The crystal structure of human Argonaute2

Argonaute proteins form the functional core of the RNA-induced silencing complexes that mediate RNA silencing in eukaryotes. The 2.3 angstrom resolution crystal structure of human Argonaute2 (Ago2) reveals a bilobed molecule with a central cleft for binding guide and target RNAs. Nucleotides 2 to 6 of a heterogeneous mixture of guide RNAs are positioned in an A-form conformation for base pairing with target messenger RNAs. Between nucleotides 6 and 7, there is a kink that may function in microRNA target recognition or release of sliced RNA products. Tandem tryptophan-binding pockets in the PIWI domain define a likely interaction surface for recruitment of glycine-tryptophan-182 (GW182) or other tryptophan-rich cofactors. These results will enable structure-based approaches for harnessing the untapped therapeutic potential of RNA silencing in humans.     

利用CRISPR_Cas9技术创建拟南芥Argonaute2基因缺失突变体

Argonaute2(AGO2)在植物抗病和发育过程中发挥重要作用。为创制拟南芥ago2核苷酸插入/缺失突变体材料,分析了拟南芥AGO2基因结构,选择其外显子上3个靶点构建了CRISPR_Cas9基因编辑载体,并通过农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥,利用潮霉素对T₀代种子进行筛选,获得62株T₁代抗性苗;然后提取T₁代抗性苗DNA,进行潮霉素特异引物PCR扩增检测,确定获得53棵转基因阳性苗。随机选择10株T₁代阳性苗,扩增包含靶点的基因片段进行测序,结果显示,在第1个靶点附近6株苗产生了编辑,第2靶点附近10株苗全部成功编辑,第3个靶点未发生编辑。编辑位点附近产生了多种编辑形式,以PAM前删除或者增加1个碱基的形式出现频率最高,也有删除大于10碱基的编辑形式,最长可删除106个碱基。这些突变株系的获得为深入研究拟南芥AGO2的功能提供了丰富的遗传材料。     

原核Argonaute的应用研究进展

原核生物Argonautes （pAgos）是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸（ssDNA/ssRNA）向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬菌体感染。pAgos作为一类新兴的可编程核酸酶,比目前应用最为广泛的CRISPR-Cas系统更具灵活性,在生物技术方面展现出巨大的潜力。早期的研究聚焦于嗜热的pAgo,目前基于嗜热pAgos的主要应用包括分子诊断和体外DNA组装。为了推进基于Ago的体内生物技术,如基因编辑的应用,研究人员的焦点逐渐转移到中温生物来源的pAgos,虽然目前pAgos还未实现基因组编辑,但是随着越来越多的pAgo被发掘以及研究人员对pAgos催化机制的深入研究,有望开发基于pAgos的下一代基因编辑技术。本文总结了已知代表性pAgos和基于pAgos发展的生物技术,并简要分析了pAgos在原核生物和真核生物体内应用面临的挑战和可能的应对策略。     

RNA干扰机制及其主要蛋白因子研究进展

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)分子介导的、在mRNA水平上关闭相应序列基因表达、使其沉默的过程。RNAi作为一种古老而保守的基因沉默机制,广泛存在于真核生物体内,在细胞的发育调控、抗病毒防御、修复遗传损伤、调节正常的基因等生命过程中起着重要的作用。RNAi机制可以分为3个阶段：启动阶段、效应阶段及扩增阶段。RNAi干扰相关的主要蛋白因子有Dicer酶、Argonaute(AGO) 蛋白家族和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA\|dependent RNA polymerase, RdRP)。文章对RNAi机制及其相关主要蛋白因子进行简要综述。     

R2D2, a bridge between the initiation and effector steps of the Drosophila RNAi pathway

The RNA interference (RNAi) pathway is initiated by processing long double-stranded RNA into small interfering RNA (siRNA). The siRNA-generating enzyme was purified from Drosophila S2cells and consists of two stoichiometric subunits: Dicer-2(DCR-2) and a previously unknown protein that we named R2D2. R2D2 is homologous to the Caenorhabditis elegans RNAi protein RDE-4. Association with R2D2 does not affect the enzymatic activity of DCR-2. Rather, the DCR-2/R2D2 complex, but not DCR-2 alone, binds to siRNA and enhances sequence-specific messenger RNA degradation mediated by the RNA-initiated silencing complex (RISC). These results indicate that R2D2 bridges the initiation and effector steps of the Drosophila RNAi pathway by facilitating siRNA passage from Dicer to RISC.     

芥菜cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化研究

[目的]研究芥菜Cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化,为后期对两者关系的进一步研究提供参考。[方法]在克隆芥菜类茎瘤芥Cry2基因的基础上,构建该基因的RNAi载体,并导入根瘤农杆菌GV3103,获得工程菌株后,通过农杆菌浸染茎瘤芥子叶外植体进行植物体转化,并验证转化结果。[结果]成功构建了茎瘤芥Cry2基因的RNAi载体,并建立了茎瘤芥遗传转化体系,获得了转基因植株。[结论]茎瘤芥Cry2 RNAi的构建及遗传转化体系的建立为后期深入研究茎瘤芥熟期相关基因的功能及基因工程应用奠定了基础。     

水稻中SUSIBA2相似基因RNA干扰体系的建立

大麦糖信号转录因子SUSIBA2是WRKY超基因家族的一员,通过识别某些淀粉合成酶基因启动子区的糖应答元件调控胚乳中淀粉的积累.本研究根据SUSIBA2序列,从水稻基因组中搜索到1个与SUSIBA2相似的基因,称为SUSIRI.利用PCR方法,从水稻基因组DNA中克隆出该基因第3外显子455 bp的片段,它包含1个WRKY保守结构域.以此作为干扰序列,构建了干扰载体.通过农杆菌介导法将其转化水稻,获得了16株T0代阳性植株.     

甘蓝型油菜△^12-油酸去饱和酶基因RNAi载体的构建

通过基因工程手段抑制甘蓝型油菜△^12-油酸去饱和酶（delta-12 oleate desaturase FAD2）基因的表达，从而使油酸脱饱和产生亚油酸的步骤受阻，达到富集油酸，减少多不饱和脂肪酸含量的最终目的。依据植物RNA干扰的原理和研究中用于构建RNAi载体的基本经验，选择油菜fad2基因片段（510bp）分别以反向和正向的形式插入到油菜napin启动子下游，并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入1个来源于豌豆的rbcS-3C基因内含子（83bp）及其剪切位点之前5bp、之后4bp片段。组装完成的fad2 RNAi载体转入到植物双元表达载体pCAMBIA3301，植物筛选标记基因采用抗灭生性除草剂PPT的选择基因bar及报告基因gus，从而构建成以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。     

甘蓝型油菜Δ12-油酸去饱和酶基因RNAi载体的构建

通过基因工程手段抑制甘蓝型油菜Δ12-油酸去饱和酶(delta-12 oleate desaturase FAD2)基因的表达,从而使油酸脱饱和产生亚油酸的步骤受阻,达到富集油酸,减少多不饱和脂肪酸含量的最终目的。依据植物RNA干扰的原理和研究中用于构建RNAi载体的基本经验,选择油菜fad2基因片段(510bp)分别以反向和正向的形式插入到油菜napin启动子下游,并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入1个来源于豌豆的rbcS-3C基因内含子(83bp)及其剪切位点之前5bp、之后4bp片段。组装完成的fad2RNAi载体转入到植物双元表达载体pCAMBIA3301,植物筛选标记基因采用抗灭生性除草剂PPT的选择基因bar及报告基因gus,从而构建成以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。     

烟草基因组中AGO蛋白的生物信息学分析

对在NCBI上登录的烟草AGO蛋白(argonaute proteins)的信息进行了整理,并对其组成成分、系统发育树、信号肽、跨膜结构域、细胞定位、亲水性/疏水性、蛋白质的二/三级结构等进行了预测和分析。结果表明:在烟草基因组中共有22个AGO蛋白,可分为8类;烟草的AGO蛋白与拟南芥的AGO一样在进化上分为3个分支,其编码的蛋白是一个无跨膜结构域、无信号肽/导肽的亲水性蛋白,α-螺旋散布于整个蛋白质中,具有PAZ和PIWI两个特征结构域。此外,烟草的AGO2/4/7/16/PNH1定位在细胞核中,AGO10定位在细胞质中,AGO5定位在线粒体中。     

烟草基因组中AGO蛋白的生物信息学分析

对在NCBI上登录的烟草AGO蛋白(argonaute proteins)的信息进行了整理,并对其组成成分、系统发育树、信号肽、跨膜结构域、细胞定位、亲水性/疏水性、蛋白质的二/三级结构等进行了预测和分析。结果表明:在烟草基因组中共有22个AGO蛋白,可分为8类;烟草的AGO蛋白与拟南芥的AGO一样在进化上分为3个分支,其编码的蛋白是一个无跨膜结构域、无信号肽/导肽的亲水性蛋白,α-螺旋散布于整个蛋白质中,具有PAZ和PIWI两个特征结构域。此外,烟草的AGO2/4/7/16/PNH1定位在细胞核中,AGO10定位在细胞质中,AGO5定位在线粒体中。     

苹果树腐烂病菌Argonaute基因鉴定及功能初步分析

Argonaute(AGO)蛋白作为沉默复合体RISC的重要组成部分,直接影响小RNA分子的调控功能。为了明确苹果树腐烂病菌(Valsa mali)AGO蛋白的生物学功能,以揭示苹果树腐烂病菌小RNA分子作用机制奠定基础。本研究从苹果树腐烂病菌基因组中比对出2个AGO蛋白的编码基因VMAGO1和VMAGO3,序列分析发现其均具有Argonaute的标志性功能结构域PAZ和PIWI,并与粗糙脉孢菌和构巢曲霉的AGO蛋白具有高度的同源性。基于同源重组原理成功获得了VMAGO1和VMAGO3的基因单缺失突变体,其菌落、菌丝形态及菌落生长速率与野生型03-8相比没有明显变化。此外,VMAGO1和VMAGO3的缺失不影响病菌对盐离子胁迫的响应,而VMAGO3能够参与病菌对pH、H2O2胁迫的响应,且VMAGO3的缺失能够影响病菌的致病力,其具体调控机理还需进一步验证。     

Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells

A complete, cloned complementary DNA copy of the RNA genome of poliovirus was constructed in the Pst I site of the bacterial plasmid pBR322. Cultured mammalian cells transfected with this hybrid plasmid produced infectious poliovirus. Cells transfected with a plasmid which lacked the first 115 bases of the poliovirus genome did not produce virus.     

Strawberry FaEtr2 gene RNAi expression vector construction and genetic transformation

The short hairpin RNA (shRNA) expression vector of the FaEtr2 gene was constructed by inserting the sense fragment into the constructed antisense vector of FaEtr2 (pBI121-Anti-Etr2) in sense orientation. The constructed RNA interference (RNAi) expression vector was transformed into Agrobacterium fumefeciens LBA4404 and used to infect strawberry leaves. Using in vitro plantlet leaves as explants, the transformation conditions of All-Star strawberry were studied systemically. The results showed that infecting the leaves with A. fumefeciens resuspension liquid of OD₆₀₀ = 1.0 by pre-culturing for 3 d, co-culturing for 3 d, infecting for 10 min, and adding acetosyringone (AS) 50–100 μmol·L⁻¹ was suitable for genetic transformation of All-Star strawberry. Seven lines of transgenic plants were preliminarily identified by PCR and β-glucurondiase (GUS) histochemical staining.     

Argonaute蛋白结构及其在植物中的研究进展

在真核细胞中,许多小的非编码RNA与Argonaute蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体,并通过识别互补的靶标RNA来调控基因表达,此过程叫RNA干扰。在植物的RNA干扰途径中,Argonaute-sRNA复合物可以通过多种不同的机制发挥作用,进而参与病原体防御、植物发育调控等关键的生物过程。综述了Argonaute蛋白的分类和结构特征、在植物体中参与RNA干扰的机制及生物学功能等研究进展。