《中国蔬菜》2011·12 学术论文导读

无抗性选择标记转基因技术在蔬菜作物上的应用王烨等(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081)—《中国蔬菜》2011(12)在广为应用的植物转基因技术中,绝大多数采用的是各种抗性基因作为选择标记,而这正是转基因植物对生态环境和人类食品、药品安全影响的隐患所     

无选择标记转基因植物研究进展

随着转基因技术的诞生,转基因植物中选择标记基因的安全性已受到了广泛的关注.如何培育无选择标记基因转基因植物已成为基因工程研究的重点.主要综述了几种培育无选择标记转基因植物的原理及其国内外研究进展.     

无选择标记转基因植物的研究进展

为了避免选择标记基因的使用对环境及植物体的生长发育带来的不利影响,消除人们对转基因植物中选择标记基因的安全性顾虑,培育无选择标记的转基因植物目前已成为植物基因工程研究的热点.现主要综述几种剔除选择标记基因方法在转基因植物中的研究进展.     

安全选择标记的转基因食用菌研究进展

在食用菌外源基因转化过程中,目的基因的导入常需要串联易于识别的选择标记基因,用于转化子的筛选。当筛选完成后,选择标记基因特别是抗性标记基因的存在即是多余的,甚至是有害的,存在生物安全隐患。有鉴于此,本文对获得安全选择标记基因的转基因食用菌作一综述。     

利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因菊花

为获得具有无选择标记的转基因菊花,构建了一个双T-DNA超级双元载体pCAMBIA1301-gus,其中一个T-DNA结构域中含有选择标记基因hpt,另一个T-DNA结构域中含有目的基因gus,而且两个T-DNA结构顺序相连,中间没有其他插入序列.利用农杆菌介导转化菊花幼嫩茎尖薄层细胞,共获得506个抗性植株,通过PCR和Southern杂交检测表明共转化率为38.4%,对其中17个同时整合了hpt和gus基因的植株自交获得的T1代株系进行检测,发现约有15.8%的T1代植株中不含选择标记基因hpt,结果表明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记转基因植物.     

利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因菊花的研究

为获得具有无选择标记的转基因菊花,构建了一个双T-DNA超级双元载体pCAMBIA1301-gus,其中一个T-DNA结构域中含有选择标记基因hpt,另一个T-DNA结构域中含有目的基因gus,而且两个T-DNA结构顺序相连,中间没有其他插入序列。利用农杆菌介导转化菊花幼嫩茎尖薄层细胞,共获得506个抗性植株,通过PCR和Southern杂交检测表明共转化率为38.4%,对其中17个同时整合了hpt和gus基因的植株自交获得的T1代株系进行检测,发现约有15.8%的T1代植株中不含选择标记基因hpt,结果表明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记转基因植物。     

安全标记基因pmi在果树转基因研究中的应用进展

 关于木本植物转基因成功的报道很多,但木本果树的转化效率较低。甘露糖/PMI筛选体系以pmi为安全标记基因,实现对转化细胞安全、高效地正向选择。从甘露糖/PMI筛选体系的作用原理,影响其筛选效率的主要因素,与其它筛选体系的对比优势（高效、安全、易于检测）等几个方面综述了这一筛选体系在木本果树转基因研究上的应用现状及其发展前景。     

生物技术在百合育种上的应用

生物技术在百合上的应用主要包括以下几个方面:利用植物离体培养技术成功建立了百合快速繁殖体系和脱毒苗生产技术程序;利用胚胎拯救技术克服了百合杂交前后障碍获得百合新品种;蛋白质分子标记、DNA分子标记在百合的初步应用;通过农杆菌介导法、基因枪法、电激法等进行了百合的遗传转化,并通过基因枪法成功地获得了百合转基因的植株.     

分子标记辅助选择在甜瓜抗病育种研究中的应用

分子标记辅助选择(marker assistant selection,MAS)是指在基因克隆或定位的基础上,通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记,在群体中对含有目标性状的个体进行选择。分子标记辅助选择可以大大缩短育种年限、提高育种效率,已广泛的应用在作物育种研究中。本文就分子标记辅助选择在甜瓜抗病育种研究中的应用进行了综述,旨在为培育具有综合抗性的甜瓜新品种提供参考。     

柑橘抗CTV转基因与分子标记研究进展

综述了柑橘抗衰退病基因工程中两方面的研究进展。介绍多种来源于柑橘衰退病毒(Citrustriztezavirus,CTV)核酸序列的转基因柑橘和抗性种质资源中抗性基因的分子标记,以及所涉及的方法和遇到的问题。目前研究表明,虽然已成功实现对病毒衣壳蛋白(CP)等基因的转化和Ctv等抗性基因的标记,但尚未获得对CTV有高度抗性的转基因柑橘,而抗性基因亦不能实现定点克隆和转化。因此上述两方面研究还有待深入。     

中国野生葡萄果实抗白腐病基因的分子标记

 以感病×抗病的葡萄种间杂交组合白玉霓×塘尾的F₁ 代17 个单株及塘尾自交一代16 个单株为试材, 采用BSA 法和RAPD 技术, 通过对155 个随机引物的筛选, 获得了一个与中国野生葡萄抗白腐病基因连锁的RAPD 标记OPP09-760 , 并在中国野生葡萄8 个种的32 个株系及欧洲葡萄16 个品种中得到验证。进一步将该DNA 片段克隆并测序, 根据两端序列, 设计了一对长26 bp 的特异引物分别扩增供试材料, 获得了与该RAPD 标记相同大小的DNA 片段, 成功地将RAPD 标记转化为SCAR 标记, 可以用作抗白腐病基因的分子辅助选择的依据。     

Cre/loxp系统的构建及无选择标记转基因苹果植株的获得

从‘霞晖8号’桃中克隆了一个定位于第4条染色体上的钾转运体基因PpeKUP5,该基因编码625个氨基酸,具有10个跨膜结构域;PpeKUP5主要在根部表达,其次是叶和茎中,花和果实中的表达量极低;ABA、重金属Cr和Zn处理均显著诱导其在桃幼苗各组织中的表达,其中Cr处理最为显著,高钾胁迫及重金属Cu处理显著降低了其在根部的表达水平;细菌互补试验表明PpeKUP5具有吸收外界K+（KCl或K2SO4）的功能,且在偏中性pH值条件下最为显著。本研究表明PpeKUP5是一个主导桃树根部K+吸收的钾转运体,并可能在桃树适应高钾及重金属Cr、Zn和Cu等胁迫处理和ABA 响应中起着重要作用。     

番茄抗旱基因工程研究进展

番茄抗旱性是由许多微效基因座和数百个影响干旱形态和生理反应的基因控制的,阐明番茄抗旱的分子机制、开发分子标记辅助选择将有助于加速培育具有抗旱性的番茄新品种。本文概述了番茄抗旱分子机制的研究进展、番茄在干旱条件下的形态特征变化和抗旱育种,重点阐述了番茄抗旱性基因工程改良方面的研究进展,为进一步应用现代生物技术进行植物抗旱性基因工程改良和分子标记辅助选择育种提供方法和思路。     

Introduction of Xa21, a Xanthomonas-resistance gene from rice,into ‘Hamlin’ sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck] using protoplast-GFP co-transformation or single plasmid transformation

Summary

Plasmid DNA (pARS108) containing the non-destructive selectable marker Green Fluorescent Protein (GFP) gene, and a plasmid containing a cDNA of the Xa21 gene from rice (pXa21-mtaq) were co-transformed into ‘Hamlin’ orange protoplasts using polyethylene glycol (PEG). Alternatively, plasmid DNA (pAO3), containing both genes (GFP and Xa21) was directly transformed into ‘Hamlin’ orange protoplasts. Over 1,000 transgenic plantlets were regenerated from approx. 80 independent transformation events. The transgenic plants showed normal growth and stable GFP expression over more than 2 years in the greenhouse. This is the first report of a large population of transgenic ‘Hamlin’ sweet orange plants containing one or more target gene(s), using a protoplast-GFP transformation system. Polymerase chain reaction (PCR) revealed the presence of the Xa21 cDNA and the GFP genes in all single plasmid transformed plants, and in 35% of the co-transformed plants. Southern blot analysis showed the integration of the cDNA into one-to-five different sites per plant.Western blot analysis showed the accumulation of the rice XA21 protein in the transgenic sweet orange plants. This is the first time that a gene from rice has been stably integrated and expressed in sweet orange plants. Using the protoplast-GFP transformation system, it is possible to avoid the use of Agrobacterium, antibiotic resistance genes, and destructive assay systems.     

中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆及其转化辣椒的研究

本研究的目的是获得抗病毒病的辣椒材料,为选育抗病毒病辣椒品种奠定基础。根据美洲商陆抗病毒蛋白基因序列设计引物,从中国商陆（Phytolacca acinosa）叶片基因组DNA扩增克隆缺失无毒型中国商陆抗病毒蛋白基因（PacPAP1,构建该基因的植物表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化辣椒,对转基因植株进行分子检测、TMV及CMV的人工接种鉴定,接种25d后,统计发病情况。结果表明：克隆得到缺失无毒型PAP基因PacPAP,大小为714 pb,与美洲商陆抗病毒蛋白基因（PamPAP）的同源性为99.7%;得到了PacPAP1整合入辣椒基因组中的阳性植株;接种TMV、CMV阴性对照植株都明显发病,转PacPAP1基因植株未出现症状,说明转PacPAP1辣椒植株可获得抗TMV和CMV材料。     

利用KASP 分子标记技术辅助筛选多抗番茄材料

广西大部分地区春秋两季阴雨天气较多、降雨量偏高,利于晚疫病产生的致病疫霉（Phytophthora infestans）及其 孢子囊的存活及传播。利用田间抗性鉴定与KASP 分子标记技术,对16 份番茄材料进行晚疫病抗性检测,筛选聚合多抗材料。 结果表明：10 份材料田间对晚疫病表现高抗或抗病;3 份材料含晚疫病纯合体抗性基因Ph-3,2 份材料含番茄黄化曲叶病毒 病纯合体抗性基因Ty-1,4 份材料含番茄黄化曲叶病毒病纯合体抗性基因Ty-3,10 份材料含黄萎病纯合体抗性基因Ve-2, LF-15、LF-35、LF-41 等3 份材料同时含有4 种抗性基因,其中LF-35 含有的4 种抗性基因皆为纯合体。     

β–1,3葡聚糖酶基因转化提高苹果对斑点落叶病的抗性

为提高苹果抗病性,利用根癌农杆菌介导的叶片转化法,将带有NPTⅡ筛选基因、GUS标记基因及β–1,3葡聚糖酶目的基因质粒导入‘富士’和‘嘎拉’苹果。具有卡那霉素(Kan)抗性的转化株系,经GUS组织化学染色及PCR扩增检测,得到17个‘嘎拉’阳性株系和11个‘富士’阳性株系。选取‘嘎拉’和‘富士’各3个阳性株系进行Southern blot检测,结果表明外源目的基因已整合到所试转化株系中。选取‘嘎拉’及‘富士’各5个阳性株系进行半定量RT-PCR检测,除1个‘富士’株系没有条带外,其余株系均有阳性条带,且各条带的明亮清晰程度有差别,说明不同转基因株系中目的基因的表达量有差异。转化植株离体叶片接种苹果斑点落叶病菌进行抗病性表型检测结果证实,‘嘎拉’10个转化株系中8个株系表现抗病,7个‘富士’转化株系中2个株系表现一定的抗病性,抗病性的增强与目的基因的表达水平有关。