异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体的微管动态变化

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎（Crassostrea gigas）精子激活栉孔扇贝（Chlamys farreri）卵子,并用6-DMAP诱导染色体加倍的方法,获得第二极体抑制型雌核发育二倍体早期胚胎。多聚甲醛固定、免疫荧光染色后,运用荧光显微镜观察栉孔扇贝正常发育卵子和异源精子诱导的雌核发育卵子,对其受精过程中微管的动态变化过程进行观察和分析。结果表明：（1）正常发育组受精卵内以微管为基础的纺锤体能够顺利地组装并引导卵细胞进行减数分裂和第一、第二极体的排放,以及雌、雄原核融合和第一次卵裂;（2）异源精子诱导雌核发育的卵子经6-DMAP处理后,部分微管变得模糊或消失,纺锤体受到破坏导致染色体的分离无法进行,第二极体的形成受到抑制并使雌核染色体二倍化;去除6-DMAP作用后,微管重新组装,雌核分裂重新启动继而进行卵裂;精核保持固浓缩状态或轻微膨胀形成雄性原核,但卵裂后期则以致密的染色质体（DCB）形式存在于分裂沟上或进入一个卵裂球中。结果证实,长牡蛎精子经紫外线遗传灭活后可顺利进入并激活栉孔扇贝成熟卵子但不参与合子核的形成,6-DMAP也可有效抑制第二极体的排放而获得雌核发育二倍体胚胎。本实验结果为研究异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育的可行性提供了细胞学依据。     

栉孔扇贝异精雌核发育四倍体早期胚胎发育的细胞学荧光显微观察

用1500μW/cm2的紫外线照射长牡蛎(Crassostrea gigas)精子60 s以进行灭活处理,并使之与栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵子受精,在卵子受精后排出第一极体前用6-DMAP(50 mg/L)处理受精卵,持续处理35 min,抑制第一极体和第二极体的排放,诱导异精雌核发育四倍体。采用二脒基苯基吲哚(DAPI)荧光染色显微观察法,对灭活的长牡蛎精子诱导的栉孔扇贝雌核发育四倍体早期胚胎发育过程进行细胞学观察。结果表明:经紫外线灭活过的长牡蛎精子进入栉孔扇贝卵子后发生轻微膨胀;在第一次卵裂中期,精核形成一致密的染色质小体(DCB),位于两组分开的母本染色体之间,不参与核分裂;第一次卵裂结束时DCB滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其中一分裂球中;第二次卵裂过程中,DCB的去向与第一次卵裂时基本一致。6-DMAP处理有效地抑制了第一极体和第二极体的排出,从而使雌核四倍化。对担轮幼虫染色体倍性分析结果表明,通过本方法可以获得6.25%的四倍体幼虫。本研究还对灭活的异源长牡蛎精子诱导栉孔扇贝雌核发育四倍体过程中产生的复杂倍性、核物质分离紊乱及多精附卵现象进行了观察和分析。     

栉孔扇贝♀和长牡蛎♂杂交受精及早期胚胎的细胞学研究

以栉孔扇贝Chlamys farreri为母本、长牡蛎Crassostrea gigas为父本进行人工杂交。采用Bouin氏液固定、石蜡切片和苏木精-伊红染色在光镜下对其受精和第1次卵裂过程中核相变化进行观察;运用压片法和热滴片法分别对4～8细胞期和担轮幼虫期胚胎进行染色体制片。结果表明,长牡蛎精子可以进入栉孔扇贝卵子,并激活卵子减数分裂使其释放第1极体（PB1）和第2极体（PB2）,能够形成雌、雄原核并融合为合子核,接着受精卵开始第1次卵裂;杂交胚胎发育过程中,囊胚期很长、胚胎畸形严重,只能发育到担轮幼虫期;杂种胚胎染色体数目变化范围较大,在20～85之间,染色体不能平均分配到两个子细胞中是杂种胚胎死亡的主要原因。杂交胚胎不能存活保证了异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育的可靠性。     

人工诱导栉孔扇贝雄核发育早期的荧光显微镜观察

利用荧光显微镜观察栉孔扇贝(Chlamysfarreri)正常卵子与雄核发育卵子在减数分裂、受精过程和卵裂早期中的核相变化。雄核发育单倍体是将强度为2.8mW/(cm2·s)的紫外线照射20s的卵子与正常精子受精后得到的。结果表明,尽管紫外线照射并没有影响卵子的成熟分裂及雌性、雄性原核的形成,但它们的发生过程滞后。在第1卵裂中期,雄核发育卵子中雌性原核并不像雄性原核一样形成染色体,而是形成1个浓缩的染色质小体(DCB)。第1卵裂后期,DCB不参与核分裂。第1卵裂结束时,DCB位于2个分裂球其中之一的细胞质内或在赤道板处被分割成两部分。实验结果首次提供了栉孔扇贝雄核发育的细胞学证据。     

异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体适宜参数的探索

采用照射强度为1500μw/cm2的紫外线对长牡蛎(Crassostrea gigas)精子照射60s,将处理后的精子分别与长牡蛎和栉孔扇贝(Chlamys farreri)的卵子进行受精试验,受精后11.5h用浓度为60mg/L的6-DMAP对栉孔扇贝受精卵分别持续处理15、20、25、30min,运用热滴片法对各实验组进行倍性检测。结果表明,长牡蛎同源单倍体组中单倍体率为75.6%;栉孔扇贝异源单倍体组中单倍体率为14.7%,最佳药物持续处理时间为20min,其二倍体率为24.1%;异源诱导栉孔扇贝单倍体组和二倍体组中胚胎均可以发育到D形幼虫期,其单倍体组中的D形幼虫率为5.0%,20min药物加倍二倍体组D形幼虫率最高为6.1%。本实验结果为异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育提供了诱导参数依据。     

虾夷扇贝×栉孔扇贝人工受精过程的荧光显微观察

采用 DAPI染色显微荧光方法 ,连续观察了虾夷扇贝×栉孔扇贝的正反交受精细胞学过程。无论正交或反交 ,精子均可正常入卵 ;受精卵能顺利完成第 1次、第 2次减数分裂 ,排出第一、第二极体 ;精子和卵子内的各一套染色体融合后 ,形成二倍体的合子进入正常的细胞分裂 ,其发育过程同母本     

泥蚶（♀）×毛蚶（♂）受精及胚胎发育过程的初步研究

以泥蚶为母本、毛蚶为父本,运用同步催产法,同时收集泥蚶的卵和毛蚶的精子进行人工杂交,采用普通光镜和荧光显微镜,对泥蚶(♀)×毛蚶(♂)受精及胚胎发育的细胞学过程进行了连续观察。结果显示,毛蚶的精子可以附着并穿过泥蚶的卵膜进行受精,并激活卵子减数分裂使其释放第一极体(PB1)和第二极体(PB2),能够形成雌、雄原核并发生原核联合,接着受精卵开始进行卵裂;杂交受精率统计为60.2%,发育速度较自交组慢;杂交胚胎发育前两次卵裂发育基本正常,后期才出现明显畸形;囊胚期持续时间很长,只能发育到担轮幼虫期,且纤毛越来越长,最后全部死亡。另外,在实验中发现有多精入卵和多极分离现象。     

6-DMAP诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体机理研究

采用多聚甲醛固定、免疫荧光染色的方法,在荧光显微镜下对栉孔扇贝(Chlamys farreri)正常发育受精卵和6-DMAP第二极体抑制型雌核发育卵受精过程中纺锤体变化以及雌雄原核的移动过程进行了观察。结果显示,正常发育受精卵内微管能聚合形成纺锤体并牵引中期染色体移向两极,依次排出第一极体、第二极体,雌雄原核融合为合子核,进行第一次卵裂。雌核发育受精卵内,随6-DMAP处理时间的延长,星体微管消失,纺锤体被拉长变得扁平,最终导致中期纺锤体解散,第二极体的形成被抑制;6-DMAP处理过程中,受精卵中的精核始终处于皮层区域,不能形成雄原核,雌原核和精核几乎不移动,去除6-DMAP后,雌原核和精核恢复移动,但移动速度与对照组相比要慢。     

栉孔扇贝人工雌核发育的细胞学观察

运用荧光显微镜观察了栉孔扇贝正常卵子与雌核发育卵子在受精和成熟分裂过程中的核相变化。结果表明,尽管紫外线照射没有影响受精卵的成熟分裂以及雌性、雄性原核的形成,但使雌核卵的发育速度出现明显的滞缓。在第1次卵裂中期,雌核发育卵子中的雄性原核没有像雌性原核那样形成染色体,而是浓缩为一染色质小体(DCB),游离在细胞质中,不参与核分裂。胞质分裂结束时,DCB位于2个卵裂球之一的细胞质内或在赤道板处被分割成两部分。实验结果首次提供了栉孔扇贝雌核发育的细胞学证据。     

6-DMAP诱导栉孔扇贝异源雌核发育二倍体

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎精子激活栉孔扇贝卵子,运用L9（3^4）设计不同6-DMAP的处理条件来诱导染色体加倍,获得第二极体抑制型栉孔扇贝雌核发育二倍体早期胚胎。以雌核发育担轮幼虫为材料,滴片法制备染色体并采用计数法统计倍性,分析不同6-DMAP浓度、诱导时机和诱导持续时间对雌核发育二倍体诱导率的影响,并统计早期胚胎畸形率。结果表明,不同6-DMAP浓度、诱导时机和诱导持续时间对异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体的诱导率均有显著影响;早期胚胎畸形率与二倍体的诱导率呈负相关,y=46.632-0.891x（r=-0.813,P〈0.01）。6-DMAP诱导栉孔扇贝雌核发育二倍体的最佳处理条件为：20%～25%受精卵排放出第1极体时,60μg/ml的6-DMAP持续处理25min可得到最高的诱导率为29.5±5.36%。研究结果为6-DMAP诱导栉孔扇贝雌核发育染色体加倍提供了一定的细胞学依据和技术参数。     

异源精子诱导栉孔扇贝雌核发育后代的微卫星分析

采用紫外线遗传灭活的长牡蛎精子激活栉孔扇贝卵子,6-DMAP诱导染色体加倍的方法,获得第二极体抑制型雌核发育二倍体早期胚胎。通过优化PCR反应条件,在11对栉孔扇贝和10对长牡蛎微卫星引物中共筛选出3对引物,可以同时在长牡蛎和栉孔扇贝基因组中获得稳定性,多态性较好的特异性扩增条带,其中2对引物为栉孔扇贝引物。利用筛选出的3对通用微卫星引物对雌核发育后代进行检验及遗传分析。结果表明,雌核发育个体基因完全来自于母本,后代中没有父本基因的表达;部分雌核发育后代在3个座位上发生了纯合,部分个体发生了不同程度的基因重组,3个座位上的重组率分别为40%、55%和35%。研究结果从分子水平上证实,利用遗传失活的长牡蛎精子诱导栉孔扇贝雌核发育是可行的,只进行一次第二极体抑制型雌核发育二倍体的诱导只能获得部分后代个体的基因纯合,但后代与母本具有较高的遗传同质性。     

栉孔扇贝雄核发育二倍体的人工诱导

研究了利用6-二甲基氨基嘌呤(60μg/mL;6-DMAP)抑制第1卵裂诱导栉孔扇贝[Chlamys farreri(Jones et Pre-ston)]雄核发育二倍体的条件。雄核发育单倍体是将强度为2.8 mW/(cm2.s)的紫外线照射20 s的卵子与正常精子受精后得到的。6-DMAP不仅可以有效地抑制减数分裂,还可以有效地抑制有丝分裂;抑制第1卵裂的适宜起始时间为受精后80 min,诱导率为21.0%~22.6%。细胞学观察显示,6-DMAP抑制第1卵裂产生的雄核发育二倍体主要来源于第1卵裂中期的受精卵,由于阻止了染色体分离和原核移动,导致一个融合的二倍性雌性原核的形成;经紫外线照射的卵核在第1卵裂中期没能形成染色体,而是形成1个浓缩的染色质小体,没有参与第1卵裂后期的核分裂。尽管倍化率和D形幼虫发生率较低,但本研究证实了栉孔扇贝雄核发育二倍体人工诱导的可行性。[中国水产科学,2006,13(4):585-590]     

6-DMAP诱导栉孔扇贝三倍体的细胞学观察

用Bouin氏液固定、连续石蜡切片方法,对6-二甲基氨基嘌呤(简称6-DMAP)抑制第二极体诱导栉孔扇贝三倍体在受精和早期卵裂过程中的细胞学变化进行了详细观察。结果表明,在授精后25min,以60mg/L的6-DMAP处理栉孔扇贝受精卵15min,有效地破坏了纺锤体结构的形成,抑制了第2次减数分裂进程,致使受精卵内形成两种核相:一种是1个大的二倍性雌核和1个雄核;另一种是两个单倍性的雌核和1个雄核。不论形成几个雌原核,它们都能与雄原核相互靠近,在卵轴中央核膜逐渐发生融合,形成合子核,三倍体的合子核在卵内所占体积明显较二倍体的大。继而,合子核经过DNA复制,最后凝缩成染色体,发生有丝分裂,其过程与正常二倍体相同。     

近江牡蛎受精过程、胚胎及早期幼虫发育特征

为了解近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)从受精到早期幼虫发育阶段的发育特性，在水温22～24℃、盐度20～22的实验室环境中对采自山东东营丁字湾海域的近江牡蛎进行人工授精，利用普通光学显微镜和荧光显微镜对近江牡蛎受精、早期胚胎和幼虫发育过程中的形态和核行为变化进行观察，并对这一过程中牡蛎的壳长变化进行了统计分析。结果表明，近江牡蛎成熟的未受精卵呈梨形，卵径为50μm左右，核相处于第一次成熟分裂中期。受精卵在受精后15～20 min、25～30 min,先后排出第一、第二极体，完成第一次和第二次成熟分裂，在受精后30 min左右先后形成雄原核和雌原核；雌、雄原核各自形成染色体组，在卵子中央发生联合，染色体排列于赤道板上，形成第一次有丝分裂的中期分裂相；受精后45 min左右，受精卵进行第一次卵裂，形成2个体积不等的卵裂球；受精75 min后，受精卵开始第二次卵裂，90 min后形成4个卵裂球，进入4细胞时期；6 h后受精卵发育至桑葚期，8～10 h进入囊胚期，12～15 h后发育至担轮幼虫，27～30 h左右发育成D形幼虫，5 d左右进入壳顶幼虫时期，17 d后幼虫...     

刺参受精及早期胚胎发育过程的细胞学观察

采用HOECHST 33258染色荧光显微方法,对刺参成熟未受精卵以及受精过程中精子入卵、极体排放、雌雄原核的形成与结合、早期卵裂以及多精入卵等细胞学进行了研究。结果显示,刚产出的刺参成熟未受精卵呈圆形,核相处于第一次成熟分裂中期;在水温22~23 ℃、盐度29条件下进行受精,受精后12 min,完成第一次成熟分裂,释放第一极体;受精后20 min,大部分受精卵完成第二次成熟分裂,放出第二极体。受精后35 min,雌、雄原核开始在卵中央发生染色体联合;受精后80 min,部分受精卵完成第一次卵裂,受精后100 min,部分受精卵完成第二次卵裂。刺参在受精过程中存在极少数的多精入卵现象。     

栉孔扇贝正常发育和人工雌核发育二倍体早期胚胎核行为的细胞学观察

采用Bouin氏液固定、石蜡切片和苏木精-伊红染色方法，在光镜下对栉孔扇贝正常发育和6-DMAP第二极体抑制型雌核发育二倍体卵在受精和第一、二次卵裂过程中的核相变化进行了详细观察。结果表明，正常发育卵内的雌、雄原核能融合为合子核，而雌核发育卵内的精核、雌核变化相当复杂。精核至少存在两种状态：（1）精核只在刚入卵时发生轻微膨胀，以后保持固缩状态，不膨大形成雄原核；（2）在第二次成熟分裂之后，精核再次去浓缩膨胀，但其体积并未达到正常雄原核的大小。在第一、第二次卵裂过程中，此精核不参与核分裂，以致密的染色质体（DCB）存在于两组分开的母本染色体之间，卵裂结束时滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其一的细胞质中。受精卵经6-DMAP处理，雌核形成第二极体的过程受到有效抑制，导致雌核二倍化。此外，作者对实验中出现的多精入卵和多极分离现象进行了观察和分析。     

栉孔扇贝的生殖周期

本文介绍了栉孔扇贝生殖细胞的发生、生殖腺成熟度和生殖周期的研究结果。作者把栉孔扇贝的卵细胞发生分为卵原细胞期、无卵黄期、卵黄形成前期、卵黄形成后期和成熟期五个阶段；把精子的发生过程分为精原细胞期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精细胞期和精子期五个阶段。对于栉孔扇贝生殖腺的发育过程，作者根据生殖细胞在滤泡中所占的比例，把它分成增殖期、生长期、成熟期、生殖期和休止期五个阶段。栉孔扇贝的性腺发育在青岛海区为一年一个周期，但其繁殖高峰则有二次，这表明栉孔扇贝的成熟期和生殖期二者是相互重叠的。此外，作者也观察到了栉孔扇贝的雌雄同体现象。     

扇贝异源三倍体诱导

荧光显微观察表明,20℃水温下,栉孔扇贝(Chlamysfarreri)的卵与海湾扇贝(Argopecten irradians)的精子可以正常受精和发育,具备人工诱导三倍体的可行性.亲贝充分促熟后,分开催产,以20:1的精卵比授精;在50%的受精卵排出第1极体时,以60mg/L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)处理受精卵10～25 min,可诱导75.23%～92.14%的三倍体;6-DMAP处理15 min综合诱导效果最好,三倍体诱导率可达88.56%,孵化率可达53.52%.得到的三倍体幼虫经基因组原位杂交(Genomicin situ hybridization,GISH)验证,为含有2套栉孔扇贝染色体组和1套海湾扇贝染色体组的异源三倍体.孵化后诱导组与杂交对照组(未经6-DMAP处理)幼虫生长越来越缓慢,受精后14 d其幼虫存活率分别下降到0.000 67%和0.002 24%,没有幼虫度过附着变态期.GISH分析显示,栉孔扇贝与海湾扇贝不同倍性的杂种后代早在担轮幼虫阶段就出现母本偏向性染色体转变.     

缢蛏受精和早期卵裂过程的细胞学变化观察

采用普通光镜、荧光显微镜和石蜡切片技术,对缢蛏受精和早期卵裂过程中的精子入卵、减数分裂、雌雄原核形成与结合、早期卵裂以及多精入卵等细胞学事件进行了显微观察。结果表明,缢蛏成熟未受精卵多呈圆球形或卵圆形,少数呈梨形,卵径为82～88μm,核相处于第一次成熟分裂中期;精子为典型的原生型,全长55～58μm,头部呈保龄球形,顶体前端的顶体杆呈特别细长的花丝状;在水温21～22℃、盐度10的条件下进行人工授精,精、卵混合后,精子迅速附着于卵子表面,启动卵子发育;受精后4～6 min,精子的头部已进入卵内并明显膨胀,卵子外形变圆,卵外附着的精子量明显减少;在受精后12～15 min、20～25 min,受精卵先后排出第一极体、第二极体,完成两次成熟分裂;第二次成熟分裂结束以后,精、卵核体积迅速膨胀,雄原核的膨胀早于雌原核,核膜重建,在受精后约30 min形成雌、雄原核;雌、雄原核均向卵子中央移动,雄原核旁边的精子星光清晰可见,随后二者在卵子中央以染色体联合的方式结合,联合核的染色体共同排列在纺锤体的赤道板上,形成第一次有丝分裂的中期分裂相;受精后40 min左右,受精卵进行第一次卵裂,染色体在纺锤丝的牵引下向两极移动,结果形成2个大小不等的卵裂球;受精后45～50 min,卵子进行第二次卵裂,核相变化与第一次卵裂相同,在与第一次卵裂垂直的纵轴方向上发生不等全裂,最终形成3小1大4个卵裂球;受精后60～70 min,胚胎进行第三次卵裂,仍为不等全裂,但自此次卵裂起已开始进行螺旋分裂。此外,对实验中发现的缢蛏极少量多精入卵、多极分离等异常细胞学现象进行了分析,并探讨了海洋贝类卵子阻止多精入卵发生的机制。     

管角螺受精过程的荧光显微观察及保育卵形成分析

为了研究管角螺受精卵在受精和早期卵裂过程中的核相变化以及保育卵的形成,实验通过Hoechst 33258染色、荧光显微观察方法,对管角螺受精和早期卵裂过程中核行为的细胞学变化进行了详细观察,并对其胚胎发育过程中的数量变化进行统计分析。结果显示,管角螺的成熟未受精卵呈卵圆形,平均卵径(0.33±0.03)mm,核相处于第一次成熟分裂中期,在水温为(26±2)°C条件下,1 h精子入卵,2~3 h受精卵先后排出第1、第2极体,完成第一次和第二次成熟分裂,6 h雌、雄性原核形成,靠近融合,第一次卵裂形成2细胞,12~24 h时2细胞继续分裂生成4细胞。研究表明,管角螺受精卵在成熟分裂和卵裂过程中表现出发育的不同步性,同个卵荚内多个发育阶段共存,受精率为43.14%,而受精卵正常发育概率仅5.70%。卵荚内多数卵子不受精或者受精卵停止发育,成为营养卵(保育卵),为正常可育卵消化利用,这两种来源的保育卵比率约为3∶2。管角螺胚胎发育过程中,1~6 d内胚胎数减少明显,担轮幼虫发育率为0.48%,之后数量稳定,直至稚螺出膜。