利用原核表达的外壳蛋白制备草莓轻型黄边病毒抗血清

【目的】探索以原核表达的草莓轻型黄边病毒(SMYEV)外壳蛋白(CP)为抗原制备抗血清的方法,从而建立利用ELISA检测SMYEV的技术体系。【方法】利用IPTG诱导SMYEV CP重组蛋白在大肠杆菌中表达,分离纯化重组蛋白并以其为抗原对新西兰兔进行免疫。血清效价达到要求后,分离纯化抗血清并利用DAC-ELISA对草莓植株进行SMYEV检测,同时利用RT-PCR对DAC-ELISA检测结果进行验证。【结果】宿有SMYEV CP基因的大肠杆菌经IPTG诱导后出现一条52.0 ku左右的特异性重组蛋白谱带,以纯化的重组蛋白为抗原制备出专一性较强的针对SMYEV的抗血清,该抗血清稀释800倍后仍能有效检测草莓植株中的SMYEV。利用DAC-ELISA和RT-PCR对26份草莓试材分别进行SMYEV检测,2种检测方法的检测结果基本一致。【结论】以原核表达的SMYEV CP为抗原可以制备出专一性较强、效价较高的SMYEV的抗血清。     

辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b（+）上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。     

桦褐孔菌酸性蛋白酶的基因克隆及其在菌核中的表达

根据桦褐孔菌(Inonotus obliquus)酸性蛋白酶(Acid protease,AP)基因(IO-AP)序列密码子的偏好性优化选择酶切位点和载体,成功构建pGEX-4T1-IO-AP原核表达载体;用热激法将该载体转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,构建桦褐孔菌酸性蛋白酶(IO-AP)重组菌。以此重组菌表达的IO-AP以包涵体形式存在,重组蛋白分子质量约为60kDa。以获得的较高纯度的重组IO-AP作为免疫原,采用传统3-2-2-2免疫方式免疫4只Balb/c小鼠,通过间接ELISA法测定抗血清效价,4免之后,4只小鼠抗血清效价均大于121500,成功制备了IO-AP多克隆抗体。Western Blotting检测表明,IO-AP在桦褐孔菌菌核形成过程中的表达呈现先上升后下降的趋势,以第二个时期(栽培130d,菌核长至1.33g时)AP蛋白表达量最高。     

苹果茎沟病毒吉林沙果分离物全基因组序列分析

通过RT-PCR结合RACE技术扩增到苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）吉林沙果分离物（ASGV-JLSG）全长基因组（登录号：FM616381）,共含有6 496个核苷酸（nt）,编码两个彼此重叠的开放阅读框（Open reading frame,ORF）。ORF1（37 ~ 6 354 nt）编码1个241 kD的多聚蛋白,含有甲基转移酶（Methyltransferase）、木瓜蛋白酶（Papain-like-protease）、解旋酶（Nucleotide triphosphate-binding helicase）、RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）和C端的外壳蛋白（Coat protein,CP）等结构域。ORF2（4 788 ~ 5 750 nt）编码1个36 kD的运动蛋白（Movement protein,MP）。ASGV-JLSG分离物与GenBank公布的29个ASGV分离物全基因核苷酸序列一致性为79.20% ~ 86.60%。系统发育分析结果表明,30个ASGV分离物分成2个组,分离物间没有表现出寄主专一性和地理分布规律。重组分析发现,ASGV-JLSG分离物是苹果茎沟病毒黄花梨分离物（ASGV-HH,JN701424）和柑橘碎叶病毒满头红分离物（CTLV-MTHK,C588948）的重组体。本研究中获得的ASGV-JLSG分离物基因组是来源于中国东北地区的首个ASGV基因组序列。     

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白的抗血清制备及其检测应用

 以受番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV）侵染的番木瓜（Carica papaya）叶片为供试材料,采用RT-PCR 方法克隆其外壳蛋白基因cp,并将其连接到原核表达载体pET-28b（+）上,酶切鉴定及克隆测序确定开放阅读框的正确性,将获得的重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌。通过摸索转化的表达宿主菌种类、IPTG 浓度及诱导时间,获得高效表达PRSV cp 的条件。SDS-PAGE 分析结果表明,CP 融合蛋白分子量为36.8 kD。以Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化的融合蛋白为抗原,免疫注射新西兰大白兔制备得到高效价抗体,间接ELISA 测定效价为1︰16 384。Western blot 检测结果表明,制备的抗血清可与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。通过ID-ELISA 检测田间样品证实了制备的抗血清与PRSV 侵染病叶发生了良好的特异性反应。本试验为PRSV 的快速检测以及PRSV 编码蛋白的功能研究奠定了基础。     

落葵皱缩花叶病毒CP基因的原核表达及多克隆抗血清的制备

以感病紫茉莉叶片为材料,采用RT-PCR方法克隆落葵皱缩花叶病毒(Basella rugose mosaic virus,Ba RMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,并构建p ET30a-Ba RMV-cp原核表达载体。将原核表达载体转化大肠杆菌[Rosetta(DE3)Plys S],成功诱导表达得到大小约为40.0 k D的与预期大小相符的融合蛋白(His-CP)。SDS-PAGE电泳完毕后用0.25 mol·L~(-1)的KCl溶液染色,将目的蛋白切胶纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗血清。间接酶联免疫吸附法(ID-ELISA)检测该抗体的效价为1︰16 000,Western-blotting分析表明该抗体具有很强的特异性。对野外感病紫茉莉和实验室内接种发病本氏烟检测结果也表明,所制备的抗体具有良好的特异性,可用于大规模样品检测。     

四川省猕猴桃病毒A外壳蛋白基因的序列分析、原核表达及抗血清制备

【目的】研究猕猴桃病毒A(Actinidia virus A,AcVA)的发生及其多样性,为我国猕猴桃产业中AcVA病毒的快速检测、科学防控以及猕猴桃品种选育提供科学依据。【方法】通过巢式PCR从四川省猕猴桃感病叶片中扩增AcVA CP基因序列,进行序列分析和同源性比对;构建AcVA CP基因的原核表达载体,诱导目的蛋白表达后制备抗血清,用Western blot检测效价。【结果】克隆到3个AcVA四川分离株的完整CP基因序列,成功构建了pET28a-AcVA-DJY4-CP重组质粒,原核表达目的蛋白并制备出特异性抗血清,效价达到1∶5 000。【结论】首次获得了3个AcVA四川分离株,丰富了AcVA的序列多样性,并探索了原核表达的最佳条件,制备了高效价抗血清,为今后AcVA病毒的快速检测和防控提供了技术支撑。     

葡萄病毒B外壳蛋白原核表达及抗血清制备

根据已报道的葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法从葡萄中扩增获得GVB外壳蛋白基因(cp),大小为594 bp。通过序列测定和分析,选取优势分离物GVB-JFL cp基因克隆到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化融合蛋白pET-GVB CP。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白获得过量表达,分子量约26 kD。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗血清。采用间接ELISA和dot-ELISA对抗血清特异性进行检测,结果表明,抗血清可与感染GVB的西方烟和葡萄样品发生阳性反应,与健康植株及感染同属另一种病毒葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)的样品不反应,阳性样品检测效价达1︰4 000,16个田间样品摩擦接种至烟草后有9个样品ELISA检测为阳性,表明制备的抗血清可用于GVB的特异性检测。     

山东寿光地区番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用双生病毒简并引物PA/PB,对山东寿光地区保护地疑似感染番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的番茄植株进行PCR检测,结果证明番茄病叶由TYLCV侵染所致。以提取的病叶总DNA为模板,扩增得到长约770 bp的TYLCV-CP基因片段,克隆至pEASY-T1 Simple载体,然后用Xho I和EcoR I将其切下并插入到pET-32a表达载体中,构建了寿光地区TYLCV分离物的外壳蛋白基因原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导获得了50 kD重组蛋白,Ni2+-NTA亲和层析纯化和Western印迹分析证明目的蛋白为TYLCV外壳蛋白,且具有良好的抗原活性。     

香蕉果实转录因子MaWRKY1基因的原核表达和多克隆抗体制备

MaWRKY1是从香蕉果实中克隆出的一个转录因子基因。为进一步研究该基因的功能,制备了MaWRKY1多克隆抗体。选取MaWRKY1基因全长中N端第168 ~ 400个氨基酸之间的包括两个WRKYGQK保守域的cDNA序列,构建了原核表达载体pET-MaWRKY1,并转化到大肠杆菌BL21中诱导表达菌体蛋白。SDS-PAGE电泳检测结果表明,His-MaWRKY1融合蛋白成功获得了高效表达,分子量在26 kD左右。His-MaWRKY1融合蛋白经过Ni-NTA琼脂糖凝胶树脂纯化,SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到的纯化蛋白浓度达到0.5 mg • mL-1。经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清,采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化。将纯化后的抗体通过间接酶联免疫（ELISA）和蛋白质印迹（Western blot）分析,表明所制备的抗体具有很好的效价,效价比为1︰160 000,同时具有良好的灵敏度和特异性。进一步提取香蕉不同组织总蛋白,Western blot检测显示,在分子量26 kD左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗体可以与香蕉WRKY蛋白特异性结合,并且低温可以诱导香蕉果实中MaWRKY1蛋白表达,暗示MaWRKY1蛋白表达可能与果实耐冷性有一定的关系。     

苹果褪绿叶斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

【目的】为了制备苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的抗血清,【方法】将ACLSV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV和pEHISEGFPTEV,转化大肠杆菌Rosetta,切胶回收诱导表达的CP融合蛋白免疫新西兰长耳兔,制备ACLSV的抗血清。【结果】利用原核表达载体pEHISTEV和pE-HISEGFPTEV在Rosetta中分别表达出了分子质量为25 ku和55 ku的ACLSV CP融合蛋白。切胶回收25 ku的融合蛋白免疫新西兰长耳兔。经ELISA测定,所制备的抗血清效价为1∶1 024,Western blot及组织印迹分析表明抗血清能与ACLSV CP发生特异性的免疫反应。【结论】该血清特异性强,效价高,可用于苹果叶片、果实和枝条等样品中A-CLSV的检测。     

柑橘黄龙病菌分泌蛋白05150的筛选、原核表达及抗血清制备

【目的】柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘产业的头号杀手,其病原主要是韧皮部杆菌属亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas),为革兰氏阴性菌,田间主要经亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)传播,为深入研究该病菌分泌蛋白的功能,笔者筛选其中1个分泌蛋白,进行原核表达并制备抗体。【方法】设定4点条件从Prasad等预测的166个分泌蛋白基因中筛选,与pET-28a构建重组表达载体,以原核表达的融合蛋白作为抗原,用于注射兔子,制备多克隆抗体。【结果】从预测的166个分泌蛋白基因中筛选出05150基因,成功构建表达载体pET-28a-05150,表达菌株pET-28a-05150在18℃、0.1 mmol·L~(-1) IPTG浓度条件下诱导的目的蛋白为包涵体。获得的pET-28a-05150抗血清通过ELISA效价为1∶4 000,通过dot ELISA检测手段可与田间感病样品发生显色反应,通过Western blot能与融合蛋白杂交出特异性条带。【结论】该研究筛选了CLas的分泌蛋白基因05150,以其体外表达蛋白制备了pET-28a-05150抗血清,为研究05150基因功能奠定前期基础,也为建立HLB的血清学检测手段及探究柑橘黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选方法提供参考。     

瓜类褪绿黄化病毒p22 基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 以被瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV）侵染的甜瓜叶片为供试材 料,采用RT-PCR 方法克隆其P22 蛋白基因,并将其连接到原核表达载体pGex-4T-3 上,PCR 验证及克隆 测序确定开放阅读框的正确性。将重组载体pGexp22 转化大肠杆菌BL21 菌株,诱导表达,SDS-PAGE 分 析表明,经IPTG 诱导,p22 基因在大肠杆菌BL21 中得到了高效表达。以表达的蛋白作为抗原,免疫家 兔,制备了CCYV P22 的特异性抗血清。ACP-ELISA 检测结果表明,血清效价高达1.28 × 10⁵。Western blot 检测甜瓜叶片,结果表明抗血清能够特异性地检测CCYV 侵染的甜瓜叶片中的CCYV P22 蛋白。     

百合无症病毒16kD基因的克隆、原核表达及抗血清制备

以感染百合无症病毒(LSV)的百合叶片为试材,克隆LSV16 k D基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)上。将获得的重组质粒p ET-28a(+)+16 k D转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到了高效表达的16 k D蛋白,融合蛋白分子量约为20 k D。融合蛋白经过镍柱纯化后作为抗原免疫注射小鼠,制备得到16 k D蛋白抗血清。Western blot分析显示所制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应;通过ELISA检测和RT-PCR检测百合样品,证实制备的抗血清与LSV侵染的百合叶片发生了相同的特异性反应。结果表明,目的蛋白表达成功,所制备的抗血清具有特异性,可用于LSV的快速检测、免疫组织化学以及16 k D蛋白功能研究。     

云南苹果产区苹果茎沟病毒(ASGV)的发现及其分子变异

【目的】为了查明云南省苹果产区的苹果茎沟病毒病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的侵染情况和不同来源分离物间的分子变异情况,【方法】以云南昭通、丽江、昆明、曲靖等地采集的325份苹果病毒样品为试材,采用RT-PCR技术对其是否携带ASGV进行检测,运用DNAMAN6.0、MEGA5.0对实验获得的6个分离物和GenBank上已登录的34个分离物进行序列比对分析。【结果】ASGV在云南各大苹果产区的发病率高达48%。序列比对结果显示,这些分离物的核苷酸序列相似性为87.3%～93.8%,氨基酸序列相似性为90.7%～98.7%。系统发育树显示,云南的6个分离物聚为一簇,而陕西省苹果分离物YL06与云南省分离物ZT1、TJX1亲缘关系比较近,聚为一支;ASGV苹果分离物要明显区别于ASGV梨分离物和CTLV柑橘分离物。【结论】云南省苹果产区苹果树的ASGV带毒率高达48%,推测可能是一种发生率比较普遍的病毒病,这是云南省发现的首次报道。系统发育树显示:本研究获得的6个苹果分离物明显区别于其他寄主分离物,并且与其他地区的分离物具有一定差异,推测在我国,ASGV的分子变异与寄主/地域来源存在着一定的相关性。     

柑橘溃疡病致病基因PthA核定位信号肽抗血清制备及其抑菌的研究

 用PCR法扩增位于柑橘溃疡病菌致病基因pthA C-末端的3个核定位信号序列,并将其克隆到原核表达载体PET32a(+)上,经双酶切及核酸序列测定重组质粒(PthA-NLS),其序列与GenBank中pthA的相关序列有99.9%的同一性。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导了重组多肽的表达,并用Ni2+-NTA纯化柱得到了48kD的纯化重组多肽。把重组多肽注入免疫Balb/c小白鼠,制备了相应的抗血清,Western Blotting和ELISA分析结果表明,抗血清可特异地结合重组多肽,亦可识别溃疡病菌PthA天然蛋白,获得的抗血清可以用于柑橘溃疡病的检测。利用抗血清与溃疡病菌混合接种离体冰糖橙叶片,发现抗血清能推迟溃疡病菌的致病过程,且病斑比对照小,但未能达到抗病的程度。pthA基因末端核定位信号序列的克隆、原核表达及抗血清的制备为进一步研究pthA的致病机理和研发溃疡病快速分子检测技术奠定了基础。     

柑橘体细胞胚发生基因CsHB1特异肽段多克隆抗体的制备及其蛋白动态检测

【目的】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达系统,制备多克隆抗体,并检测抗体在‘伏令夏橙’胚性愈伤体胚诱导阶段中的特异性,为研究CsHB1基因在柑橘体细胞胚发生过程中的功能奠定基础。【方法】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N,转化大肠杆菌诱导目的融合蛋白的表达,并制备获得多克隆抗体anti-CsHB1-N。通过Western blot检测抗体在原核表达系统和柑橘体细胞胚诱导阶段的特异性,并分析体细胞胚诱导阶段CsHB1蛋白水平表达的动态变化。【结果】重组原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N在Escherichia coli中高效表达出了分子质量约为49 ku的GST-CsHB1-N融合蛋白,并纯化获得多克隆抗体anti-CsHB1-N;经过Western blot分析表明,多克隆抗体可与‘伏令夏橙’愈伤体胚诱导阶段表达的目的蛋白特异结合;蛋白表达结果分析表明,在胚性愈伤组织中CsHB1蛋白呈现高的表达量,随着诱导培养的进行,呈现了先下降后上升的波动变化。【结论】多克隆抗体特异性好,可与‘伏令夏橙’胚性愈伤组织中目的蛋白特异性结合,可用于CsHB1基因功能分析。     

萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs在大肠杆菌中的表达及其转化番茄的研究

 通过基因工程手段将萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFP_{1( 2)} 插入大肠杆菌表达载体pTrxFus中并诱导表达, 其融合表达产物约22 kD, 约占总可溶蛋白的0. 45% ( 0. 5%) 。抑菌活性试验表明: 重组Rs-AFP_{1( 2)}有抑菌活性, 其中Rs􀀁AFP2 较Rs􀀁AFP1 抑菌活性强。构建了Rs-AFP₂ 基因的植物表达载体pBIAFP₂。利用农杆菌介导法将pBIAFP₂ 导入番茄中, 并诱导出完整的植株32 株。对其中28 株进行PCR 和PCR-Southern Blot 检测, 其中17 株呈阳性。对经PCR Southern Blot 检测呈阳性的植株进行Southern Blot 检测, 6 株呈阳性。     

柑橘体细胞胚发生基因CsHB1特异肽段多克隆抗体的制备及其蛋白动态检测北大核心CSCD

【目的】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达系统,制备多克隆抗体,并检测抗体在‘伏令夏橙’胚性愈伤体胚诱导阶段中的特异性,为研究CsHB1基因在柑橘体细胞胚发生过程中的功能奠定基础。【方法】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N,转化大肠杆菌诱导目的融合蛋白的表达,并制备获得多克隆抗体anti-CsHB1-N。通过Western blot检测抗体在原核表达系统和柑橘体细胞胚诱导阶段的特异性,并分析体细胞胚诱导阶段CsHB1蛋白水平表达的动态变化。【结果】重组原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N在Escherichia coli中高效表达出了分子质量约为49 ku的GST-CsHB1-N融合蛋白,并纯化获得多克隆抗体anti-CsHB1-N;经过Western blot分析表明,多克隆抗体可与‘伏令夏橙’愈伤体胚诱导阶段表达的目的蛋白特异结合;蛋白表达结果分析表明,在胚性愈伤组织中CsHB1蛋白呈现高的表达量,随着诱导培养的进行,呈现了先下降后上升的波动变化。【结论】多克隆抗体特异性好,可与‘伏令夏橙’胚性愈伤组织中目的蛋白特异性结合,可用于CsHB1基因功能分析。     

筇竹CBF1基因的原核表达和多克隆抗体的制备

以筇竹（Qiongzhuea tumidinoda Hsueh et Yi）叶片为试材,采用RT-PCR方法克隆其CBF1基因,并将CBF1连接到原核表达载体pET32a（+）上,经克隆测序确定所构建的重组载体pET32-QZ开放阅读框正确。将重组载体pET32-QZ转化大肠杆菌Rosetta2（DE3）菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明CBF1蛋白得到了高效表达,所表达蛋白是大小约为45 kD的融合蛋白。经镍柱纯化后作为抗原免疫家兔,制备CBF1蛋白特异性抗血清。所制备的多克隆抗体能够与融合蛋白和经冷诱导的筇竹叶片总蛋白在25 kD处出现杂交条带。上述结果表明,表达的目的蛋白可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测。