带有GFP标签的油松苯丙氨酸解氨酶基因表达载体的构建

利用基因重组技术,将油松的苯丙氨酸解氨酶基因（TaPAL）克隆到PBI121植物表达载体中,并且用报告基因GFP替换了GUS,构建了包含绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物重组表达载体PBI121-GFP-TaPAL,GFP标签比GUS基因更加易于检测,方便进行TaPAL功能鉴定方面的研究。利用电击法将重组表达载体成功的转化进农杆菌GV3301中。该研究可以为深入研究苯丙氨酸解氨酶的结构及功能及进一步通过导入次生代谢关键酶来提高植物的抗病育种提供基础。     

伪狂犬病毒PK/gG/GFP重组转移载体的构建和表达

在构建了含伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)湖北株部分PK基因和gG基因转移载体的基础上，利用平端连接的方法将绿色荧光蛋白(GFP)的基因表达盒插入到缺失的部分，并在下游引入了1个多克隆位点，构建了重组转移载体KGDF。用限制性内切酶鉴定重组转移载体KGDF。根据质粒EGFP-C1中的GFP基因序列设计1对引物鉴定GFP表达盒插入的正确性。用脂质体转染试剂盒将KGDF和PRVFIB的基因组或病毒共转染BHK-21细胞，在荧光显微镜下将出现病变的荧光斑挑出得到重组病毒。将重组病毒扩大培养后提取基因组鉴定重组病毒中的GFP基因，并通过挑取病变的荧光斑的方法纯化重组病毒。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

绿色荧光蛋白标记穿梭表达载体构建及重组乳酸菌制备

以红霉素耐药性基因/thy A基因双筛选压力大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体pW425et为基本骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)基因插入该载体,构建GFP标记的穿梭表达载体pW425et-GFP.通过连续的荧光强度检测,验证gfp基因能否在重组菌中得到稳定表达.重组表达质粒pW425et-GFP酶切和PCR鉴定结果与预期片段大小相符,SDS-PAGE显示27 kD的绿色荧光蛋白获得表达,在蓝光的激发下,可见明显的绿色荧光,且荧光稳定性强,连续传代30次仍可见荧光.结果表明已成功构建了GFP标记穿梭表达载体pW425et-GFP,为乳酸菌作为益生生理菌载体进行体内定植规律研究和食品级、疫苗级乳酸菌产品的开发奠定了基础.     

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。     

一个表达GFP蛋白的FoMV病毒表达载体（英文）

【目的】由可侵染单子叶植物和双子叶植物的病毒Foxtail mosaic virus (FoMV)构建病毒表达载体。【方法】通过在病毒3’端非编码区插入Potato virus X (PVX)病毒的启动子PVXprom和外源基因序列构建病毒表达载体。【结果】构建了重组病毒表达载体pCB301-FoMV-CP-PVXprom-GFP,该载体能在本氏烟接种叶中表达GFP绿色荧光蛋白。【结论】成功构建了重组病毒表达载体pCB301-FoMV-CP-PVXprom-GFP。     

联合双基因表达载体的构建及其拟南芥转化

[目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3)基因以及基因上游启动子的DNA序列:CP-CBF3,共2 075 bp。CP是CBF3基因的启动子,受低温诱导。用EcoRI和BamHI双酶切CP-CBF3并置于植物表达载体pCAMBIA1300中,构建CBF3基因冷诱导表达载体pCA-CP-CBF3。然后将带有组成型启动子的肌醇半乳糖苷酶基因AtG-loS3合并于pCA-CP-CBF3中,构建双基因植物表达载体pCA-CP-CBF3-35S-AtGloS3。用真空抽滤虑法将这两个表达载体转化到拟南芥中,并用潮霉素筛选出转基因植物苗。[结果]CBF3和AtGloS3基因均来自拟南芥,而CBF3不存在内含子,AtGloS3基因存在内含子,故以CB-1、CB-2为引物的非转基因植物中也能得到带,而以AT-1、AT-2为引物的非转基因植物不能得到带。[结论]该研究中pCA-CP-CBF3是1个对照,实验的后续工作需进一步进行。     

登革病毒E蛋白基因表达载体的构建

利用高效表达载体pET系统，构建广东地区登革流行株E蛋白基因的高效表达载体，表达载体经酶切及测序鉴定表明载体构建正确。为探讨E蛋白在登革病毒致病机制中的作用。以及针对本地登革病毒高效、特异的单克隆抗体和高效价的特异高免血清的制备奠定了基础。     

应用重组PCR构建猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白融合基因

膜联蛋白A2是膜联蛋白多基因家族成员之一,在Ca2+存在时能与带负电荷的磷脂结合。最近研究显示,膜联蛋白A2在病毒感染方面发挥了重要作用。本研究应用RT-PCR和PCR方法分别获得了猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)。然后用重组PCR技术成功构建了膜联蛋白A2-EGFP融合基因,为研究膜联蛋白A2在病毒感染细胞中的定位和表达,以及病毒和宿主细胞相互作用奠定了基础。     

水稻OsWRKY78与GFP融合基因的拟南芥转化及亚细胞定位

[目的]确定OsWRKY78蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中OsWRKY78全序列设计引物,进行OsWRKY78的RT-PCR扩增,克隆了OsWRKY78基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinGFP重组,并对重组载体进行菌液PCR和酶切验证,最后利用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥中,对其亚细胞定位进行研究。[结果]试验克隆得到了pBinGFP-OsWRKY78重组载体,经菌落PCR与酶切检测表明构建的表达载体正确,其转化到拟南芥中后得到了转基因植株,荧光显微镜检测结果表明,OsWRKY78基因表达产物主要定位在细胞核中。[结论]该研究结果为深入研究OsWRKY78基因的功能及其在相关信号传导中的作用奠定了基础,也为进一步研究OsWRKY78基因与褐飞虱之间的关系提供了理论依据。     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中Os-WRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了该基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinG-FP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了OsWRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBinGFP-OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建(英文)

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中OsWRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了OsWRKY17基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinGFP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了Os-WRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBin-GFP/OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

水稻OsWRKY78与GFP融合基因的拟南芥转化及亚细胞定位(英文)

[目的]确定OsWRKY78蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中OsWRKY78全序列设计引物,进行OsWRKY78的RT-PCR扩增,克隆了OsWRKY78基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP) 基因的质粒载体pBinGFP重组,并对重组载体进行菌液PCR和酶切验证,最后利用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥中,对其亚细胞定为进行研究。[结果]试验克隆得到了pBinGFP-OsWRKY78重组载体,经菌落PCR与酶切检测表明构建的表达载体正确,其转化到拟南芥中后得到了转基因植株,荧光显微镜检测结果表明,OsWRKY78基因表达产物主要定位在细胞核中。[结论]该研究结果为深入研究OsWRKY78基因的功能及其在相关信号传导中的作用奠定了基础,也为进一步研究OsWRKY78基因与褐飞虱之间的关系提供了理论依据。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因表达载体的构建

[目的]构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[方法]利用长片段PCR在抗白叶枯病水稻品种扎昌龙中扩增长10.6 kb的候选基因,将其通过Asc I单酶切克隆至植物表达载体pCAMBIA1300中,并对阳性克隆进行质粒PCR、酶切检测和测序分析。[结果]试验成功构建了水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[结论]该研究为进一步研究Xa31(t)基因的功能奠定了基础。     

RACE方法获得番茄蓝光受体基因Phototropin-2全长及其过量表达载体的构建

采用RACE及降落PCR技术从番茄幼苗总RNA中克隆出PHOT-2基因的3’及5’末端片断,并根据测序结果,设计拉基因全长引物获得了PHOT-2基因全长。结果表明,该基因全长3 381 bp,含开放阅读框2 856 bp,编码952个氨基酸;与拟南芥PHOT-2氨基酸序列相比,同源性高达68%,主要功能区域同源性高达99%。将番茄PHOT-2基因定向插入pHB质粒中构建成过量表达载体,重组质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞。     

重组毛囊特异性表达载体的构建与验证

[目的]构建毛囊特异性表达绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9（KIF Ⅱ-9）cDNA的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。[方法]根据绵羊毛角蛋白关联蛋白6-1（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成2个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到KAP6-15’调控序列,然后与毛角蛋白Ⅱ型中间丝基因（KIFII-9）cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,新生小鼠皮下注射该重组载体证明其表达有效性。[结果]PCR扩增出1042 bp的特异性片段,DNA测序结果证明,该克隆片段与KAP6-1 5’端调控区序列相比具有极高的一致性;构建的毛囊特异性表达载体PCDNA3.1-KK,皮下注射新生小鼠,皮肤内KIF Ⅱ-9得到转录。[结论]该试验构建的载体PCDNA3.1-KK具有表达特异性。