具有ABA和SA应答调控元件。OsCtBP-A基因对不同信号分子应答的RTQ-PCR分析表明,水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ETH)和脱落酸(ABA)处理水稻后均能诱导该基因的转录表达,但诱导能力有所差异,其中ABA诱导活性最强。     

马铃薯StSnRK2.4基因的克隆及其序列特征分析

利用RT-PCR技术从马铃薯普通栽培品种‘陇薯3号’试管苗根部扩增得到StSnRK2.4基因的cDNA序列,并对其编码蛋白进行特性和结构分析.结果表明:该基因序列全长1 083bp,编码360个氨基酸,与烟草SnRK2家族基因具有较高的同源性,达95.56%,已注册该基因到GenBank(No.JX280914);该蛋白分子量为41.49kU,理论等电点为5.52,是一个不跨膜的膜内蛋白,主要存在于细胞核中,含有依赖cAMP/cGMP蛋白激酶磷酸化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、酪氨酸蛋白激酶磷酸化和豆蔻酰化位点,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点信号序列和蛋白激酶ATP结合区域信号序列,推测该基因功能与植物抗逆境胁迫有关.     

马铃薯DHN家族基因鉴定及干旱胁迫诱导表达分析

马铃薯遭遇干旱胁迫时,会导致产量下降、品质降低。用生物信息学的方法,对马铃薯DHN(StDHN)基因家族进行全基因组鉴定,对其理化性质、染色体分布等进行分析,利用荧光定量的方法,对其在干旱胁迫下和不同组织中的表达模式进行分析。结果表明,StDHN基因家族共鉴定出5个家族成员,分布于1号、2号和4号染色体上,理化性质分析表明氨基酸长度为80～243个,分子量为8 544.27～25 121.94 ku,等电点(pI)的范围为5.24～7.38。StDHN蛋白的二级结构基本以无规卷曲为主,延伸链与β-转角的比例相当,仅有PG0009968以α-螺旋为主。对马铃薯DHN基因上游1 500 bp启动子区域顺式作用元件分析发现,DHN基因受到光的调控,平均每个基因中有10.4个光响应元件;还受到脱落酸(PG0015495、PG0003531、PG0009968)、赤霉素(PG0003531)等激素的调控;与逆境胁迫相关的包括低温响应元件(PG0030949、PG0003531、PG0009968)、干旱响应元件(PG0030949)等;生长发育调控元件包括胚乳表达(PG0015495)、种子特异...     

异常棉NF-YA家族基因鉴定及其在干旱胁迫下的表达分析

NF-YA转录因子在植物生长发育和逆境响应中扮演重要角色。本研究通过生物信息学手段,分析棉花二倍体野生种异常棉基因组中NF-YA家族基因的数目、染色体分布、系统进化、保守基序、结构、顺式作用元件、表达模式及编码蛋白质的亚细胞定位、理化性质等。结果表明,异常棉NF-YA基因家族(GoanoNF-YA)包含17个成员,分布在10条染色体上,编码的蛋白质长度为190～603个氨基酸,理论等电点为7.87～10.07,16个成员包含3～5个外显子且编码的蛋白质定位于细胞核。拟南芥和异常棉NF-YA基因在系统进化树上分为6类,每类基因在系统进化树上具有相同或相似类型和排列顺序的基序。5个NF-YA基因在异常棉根、茎、叶和花中广泛表达,15个NF-YA基因对干旱持续时间有不同程度的响应,11个NF-YA基因含有干旱响应顺式作用元件MBS。本研究结果为进一步解析异常棉NF-YA家族基因的功能提供了理论依据。     

小麦锌指蛋白基因TaZAT6的克隆、特征分析及其在不同磷水平下的表达

 【目的】在克隆小麦锌指蛋白基因TaZAT6的基础上,深入研究该基因的分子特征和在不同磷水平下的表达特性。【方法】通过对富集石新828不同低磷胁迫时间点特异表达基因的cDNA差减文库克隆测序,获得1锌指蛋白型转录因子基因EST。利用RT-PCR技术,在低磷处理24 h的石新828和冀7369根系中克隆了该锌指蛋白基因TaZAT6,并采用该技术进一步研究该基因应答介质中Pi的特征。【结果】TaZAT6开放阅读框为717 bp,编码238个氨基酸残基,编码的蛋白质中含有1个保守的核定位区、2个C2H2锌指蛋白域和1个DLN保守盒。系统进化分析表明,TaZAT6可能与另外2个小麦锌指蛋白基因ZAT22和ZAT23具有共同的祖先。TaZAT6的表达表现为明显的低磷诱导特性,恢复至正常磷水平下其表达降低至磷胁迫前水平。与磷低效品种冀7369相比,石新828根叶中TaZAT6具有更强应答低磷胁迫能力。小麦高亲和磷转运蛋白基因TaPT2对生长介质中Pi的响应特点与TaZAT6相似,表明TaZAT6可能参与了对TaPT2的转录调节。【结论】低磷胁迫条件下,石新828中 TaZAT6具有较强应答Pi能力,由此进一步调控下游基因表达,可能与该品种在低磷下表现磷高效具有密切联系。     

干旱胁迫下马铃薯差异表达基因的验证分析

为了深入了解马铃薯的抗旱机制,本研究选择Solexa高通量测序中log2(fold change)≥11倍的22个差异基因,包括6个转录因子、4个脯氨酸代谢、4个抗氧化防御系统、4个类黄酮生物合成和4个植物激素信号转导相关基因,采用qRT-PCR检测20%PEG6000处理0、1、6、12h后马铃薯叶片中22个基因表达的变化.结果表明:被检测的22个基因的结果与Solexa高通量测序的结果一致,并且在不同干旱处理时间下各基因表达各不相同,表现出5种表达模式:上调-上调-上调、下调-下调-下调、上调-下调-上调、上调-下调-下调、上调-上调-下调.马铃薯对不同时间点的干旱可能采取不同的应对策略,对1h和6h干旱可能是减少不必要的能量和物质消耗,12h干旱胁迫下才调动大量抗逆相关物质,抵抗干旱的伤害.     

木薯赤霉素途径DELLA蛋白基因克隆及其对干旱胁迫的响应

赤霉素(GA)信号转导途径是通过DELLA抑制蛋白来调控的.笔者利用拟南芥DELLA蛋白基因序列,通过电子克隆方法首次克隆了1个木薯DELLA蛋白基因,长度为1 857 bp,具有完整的蛋白编码框的cDNA序列,命名为MeGAI.生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥DELLA蛋白一样的保守结构域,如DELLA结构域、VHYNP结构域、POLY(S/T)结构域、核定位信号、VHVID结构域、亮氨酸结构域、GRAS结构域;该基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,该基因在干旱胁迫下是下调表达的;GA生物合成重要基因GA20-氧化酶基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,两者在干旱胁迫下的表达模式具有良好的相关性,这说明GA途径可能参与木薯抗旱机制.     

马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因克隆转化及其转基因后代的表达

根据GenBank中的马铃薯卷叶病外壳蛋白基因(PLRV-CP)全序列,设计一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒RNA为模板,克隆了马铃薯卷叶病外壳蛋白基因,在pBI121的基础上构建了植物表达载体。利用PLO(Poly-L-Ornithine)将PLRV-CP基因导入到马铃薯加工型品种大西洋的原生质体中,获得了转基因后代。在5株转化后代中扩增出长度为610bp的目标DNA片断,说明导入的外源PLRV-CP基因已经整合到马铃薯基因组中。Southern blot分析结果进一步证明了PCR结果的正确性。RT-PCR结果表明,在3株转化后代叶片中具有阳性表达。马铃薯卷叶病毒接种实验结果表明,转基因植株比对照有明显的马铃薯卷叶病抗性。     

陆地棉LTP家族基因的克隆与表达分析

长链脂肪酸能够通过调节胚珠内源乙烯信号变化来促进棉花的起始和伸长发育,为深入了解棉花脂肪酸的转运过程及参与基因,对棉花全基因组进行了分析,克隆了11个脂质转运蛋白。实时荧光定量PCR证实:LTP6, LTP7, LTP9, LTP11 4个基因在纤维起始时期（野生型与突变体之间）的表达存在差异,这4个基因可能与纤维起始发育有关。通过基因组步移技术克隆了Gh-LTP6基因的启动子,并对其结构进行分析,发现其具有多个MYB结合位点。这些结果为深入研究LTP基因在纤维起始过程中的角色奠定了基础。     

甘薯Ran基因的克隆和表达分析

Ran蛋白是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白和RNA分子的运输过程。研究发现有些Ran基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得甘薯Ran基因,本试验通过RT-PCR克隆了1个甘薯Ran基因。测序结果显示其含有长666 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含221个氨基酸,推测分子量为25.15 kDa。比对分析发现甘薯与多种生物的Ran蛋白的氨基酸序列同源性都超过90%,荧光定量PCR研究表明IbRan基因受低温、PEG、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控甘薯的抗逆性奠定了基础。     

紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析

【目的】从紫色马铃薯中克隆CHS的cDNA全长序列,并分析其组织表达水平以及诱导剂处理后基因的表达与花青素含量积累之间的关系。【方法】采用RT-PCR和RACE方法克隆紫色马铃薯CHS的cDNA全长序列,通过在线软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析,半定量RT-PCR检测StCHS在紫色马铃薯组织中的表达特异性以及蔗糖和赤霉素处理后StCHS的表达。采用分光光度计法测定紫色马铃薯花青素含量。【结果】克隆获得紫色马铃薯CHS的cDNA全长1 490 bp,包含1 170 bp的ORF,该基因编码389个氨基酸。推测StCHS蛋白含有Cys164、Phe215、His303和Asn336 4个活性位点,构成CHS蛋白的催化中心。StCHS的表达具有组织特异性,在茎、叶柄和叶中表达较强,在根、块茎和叶轴中几乎检测不到CHS的表达。赤霉素能促进CHS的表达从而促进花青素的积累;蔗糖能够显著促进紫色马铃薯花青素的积累,但对CHS的表达影响不明显。【结论】从紫色马铃薯中克隆获得CHS的cDNA全长序列,该基因表达具有组织特异性,StCHS是紫色马铃薯花青素合成途径中的一个限速酶基因。     

马铃薯蛋白酶抑制子StPI基因的克隆及表达分析

 【目的】克隆马铃薯蛋白酶抑制子基因StPI的全长cDNA。【方法】以马铃薯高抗青枯病二倍体基因型ED13为材料，采用RACE方法进行StPI基因全长cDNA的克隆，利用半定量RT-PCR方法进行该基因的诱导表达分析。【结果】获得了StPI基因的全长cDNA，序列分析表明：该基因具有完整的开放阅读框架，编码116个氨基酸，与马铃薯蛋白酶抑制子 I 前体具有较高的同源性（核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89%和74%）。该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节，在6～12 h内即达到最高表达水平，但二者又有明显不同。相对而言，StPI基因受青枯病菌的诱导较弱，而受茉莉酸（JA）的诱导较为强烈，在JA处理3 h表达量即明显升高，6～12 h迅速升至最高。【结论】本研究从马铃薯抗青枯病基因型ED13中获得了StPI基因的全长cDNA。该基因可能参与了马铃薯的抗青枯病反应，且病菌处理对该基因的诱导可能与JA刺激具有相似或相同的信号途径。     

干旱胁迫下大豆幼苗根系基因的表达谱分析

【目的】了解干旱胁迫下大豆幼苗根系的抗旱机制。【方法】利用基因芯片技术,分析在不同干旱胁迫时间下强抗旱品种晋豆23幼苗根部基因的表达情况。【结果】获得了61171个大豆根系基因的差异表达动态图谱。在不同干旱胁迫时间下根部基因的表达发生变化,3个时间点下,下调表达的基因数量均多于上调表达的基因数量。同时对杂交数据进行多种聚类分析。利用实时荧光定量PCR验证4个基因在干旱胁迫条件下的差异表达,其结果和芯片杂交分析的结果基本一致。【结论】初步建立了大豆幼苗根系干旱胁迫应答基因的动态表达谱,并通过其动态表达了解植物与逆境的互作机制,比较全面地获得了干旱胁迫应答基因,从而更完整地揭示了大豆干旱胁迫应答基因的表达情况。