分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

按katendel氏法用伊氏锥虫JG株制备全虫抗原,以其免疫BALB/C小鼠。以50％PEG(MW4000,pH8.0)作融合剂。使免疫鼠脾细胞与S P2/0 Ag14(简称S P2/0)骨髓瘤细胞融合。经系统筛选和克隆化,建立了9个分泌抗伊氏锥虫抗体的杂交瘤细胞株。他们分泌的McAb,4株为IgG1、1株为IgG3、另4株为IgM。9株McAb在琼脂免疫双扩散试验中均不形成沉淀线。用ELISA检测,这些细胞系培养上清和腹水与同源伊氏锥虫虫株抗原的滴度分别为1:64-1:1024和1:6.4×103-1:6.4×105;与泰氏锥虫和弓形虫抗原则全为阴性。用2个异源伊氏傩虫虫株抗原检测时,8株无任何交叉反应,8株与2个异源株均有交叉反应,另3株则只与1个异源株有交叉反应。用增值反应检查了5株IgG类McAb识别抗原决定簇的特异性,除2株共同识别一种抗原决定簇外,另8株各自识别不同的抗原决定簇。     

伊氏锥虫新疆株在动物体内抗原变异程序的观察

为了探明伊氏锥虫在动物体内抗原变异,以伊氏锥虫新疆株克隆感染兔,每３天采兔血１次,共采血５次,并用环磷酰胺处理的小白鼠对各分离期锥虫予以克隆,获得５个锥虫克隆群体,经ＡＢＣ－酶标试验和间接免疫荧光试验,对各克隆锥虫抗原进行鉴定,结果：获得５个表面抗原性互不相同的克隆群体,说明伊氏锥虫新疆株第１次抗原变异发生在４－６日内,以后每３天变异１次,本研究为进一步探明伊氏锥虫抗原变异规律打下了基础。     

泰氏锥虫抗原制备及实验室诊断研究

应用体外培养的泰氏锥虫制备可溶性抗原Ⅰ、抗原Ⅱ和代谢抗原.经测定,其蛋白含量每毫升分别为6.5mg、7.4mg和7.1mg.薄层等电聚焦电泳测定结果表明,抗原Ⅰ出现22条区带,抗原Ⅱ21条区带,代谢抗原28条区带,对照的伊氏锥虫琼脂免疫扩散抗原14条区带.经分析,泰氏锥虫抗原和伊氏锥虫抗原有4条区带在同一迁移率上.琼脂免疫扩散反应中,3种泰氏锥虫抗原均与相应免疫兔血清发生沉淀反应,抗原Ⅰ出现1条致密沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原出现2～3条沉淀线,抗原效价为1:4～16.免疫电泳显示了类似的结果,抗原Ⅰ与免疫兔血清出现1条弧形沉淀线,抗原Ⅱ和代谢抗原与免疫兔血清出现了3条弧形沉淀线.间接血凝试验结果表明,泰氏锥虫自然感染牛血清效价为1:20～40,免疫兔血清为1:1280～5120.所制泰氏锥虫抗原对伊氏锥虫和媾疫锥虫血清也能很好地发生交叉反应,3份伊氏锥虫病马血清和3份伊氏锥虫人工感染兔血清血凝效价分别为1:10～40和1:8～1024;5份媾疫马血清有4份血凝效价为1:20～320.4份环形泰勒虫病牛血清均为阴性.     

应用单克隆抗体检查伊氏锥虫抗原变异

用广西骡株伊氏锥虫可溶性抗原免疫的BALB/C小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP_2/O)融合,获得了在ELISA中能与广西骡株伊氏锥虫可溶性变异表面糖蛋白反应的2个分泌IgG_1的单克隆抗体(McAb)。用McAb于ELISA抑制试验对四份不同期的广西骡株伊氏锥虫阳性血清的抗体成分进行了分析,结果四份锥虫阳性血清对于McAb与相应抗原决定簇的结合均未出现明显的抑制作用。表明血清样本间很少或完全没有与McAb相类似的抗体。这证明伊氏锥虫存在多个血清型亦即变异抗原型。     

运用伊氏锥虫抗原变异规律进行免疫的初步研究

为了克服锥虫抗原变异对宿主免疫反应的干扰，探索伊氏锥虫病高效保护性抗原，根据伊氏锥虫在宿主体内第一次发生变异产生的变异抗原免疫原性相同的规律，设计了伊氏锥虫变异前抗原（VSG1）和第二次变异所产生的抗原（VSG2）复合物作免疫原，对小鼠进行免疫与单用变异前抗原免疫鼠相比较，两组鼠都用带变异前抗原的虫攻击，另以未免疫的鼠作对照，结果VSG1＋VSG2免疫组小鼠8只全部获得保护，单用VSG1免疫组小鼠10只和未免疫组小鼠10只血中全部出虫而死亡，前者比后者出虫时间和存活时间延长，提示运用伊氏锥虫抗原变异这一规律设计的这种免疫复合物，能激收缩主克服虫体抗原变异对免疫保护的干扰。     

伊氏锥虫不同虫株免疫保护试验

伊氏锥虫在我国流行面广，因而地理株众多。在进行免疫诊断时，已发现用某株锥虫制成的抗原对其他株锥虫病的诊断出现敏感性和特异性不均一的现象［’1。王祥生等用异种锥虫进行了交叉兔疫试验’‘’。有关不同株锥虫之间交叉免疫保护试验，还未见有人研究，本试验对此作了初步探讨。材料与方法】．虫株新疆骆驼株（XJCA）和安徽水牛株（AHB）均为本实验室液氮保存。2．试验动物昆明系小白鼠30只，体重20g左右，雄性。购自上海医科大学实验动物中，乙。3．抗原制备保存于液氮中锥虫取出复苏后经小白鼠继代，大白鼠扩增后，按an－ham等（1…     

伊氏锥虫补反抗原与媾疫锥虫补反抗原诊断马媾疫病的比较

<正> 用补体结合反应诊断马媾疫,所用的抗原有伊氏锥虫补反抗原和媾疫锥虫补反抗原,为了探讨两种抗原对马媾疫的检出率,我们做了对比试验,现将试验情况分述如下: 试验抗原一、伊氏锥虫补反抗原,成都兽医生物药品制造厂出品。二、媾疫锥虫补反抗原,陕西省兽医研究所制造。     

抗伊氏锥虫表膜单克隆抗体的研究Ⅰ.杂交瘤细胞株的建立与鉴定

利用淋巴细胞杂交瘤技术,建立了3株抗伊氏锥虫表膜抗原的McAb杂交癌细胞株1C_2、2A_3、5B_7,对其鉴定的结果;①杂交瘤细胞所诱生的腹水效价,1C_2为2×10~(-4)、2A_3 4×10~(-4)、5B_7 64×10~(-4);培养上清效价,1C_2为1/512、2A_3 1/512、5B_7 1/1024。②3株细胞所产生的McAb均为IgM。③杂交瘤细胞的染色体数,1C_2 82条、2A_3 96条、5B_7 106条。④用McAb作抗原定位,均结合于伊氏锥虫虫体表面。⑤McAb与伊氏锥虫表膜以外的其它抗原成分反应较弱,与锥虫属以外的病原体不发生反应,与泰氏锥虫、路氏锥虫有部分交叉反应。⑥3株McAb对虫体均无抑制作用。     

检测伊氏锥虫循环抗原的McAb-RPHA试验

用一株抗伊氏锥虫、马媾疫锥虫和布氏锥虫共同抗原(与泰氏锥虫等抗原无交叉反应)的单克隆抗体建立了检测伊氏锥虫循环抗原(TcA)的反向间接血凝试验。用以检测人工感染兔,于感染后8～10天TcA转阴;如不治疗直至观察期结束持续阳性;治疗后一周即转阴。用以检测疫区36份虫血症阳性水牛血清,25份阳性(69.44％);16份虫血症阴性、IHA阳性水牛血清,3份阳性;25份虫血症和IHA阴性水牛血清,全部阴性。     

应用酶联免疫吸附试验检测伊氏锥虫循环抗原的实验研究

本文介绍一种检测伊氏锥虫循环抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验。这种试验敏感性和特异性高,检查实验室制备的伊氏锥虫可溶性抗原,可检出的阈值为0.049—0.195微克蛋白/毫升(0.122±0.066微克蛋白/毫升);检查泰氏锥虫和龚地弓形体抗原,即使抗原浓度分别高达180微克蛋白/毫升和200微克蛋白/毫升,亦为阴性。用此法观察了7只实验感染家兔血清中伊氏锥虫循环抗原的动态,实验兔于感染后4—8天首次呈现抗原血症,滴度于感染后8—10天达高峰,持续仅4—12天,于感染后14—28天转为阴性,而实验感染前和用拜耳205治疗后的血清则全部阴性。将治疗前已转阴的15份血清和治疗后的28份血清标本按Bout等介绍的方法解离免疫复合物再检循环抗原,前者10份阳性,后者全部阴性.此结果证明,实验感染兔于感染后2—4周血清中出现伊氏锥虫抗原-抗体免疫复合物,复合物的产生影响循环抗原的检出。     

应用质粒PTK探针鉴定锥虫的初步研究

用^32P标记质粒探针PTK1、PTK1.1和PTK1．2，对12株中国伊氏锥虫的斑点杂交试验显示，3个探针均能与8株具有正常动基体的伊氏锥虫杂交，而不与其余4株异常动基体伊氏锥虫杂交，对正常动基体株的敏感度为10^2虫体。探针PTK1亦能与马媾疫锥虫杂交，敏感度为10^2个虫体。但PTK1与布氏锥虫仅发生微弱的杂交反应．敏感度为10^5个虫体。试验表明伊氏锥虫株之间的kDNA微环是同源的，伊氏锥虫与马媾疫锥虫和布氏锥虫的kDNA微环存在着共同序列。     

牛羊4种寄生虫病联合诊断技术的研究与应用

疫区牛羊同时寄生有捻转血矛线虫、日本血吸虫、伊氏锥虫和肝片吸虫等多种寄生虫。目前血清学诊断方法对这 4种寄生虫病的检测需 2～ 4次操作。将捻转血矛线虫、日本血吸虫、伊氏锥虫和肝片吸虫抗原分别以 0 1 5 ,0 0 4 ,0 0 6和 0 1 3μg/ μL的最佳浓度依次定点在同一硝酸纤维素膜条上 ,制成 4种寄生虫病联合诊断膜。用黄牛IgG ,水牛IgG和山羊IgG联合免疫兔 ,获得了高效价兔抗黄牛、水牛和山羊 (简称兔抗牛羊 )IgG抗血清。应用兔抗牛羊IgG抗血清连接酶标SPA ,建立了 1份血纸能同时用于检测牛、羊捻转血矛线虫、日本血吸虫、伊氏锥虫和肝片吸虫病抗体技术。经浙江、湖北、四川、安徽等省应用 ,该项技术具有省工、省时、经济、实用等优点。适宜于牛、羊捻转血矛线虫、日本血吸虫、伊氏锥虫和肝片吸虫病流行区的普查或监测     

伊氏锥虫在小鼠体内抗原变异规律及免疫保护试验

为了探索伊氏锥虫抗原的变异规律及其用于免疫预防的可能性，首先对伊氏锥虫安微株单虫克隆2个早期变异体ShTatl.1、ShTat1.2采用蛋白酶抑制剂TLCK处理，分离纯化这2种变异体的VSG，用ShTat1.1 VSG免疫KM小鼠，ShTat1.1锥虫攻击免疫鼠后6d分离锥虫，经间接免疫荧光试验（IFT）和班点酶标记试验（Dot-EIA)鉴定为ShTat1.2，说明同一克隆锥虫感染兔，小鼠第1次发生抗原变异后产生的变异体相同。依据这一规律，设计了免疫预防保护试验，试验小鼠分3组：一组为未免疫对照组，一组为ShTat1.1VSG单一抗原免疫组，另一组为ShTat1.1 VSG,ShTat1.2 VSG混合免疫抗原免疫组，各组均以ShTat1.1锥虫攻击，结果ShTat1.1 VSG ShTat1.2VSG免疫组小鼠全部获得保护，单用ShTat1.1 VSG免疫组小鼠和未免疫小鼠血中全部出虫、死亡，前者比后者出虫时间、存活时间延长。提示运用伊氏锥虫抗原变异这一规律设计的这种复合抗原，能激发宿主克服虫体抗原变异对免疫保护的干扰。     

伊氏锥虫多因素致弱苗免疫机理的研究——补体在体液免疫和细胞免疫中的作用实验

用我室研制的伊氏锥虫多因素致弱苗免疫马血清中的补体，观察其灭活前后对体液免疫和细胞免疫的作用。结果：灭活补体的免疫血清，在体外试验，对锥虫形态活力不认异常；巨噬细胞对用灭活补体的免疫血清处理的锥虫吞噬率仅达８％；在体内试验，锥虫对小白鼠具有致病力，潜伏期为３～５ｄ，存活期为８～１６ｄ。未灭活补体的免疫血清，可使锥虫形态异常，活力减退、停止；用未被灭活补体的免疫马血清处理的锥虫，注射小白鼠可健活６０～７０ｄ，巨噬细胞对未用灭活补体的免疫马血清处理的锥虫吞噬率高达９１％。生物试验表明：被吞噬的锥虫均无感染力。从而看出补体在本虫苗的体液免疫和细胞免疫方面具有极为重要的意义。     

同一克隆两个不同变异体的伊氏锥虫在兔体内抗原变异研究

为了解伊氏锥虫在兔体内感染后期抗原变异的情况及较同一克隆不同变异体锥虫在兔体内抗原变异情况,用伊氏锥虫安徽株单虫克隆ＳｈＴａｔ１．２感染兔,在兔体３０天中每隔３天及感染后５１、５４、５７天（兔５８天死亡）分离兔血中锥虫并克隆,获得１３个克隆锥虫群体,经间接免疫荧光试验和ＡＢＣ酶标记试验鉴定为１０个抗原性互不相同的抗原变异体（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｙｐｅ,ＶＡＴ）,其中早期（感染锥虫３     

2—C—7单克隆抗体对伊氏锥虫感染力的影响

2-C-7杂交瘤细胞株对伊氏锥虫有着专一反应性。为了探讨该杂交瘤细胞株所分泌的抗伊氏锥虫单克隆抗体的生物学活性,我们观察了用单抗处理过的伊氏锥虫对小白鼠的感染力。一、材料与方法 1.杂交瘤细胞培养上清液的收集及其抗体滴度的测定复苏2-C-7细胞株并培养、收集其上清液。用ELISA法测定其抗体阳性滴度,OD值为0.87,阴性对照OD值为0.04。     

用DEAE—纤维素柱分离伊氏锥虫

本文报道了用国产DEAE—纤维素从人工感染伊氏锥虫的小鼠、大鼠和犬的血液分离伊氏锥虫的具体方法,测定了压积DEAE—纤维素对小鼠、大鼠和犬的血液吸附值分别为0.25～0.41、0.23～0.39、0.33;伊氏锥虫的回收率,小鼠为83.19～98.19％,大鼠为84.87～93.85％。分离的锥虫形态正常,运动活泼,离心浓集后呈炼乳状,镜检无任何血细胞。此外,对用DEAE—纤维素分离伊氏锥虫的有关技术问题作了讨论。     

筛选伊氏锥虫单克隆抗体检测方法的建立—ELISA

首先采用DEAE纤维素柱层析法从感染动物血液中分离获得纯净的伊氏锥虫,通过超声乳化结合离心得到可溶性锥虫抗原,作为免疫接种及检测用:通过免疫大白鼠获得鼠抗伊氏锥虫阳性血清,用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG血清获得酶标抗体,经测试,抗原工作浓度为1:80(原浓度为2.57mg/ml),酶标抗体工作浓度为1:400,从而建立了酶联免疫吸附试验(ELISA),作为筛选抗伊氏锥虫单克隆抗体的检测手段。实践证明该方法灵敏度高,特异性强,使用方便。     

克隆伊氏锥虫对安锥赛抗药性的培育

为了深入观察伊氏锥虫对安锥赛抗药性的形成,将伊氏锥虫浙江水牛株克隆,克隆繁殖后的虫体一部分作为原种对照组,即C01组;一部分虫体连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,再用安锥赛亚治疗剂量治疗该小鼠,使其伊氏锥虫对安锥赛产生7个不同程度的抗药性组,即C1～C7组;另一部分虫体也连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,作为伴随C7的同步繁殖组,即不用药物的C02组.结果C01、C02、C1～C7组所用安锥赛剂量依次为0、0、6、16、40、80、196、406、638mg/kg,它们经小鼠传代数依次为0、28、1、3、6、9、15、22、28代.用体外生长繁殖抑制法测得它们的ICs0值依次为0.015 50、0.016 87、0.082 60、0.102 37、1.409 29、1.922 90、9.923 30、23.563 00、43.84000.结果表明,安锥赛亚治疗剂量与伊氏锥虫抗药性的IC50值呈曲线关系,从C1到C4的IC50值上升较缓慢,从C4后的ICs0值上升较快,并且几乎呈直线上升;伊氏锥虫所经小鼠的代数与它们的IC50值的关系呈抛物线型,从C1到C4的ICs0值上升很慢,C4以后的IC50值上升很快.用体内试验测试C01～C4组的CD100值,每个组感染35只小鼠,每只小鼠接种1.0×104条锥虫,其中30只小鼠分为安锥赛的3个剂量治疗小组,另5只小鼠为不治疗对照组.结果C01组和C1组的CD100值分别为7.0、13.0 mg/kg,这表明C1组只经1代免疫抑制小鼠,注射安锥赛剂量3×2 mg/kg,就使该组伊氏锥虫对安锥赛的抗药性提高了6 mg/kg,并且它们的IC50值C1是C01的6.6倍.C2、C3和C4组由于抗药性程度过高均不能治愈,因此尚未测到它们的CD100值.这些结果表明,伊氏锥虫经免疫抑制小鼠对安锥赛产生抗药性的速度是非常快的.     

伊氏锥虫多因素致弱苗免疫机理的研究——补体在体液免疫和细胞免疫…

用我室研制的伊氏锥虫多因素致弱苗免疫马血清中的补体，观察其灭活前后对体液免疫和细胞的作用。结果：灭活补体的免疫血清，在体外试验，对锥虫形态活力不认异常，巨噬细胞对用灭活补体的免疫血清处理的锥虫吞噬率仅达８％；在体内试验，锥虫对小白鼠具有致病力，潜伏期为３－５天，存活期为８－１６天，未灭活补体的免疫血清，可使锥虫形态异常，活力减退、停止；用示被灭活补体的免疫马血清处理的锥虫，注射小白鼠可健活６０－７