大肠杆菌热敏毒素LT克隆基因的PCR定点诱变和重组表达的构建

为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性，实验依据LT基因的同源序列设计并合成5条引物，采用突出末端PCR法和重组PCR法，将克隆于质粒pEWD299上的LT基因，分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点，扩增出带有上述RE位点且含有m7和m112突变点的约1100bp和约800bp的DNA片段和不含突变点的约300bp的DNA片段，使控制LT毒力活性中心的第7位和第112位氨基酸的碱基分别发生诱变，各DNA片段经分熟、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后，插入经BamHI和XhoI双酶切的线性化的高效表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点区，使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达，将连接产物转化入JM105菌株，挑出可疑阳性菌落，提取质粒，经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析，证明读框正确，序列正确，获得了pGEX-4T-1(LT7t GEX-4T-1(LTm112两个重组表达质粒。为运用基因工程手段大量生产人 动物大肠杆菌流行性腹泻的疫苗抗原和幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂，完成了基因水平的工作。     

大肠杆菌毒素的分子生物学特性与致病机理

大肠杆菌毒素是一种重要的细菌毒素,可引起多种动物的疾病,造成很大的损失。论述了大肠杆菌毒素的产生与危害、分子生物学研究进展及致病机理等。     

狗大肠杆菌研究概况

大肠杆菌主要引起新生仔猪、犊牛和婴儿的急性腹泻,在狗中主要引起腹泻和尿路感染,在母狗还常常引起子宫炎,成年犬睾丸炎,引导起精子数量下降。我国对引起新生仔猪、婴幼儿腹泻的大肠杆菌研究较多,但迄今为止尚未见到有关大肠杆菌引起狗发病的报道。根据国外研究概况,本文从六个方面对狗大肠杆菌流行及致病情况简要介绍。血清型分布：英国（BUSh．B．M1974）报道有O4、O,。、0;;。1978年,Asl。aJ等’‘’报道血清型O。、O。。的大肠杆菌能引起新生狗腹泻,法国（Jaque．1978）在67条母狗中分离到0。、O。、O。。血清型的E．…     

产志贺毒素大肠杆菌检测技术研究进展

产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichiacoli. STEC)是一种重要的人畜共患病病原菌,可以引起人类水样腹泻、岀血性肠炎等轻度肠不适,严重时导致溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome, HUS)、终末期肾病(End stage renal disease, ESRD)甚至死亡。有研究显示,每年全球范围内估计感染致病型STEC造成超过2800000例人类急性疾病,死亡230例[1].鉴于STEC对全球公共安全的重要影响,对其高效检测和鉴定至关重要.     

金银花链翘提取物对大肠杆菌热敏肠毒素的拮抗作用

应用兔回肠结扎试验研究了金银花连翘提取物对大肠杆菌热敏肠毒素致肠分泌的拮抗作用，实验的结果表明，金银花连翘提取物对大肠杆菌致病作用的影响至少涉及到抑菌和对热敏肠毒素的拮抗作用两个方面，且其作用提取物浓度增高而增强。     

禽大肠杆菌病的免疫防制研究概况

禽大肠杆菌病的免疫防制研究概况赵香汝＊（中国农业大学动物医学院,北京海淀１０００９４）禽大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的主要的细菌性传染病。此病在世界范围内存在,严重地影响了养禽业的发展,在我国多数鸡场无论是雏鸡还是成年鸡均可发生本病。张炳仁（１９９６）...     

仔猪腹泻大肠杆菌多价灭活苗的研究

根据广东省致仔猪腹泻的大肠杆菌血清型的调查结果，筛选出致病力强，免疫原性好的优势Ｏ抗原血清型菌株Ｃ４（Ｏ１１９），Ｄ３１（Ｏ６０）和Ｎ６（Ｏ７５）作为广东代谢菌株，与产粘附因子的菌株Ｃ８３９０１（中的Ｃ８３９１４Ｋ９９），Ｃ８３９１５（９８７Ｐ）制成多介灭菌苗，５批多价灭活菌苗对小鼠的平均保护率达９２．７％（３８／４１），９５０１批在兔体内粘附因子Ｋ８８，Ｋ９９，９８７Ｐ抗体效价可上升３ｌｏｇ２，     

猪源产肠毒素性大肠杆菌疫苗研究概况

产肠毒素性大肠杆菌（简称ETEC）是引起仔猪腹泻的主要病原之一。据估计，国内约有35％的仔猪腹泻是由ETEC引起的；美国等国家新生仔猪腹泻中，由ETEC引起的占45％以上。目前，该病的防治以药物和疫苗为主，但因药物治疗价格昂贵，而且随着耐药菌株的增多，因此免疫预防还不失为控制该病的最佳选择。目前，国内外已有多种预防仔猪腹泻的实验性或商品化菌苗。大体上可包括以抗黏附素免疫为基础的含单价或多价黏附素抗原的灭活全菌苗或亚单位苗；以抗肠毒素免疫为主的的类毒素苗或LTB亚单位苗；     

大肠埃希菌不耐热肠毒素作为黏膜免疫佐剂的研究进展

免疫佐剂是一类通过刺激机体免疫系统而非特异性地增强机体对抗原免疫应答的活性物质,也是近年来研究的热点.免疫佐剂种类众多,利用细菌及其代谢产物作为黏膜免疫佐剂具有很好的发展前景,研究较多的是霍乱毒素(CT)和大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT),从研究效果看,LT比CT更为理想.但是LT和CT一样本身具有毒性,这是其作为黏膜佐剂的主要缺点.目前,国内外研究工作者对其突变体做了大量研究,以期找到具有黏膜佐剂活性但低毒或无毒的大肠埃希菌不耐热肠毒素突变体.文章对大肠埃希菌不耐热肠毒素分子及其突变体的研究做一综述.     

大肠埃希菌热敏性肠毒素B亚基研究进展

产肠毒素大肠埃希菌(EnterotoxigenicE.coil,ETEC)是引起幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原之一。ETEC产生两类肠毒素,一种是对热敏感的热敏性肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT),另一种是对热不敏感的耐热性肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST)。LT不仅是ETEC主要的毒力因子,而且还是一种重要的黏膜佐剂,它由A、B亚基组成,由于LT A具有毒性作用,限制了LT作为黏膜免疫佐剂的应用;而LT B无毒且具有黏膜佐剂活性,使其成为备受关注的佐剂之一。近年来对LT B的结构、介导的免疫调节分子机制、突变体及其佐剂作用已进行了较为深入的研究,为充分利用LT B的黏膜免疫佐剂功能奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTR72的表达与鉴定

将重组质粒PLTR72和PLT分别转化大肠杆菌JM101，DH5α和C600，并接种于LB和CAYE-2中培养，用GM1-ELISA法检测菌体裂解液中2者的表达情况，将表达产物纯化后用SDS-PAGE等方法鉴定。结果表明，3种大肠杆菌在2种培养基中都可表达出LT突变体和LT，并可将产物分泌到大肠杆菌胞周质中，成为具有GM1结合活性的突变体蛋白，鉴定纯化后的突变体的组成形式与野生型LT相同。均是1A：5B。     

犊牛腹泻大肠杆菌疫苗的研制与应用

根据南京地区犊牛大肠杆菌腹泻流行病学调查结果,用分离鉴定的犊牛腹泻菌株O78、O26、O15大肠杆菌作菌种,制备油乳灭活疫苗,接种初生犊牛预防犊牛大肠杆菌腹泻。结果表明制备的大肠杆菌油乳灭活疫苗接种初生犊牛能产生良好的免疫保护。     

大肠杆菌菌苗的研制

对苗用菌株的灭活时间和菌苗免疫条件进行筛选的条件下,用甘肃省大肠杆菌的代表血清型和筛选的大肠杆菌原生质体融合菌株研制大肠杆菌菌苗,并进行菌苗安全性试验。正交试验试验结果表明:菌苗的最佳组合是抗原含量是4亿/mL和佐剂含量是10 mg/mL。苗用菌株的灭活试验结果表明:鸡苗的灭活条件是1%甲醛作用96 h;猪苗的灭活条件是2%甲醛作用48 h。     

Vaccination experiments on pregnant mice with E. coli vaccines prepared from septicaemic and enteropathogenic strains of E. coli

Experiments have been carried out with vaccination of pregnant mice against E. coli, followed by i.p. challenge of the offspring at one week of age.With a septicaemic strain the results were highly significant, and the method is therefore recommendable for testing of vaccines against such strains of E. coli.Results were less clear-cut with enteropathogenic strains of E. coli. However, with mortality rates of 40 to 45 % in baby mice born by non-vaccinated mothers and less than 15 % in baby mice born by vaccinated mothers, the difference in percentage mortality seems sufficient to warrant the use of the method also in the control of vaccines against enteropathogenic E. coli strains.     

电针对大肠杆菌热敏肠毒素致肠水、钠分泌的拮抗作用

新生仔猪下痢是严重危害养猪业的常见病、多发病,而肠致病性大肠杆菌产生的肠毒素特别是热敏肠毒素(Heat-Labileenterotoxin,LT)则是导致幼畜腹泻的直接致病因子。在兽医临床上,由于广泛使用抗菌药物治疗仔猪下痢,大肠杆菌对这些药物普遍地产生了耐药性,致使临床疗效越来越差。针灸疗法是我国传统医学的宝贵遗产,已有不少文献报道了针灸对哺乳仔猪下痢良好的防治效果,但有关针灸防治仔猪下痢机理的研究则相对滞后。为此,本试验应用兔回肠结扎实验动物模型观察了电针刺激对大肠杆菌热敏肠毒素致肠水、钠分泌的拮抗作用,以便为针灸防治…     

禽霍乱+大肠杆菌病二联蜂胶灭活疫苗与油佐剂疫苗注射部位的动态病理组织学比较观察

用禽霍乱+大肠杆菌二联蜂胶灭活疫苗和油佐剂疫苗分别胸肌注射免疫肉鸡,分别于免疫后7d、14d和28d剖杀,取注射部位的肌肉组织,常规石蜡包埋切片观察。结果为,蜂胶疫苗免疫组免疫后7d时,肌纤维轻度水肿,纤维间有大量淋巴细胞和巨噬细胞的浸润,巨噬细胞吞噬有蜂胶颗粒,14d时肌纤维则恢复正常;油苗注射组免疫后,7d时肌肉中度水肿,其间有大量油乳状疫苗残留,镜检可见肌纤维断裂、坏死,其间有较多较大的油囊,囊壁由大量增生的成纤维细胞、异嗜性粒细胞、巨噬细胞、小血管及淋巴样细胞组成,细胞增生持续存在到28d,最后形成肉芽肿结构。研究结果表明,蜂胶疫苗免疫后对局部组织学影响明显小于油苗注射组。     

禽致病性大肠杆菌(APEC)菌蜕的制备研究

菌蜕是通过PhiX174噬菌体溶菌基因E的可调控表达而形成的、缺少细胞浆和核酸且无繁殖能力的革兰氏阴性细菌菌体。这种非变性的灭活方式使菌蜕完好保留了细菌的各种抗原成分和免疫黏附分子,具有优良的免疫原性和固有的免疫佐剂性质以及免疫系统靶向性质。菌蜕的这些生物学特点使其在作为新型非变性灭活菌苗、作为递呈异源抗原的重组疫苗以及作为DNA疫苗甚至药物的载体方面都显现出巨大的研究开发前景。本研究成功构建了热敏诱导、pR、pL串联双启动子表达E基因的、具有不同抗性标记和复制起点的系列溶菌载体,比国外用pR或pL单启动子的溶茵载体在K-12株大肠杆菌(如XL1-blue)的溶茵效率高一个指数级。本研究还成功制备出禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic E.coli,APEC)野毒株的菌蜕,为进一步进行菌蜕疫苗的开发研究奠定了技术基础。     

肉鸡大肠杆菌多价灭活蜂胶苗的研制

从分离鉴定的49株大肠杆菌中筛选出5株致病力强、免疫原性好、具有优势血清型的大肠杆菌作为制苗菌株，经培养灭活后，以蜂胶为佐剂，研制出的肉鸡大肠杆菌多价灭活蜂胶疫苗，使用安全，免疫效果好。用该苗免疫后150d的保护率为100％，无不良反应。该苗4C下保存1年不失效。田间试验结果表明，该苗性能好，免疫后对肉仔鸡、肉种鸡的生产性能无不良影响，鸡群大肠杆菌病的死亡率明显下降。