动物疫病荧光PCR检测中假阳性的原因分析与控制

近年来,实时荧光定量PCR技术已被广泛应用于动物病原学检测,但检测中存在因实验室污染而导致检测结果假阳性的问题,因此如何确保动物疫病荧光PCR检测结果的可靠性,一直是研发团队和检测人员需解决的问题。本文从实验室质量管理入手,分析了动物疫病荧光PCR检测中假阳性形成的常见原因,并提出了综合控制措施,以期为兽医实验室荧光PCR检测工作提供参考。     

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测假阳性的原因与预防措施

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)荧光PCR检测是防控非洲猪瘟(African swine fever,ASF)的关键环节。江苏省动物疫病预防控制中心对两家具备ASF检测资质的实验室,进行了阳性样品复核,发现检测结果存在假阳性。为避免实验室检测中出现检测失误,本文分析了导致ASFV检测假阳性结果的原因:实验室检测功能区域设置以及人员、物品流向不合理;检测人员操作不规范、不熟练,未在独立的生物安全柜中进行样品提取与试剂配制;实验室通风不良、清洁消毒不彻底,样品或提取模板间产生交叉污染,PCR试剂、产物、阳性质粒发生污染。为此,从实验室结构、环境、操作等方面提出控制建议:严格实验室功能分区与管理,规范各种试验操作与流程,加强实验室通风和消毒,控制试验中产生PCR污染的相关因素;同时省级实验室要加强对基层实验室的培训、指导和监督,使其在ASF防控中发挥应有的关键作用。本文为从事ASF等重大动物疫病PCR检测的实验室,在提高检测结果准确性和可靠性方面提供了参考。     

PCR假阳性的原因分析及控制措施

近二十年来,PCR作为一种重要的分子生物学技术,广泛应用于动物疫病的病原学、诊断方法、基因工程疫苗研究、检验检疫、疫病诊断、疫情监测及流行病学调查等动物疫病防控实际工作。如何控制好PCR检测的质量,减少假阳性,一直是研究者普遍关注的问题。本文分析了PCR假阳性形成的原因,提出预防及控制措施,为促进实验室PCR实践工作提供参考。     

ELISA检测中出现假阴性探讨

本文应用酶免疫试验（ＥＬＩＳＡ）、反向间接血凝试验（ＲＩＨＡ）和中和试验（ＮＴ）三种方法对６份疑似ＨＢＶ感染的待测血清进行测定，借此探讨ＥＬＩＳＡ检测中出现假阴性现象，认为假阴性是由检测前滞现象引起。     

UNG酶在兽用生物制品支原体PCR检测中防止假阳性的应用

为了研究尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)在减少兽用生物制品支原体PCR检测中的假阳性情况,本研究通过在PCR试剂中加入UNG酶,在PCR反应前25℃作用10 min,再50℃作用2 min,结果显示,该法可以有效防止PCR产物的污染,减少假阳性的产生。     

一例进口皮张炭疽杆菌ASCOLI反应和PCR检测双假阳性的确认

炭疽杆菌是公认的严重的人兽共患病之一,是进出口检疫的法检项目。作为我国生牛皮进口国之一的美国,随着近几年美国发生的恐怖分子的炭疽邮件事件及美国炭疽病的发生,对炭疽病的风险分析研究已经在世界各国引起强烈关注。根据行业标准SN/T1700—2006即《动物皮毛炭     

猪蓝耳病抗体试剂盒出现假阳性的确诊思路

猪蓝耳病（PRRS）是影响养猪行业的一个重要的疾病。对于一个核心场或者公猪站而言,维持猪蓝耳病双阴性,做好猪蓝耳病的监测工作是及其重要的。猪蓝耳病抗体检测是猪蓝耳病双阴性场评估猪群是否感染猪蓝耳病野毒常用的方式之一。但是所有商品化的试剂盒的敏感性和特异性并不是100%准确的。通过对3个猪蓝耳病双阴性猪场的猪只进行猪蓝耳病抗体检测,检测结果分别出现2.17%、100%、1.6%的阳性样本。对于异常结果除实验室进行复检和临床诊断外,还通过抗体变化的监测和免疫荧光的检测来验证检测结果的可靠性,经过验证得知这3个猪场出现的2.17%、100%、1.6%的阳性结果均为假阳性。     

盐酸克仑特罗ELISA检测假阳性的原因分析

盐酸克伦特罗(Hydrochloride Clenbute-rol)是人工合成的β-肾上腺素能受体兴奋剂之一,学名α-[(叔丁胺基)甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐。医学上常用于防治哮喘性慢性支气管炎、肺气肿等呼吸系统疾病,又称克喘素。克伦特罗在动物体内能够改变营养物质的代谢途径,促进动物     

流产衣原体TaqMan实时荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

流产衣原体是导致绵羊地方性流产的主要病原体,给全球畜牧业经济发展构成了巨大威胁。为建立一种灵敏、特异且快速的检测流产衣原体的实时荧光定量PCR方法,依据衣原体蛋白酶样活性因子的基因组序列设计了针对检测流产衣原体的引物和TaqMan探针,对反应体系和反应条件进行了优化,对方法的灵敏度、特异性及重复性进行了评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,该方法的最低检测限为26 copies/μL,灵敏度是普通PCR的10倍;与其他可以引起类似症状的病原体无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%;对156份流产羊拭子的基因组进行检测,检出率为78.21%。研究表明,该方法可以很好的应用于流产衣原体的大规模临床样本检测,为流产衣原体病的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。     

荧光定量PCR检测原料乳中粘质沙雷氏菌

为建立检测原料乳中粘质沙雷氏菌(S.marcescens)定性定量的检测方法,本研究利用S. marcescens S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因片段设计1对特异性引物,设计并建立了S. marcescens luxS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法。结果显示,该方法可特异性检测粘质沙雷氏菌的存在,检测的最低限为6.9×10~2cfu/mL。与其他原料乳中常见的微生物均无交叉反应,比常规PCR的检测限(6.9×10~3cfu/mL)要广。对2015年11月~2016年1月长江下游地区8个牧场的原料乳进行检验,结果表明本检测方法具有较好的敏感性、特异性和实用性。     

液相色谱串联质谱法正负模式切换同时检测饲料中10种硝基呋喃类化合物

建立了超高效液相色谱-串联四级杆质谱法检测饲料中的10种硝基呋喃类化合物的方法。2g饲料样品经0.1 mol/mL HCl : 乙腈=1:1提取,9000 RPM高速离心后稀释,经酸性氧化铝粉末净化后进样分析。采用Thermo Hypersil Gold C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 1.9 μm)作为固定相,0.1 %甲酸和乙腈作为流动相进行梯度洗脱。质谱采用正负离子切换同时扫描,SRM模式进行分析。10种硝基呋喃类化合物在最优化条件下分离良好,在定量范围内均线性良好(线性相关系数r≥0.99),回收率也可达到63.2 % ～ 89.7 % ,相对标准偏差(RSD)小于9.3 %。本方法具有简便、快速、灵敏、准确等特点,适用于饲料中违法添加硝基呋喃类化合物的检测。     

中国林蛙真伪品的PCR鉴别

本研究根据GenBank发表的哺乳类SRY核酸序列和禽类EcoRI家族序列设计1对引物,对中国林蛙真伪品进行了PCR扩增,并对特征条带进行了克隆测序。结果表明,PCR扩增产物有明显的区别,中国林蛙、黑龙江林蛙、黑斑蛙和中华大蟾蜍分别扩增出约1000、250、450、750bp的特征条带,通过对中国林蛙1000bp条带的克隆序列进行BLAST比对分析,找到了一些禽类的WZ染色体上的相关基因片段。     

实时荧光PCR和常规PCR方法检测饲料中鸡源性成分

根据鸡线粒体DNA序列,设计并筛选了鸡源性特异引物及探针,建立了饲料中鸡源性成分的常规PCR和实时荧光PCR检测方法,结果表明常规PCR方法最低可以从饲料中检出0.1%的鸡源性成分,实时荧光PCR方法最低可以从饲料中检出0.001%的鸡源性成分。该方法具有很高的特异性和灵敏性,可以作为鸡源性成分鉴别检测的常规方法。     

Real-time PCR方法和PCR方法检测虾白斑综合征病毒

由白斑综合征病毒引起的虾白斑综合征是国际兽医局（OIE）规定的必须上报的水生动物二类疫病。本研究首先通过设计新的PCR引物，提高了PCR检测白斑综合征病毒的阳性检出率。为进一步提高白斑综合征病毒检测的灵敏度，本研究采用TaqMan探针技术建立了快速检测白斑综合征病毒的real-time PCR方法，通过与常规PCR方法比较，证实其检测灵敏度显著提高。     

产苦马豆素疯草内生真菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据疯草内生真菌苦马豆素合成基因簇中swn K 基因KS 区域设计引物,构建SYGR Green I实时荧光定量PCR检测方法,初步分析黄花棘豆植物样品中内生真菌生物量与苦马豆素含量的关系.结果表明,基于swnK基因KS区域构建的实时荧光定量PCR法特异性较好,灵敏性较高,当真菌起始DNA浓度在0.009?90ng/μ...     

鸡传染性贫血病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus,CAV)基因组保守区域设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种快速检测CAV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,同时验证其特异性、灵敏性和重复性.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度可达1.8×10¹拷贝/μL,远高于常规PCR方法;并与禽类其他病毒性疾病无交叉反应,具有高特异性.用分离的病毒人工感染1日龄SPF雏鸡,14日龄剖检,对感染鸡体内各器官的病毒分布及载量进行检测,结果表明,在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊和血清中均可检测到病毒,肝脏、胸腺病毒载量明显高于其他组织.本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测大量临床样品,适用于CAV的诊断与流行病学分析.     

食源性沙门氏菌的PCR检测

该试验根据GenBank数据库沙门氏菌的特有基因invA(AE008832)设计扩增长度为285 bp的引物,研究PCR技术在检测冷冻肉中沙门氏菌的检测限度.在生理盐水中食源性沙门氏菌的检测限度为103 cfu/mL;在人为污染肉汤中,普通FCR的检出限为1.98×103 cfu/mL;人为污染后的样品肉汤中沙门氏菌浓度为100,101,102 cfu/mL时,分别培养7.6.6h即可检测到.     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计1对引物，扩增特异的650bp棱酸片段，建立了应用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明，12个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp特异性的核酸片段，而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明，PCR的最低检出限量为500个放线杆菌。利用建立的PCR检测方法对22株从山东省不同地区分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌菌株进行检测．结果14株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明，病变部位不同，胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同，其中以扁桃体的检出率最高。