转Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(nhaA)大豆植株的获得及耐盐性分析

高盐对作物造成渗透胁迫和离子毒害,是影响作物生长发育的主要非生物胁迫因子之一。Na+/H+逆向转运蛋白能够通过将Na+排出细胞或将其区隔化入液泡中来调节细胞内的离子平衡,是植物耐盐的关键因子。本研究将质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因nhaA构建到植物表达载体pBI121上,通过发根农杆菌介导转化大豆子叶节,获得6株卡那霉素抗性再生植株。对抗性植株进行PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定,3株植株呈阳性,平均转化率为0.42%。对阳性植株的耐盐生理指标测定结果显示,盐胁迫后转基因植株的质膜相对电导率显著低于对照植株,叶绿素含量和脯氨酸含量显著高于对照植株。nhaA基因在大豆植株中的表达显著提高了大豆对盐胁迫的耐受性,为大豆耐盐新品种的选育和广泛应用该基因进行其它农作物的耐盐性改良提供了材料和依据。     

毛偃麦草Na~+/H~+逆向转运蛋白的分子克隆及生物信息学分析

根据小麦和长穗偃麦草的液泡膜Na+/H+逆转运蛋白基因(TaNHX1、TeNHX1)全长序列设计引物,通过RT.PCR直接扩增的方法从毛偃麦草(Elytrigia trichophora L.)中克隆到了Na+/H+逆转运蛋白基因,命名为EtNHX1 (Accession numeber:EU876834).EtNHX1最大开放阅读框为1 641 bp,编码含有546个氨基酸残基、分子量为59.8 kD的蛋白,预测等电点8.0.EtNHX1含有39个碱性氨基酸,37个酸性氨基酸,256个疏水氨基酸及128个极性氨基酸.二级结构预测表明该蛋白含约47%的α-螺旋、20%的延伸链、4.5%的β-转角和28%的不规则卷曲.亲疏水性分析显示,EtNHXl含有12个连续的疏水片断,其中10个可能构成跨膜螺旋.序列分析显示,EtNHX1与小麦(Triticum aestivum L.)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium L.)、长穗偃麦草(Elytrigia elongate L.)、水稻(Oryza sativa L.)、角果碱蓬(Suaeaa corniculata L.)、小盐芥(Thellungiella halophila L.)等植物的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白高度同源,序列相似性分别为98%、98%、96%、85%、68%和67%.序比对结果以及进化树分析均表明EtNHX1应为定位于毛偃麦草液胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白.     

筇竹Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆与表达分析

为明确液泡型Na~+/H~+逆向转运蛋白在竹类植物耐盐中发挥的重要作用。本研究从筇竹中克隆出液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为QtNHX1 (基因登录号:MT078987),并分析该基因表达特征。结果表明,QtNHX1基因全长为2 075 bp,包含1 632 bp的开放阅读框(编码544个氨基酸),其相对分子量为59.43 kD,理论等电点(pI)为8.83。QtNHX1具有10个跨膜区域,且与水稻同源性最高,达到90.59%。另外,QtNHX1基因在在筇竹不同组织器官(竹笋,根,茎,叶)均有表达,说明QtNHX1为组成型表达。筇竹根中QtNHX1基因的表达量最高,在竹笋表达量最低。对筇竹进行不同时间(6, 12, 24 h)的NaCl胁迫处理,发现QtNHX1基因的表达量随着处理时间的延长而上升,表明QtNHX1基因在调控筇竹耐盐性中发挥着重要作用。     

甜菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白BvNHX基因RNAi载体构建及遗传转化

液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白介导的Na+区域化在植物适应盐胁迫中起着重要作用。本研究以甜菜(Beta vulgaris L.)叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因BvNHX的靶片段,以中间载体pHANNIBAL和表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法,构建CaMV 35S启动子驱动的含BvNHX基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体pARB,通过冻融法将其导入根癌农杆菌GV3101,并转入甜菜幼苗获得BvNHX-RNAi转化株系。半定量RT-PCR分析结果表明该干扰载体能特异性地导致转化植株BvNHX基因表达的沉默。这将为解析BvNHX在甜菜体内Na+区域化中的功能及其在甜菜适应盐渍生境中的作用机制提供帮助。     

苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

为深入研究液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用,以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料,利用同源克隆方法得到NHX基因,命名为FtNHX1,并在Gen Bank中注册,登录号为KY438929;序列分析表明,该基因开放阅读框1 662 bp,共编码553个氨基酸,预测蛋白分子量61.24 kDa,等电点5.15。系统进化树分析表明,FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近,氨基酸同源率分别为60.22%,58.95%和57.30%;荧光定量PCR分析表明,随着Na Cl胁迫浓度的增加,FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的相对表达量极显著增加,150 mmol/L NaCl胁迫下增加幅度最大,分别比对照增加了254.10%,311.35%和256.18%;Na Cl胁迫下FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%,145.67%和155.94%,茎基部和叶片的平均表达量较高,说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节,FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。     

蓖麻RcNHX2基因克隆与生物信息学分析

液泡膜型钠氢逆向转运蛋白(Tonoplast Na~+/H~+antiporters,NHX)在植物耐盐方面具有重要意义。本研究利用RACE方法克隆了蓖麻Rc NHX2基因的3'端和5'端片段。最后设计全长引物获得蓖麻Rc NHX2全长序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,蓖麻液泡膜型钠氢逆向转运蛋白基因的c DNA完整的开放阅读框序列为1 626 bp,推测其可编码541个氨基酸;含有典型的液泡膜型钠氢逆向转运蛋白典型的Na~+/H~+交换泵(~(50)NES~(52))和氨氯吡嗪咪的结合位点(~(84)LFFIYLLPPI~(93));存在12个跨膜结构域,属于跨膜蛋白;预测其定位于细胞质膜和液泡膜及内质网膜。     

蓖麻质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因(RcSOS1)克隆及表达载体构建

根据其他物种中保守的SOS1基因序列,设计简并引物,利用RT-PCR和RACE的方法克隆得到RcSOS1(NCBI注册号:KX943304.1)基因序列,开放阅读框包含3 432个核苷酸,推导编码的蛋白质有1 143个氨基酸残基组成,与麻疯树SOS1基因的同源性最高,达到了80.4%,编码一种Na~+/H~+逆向转运蛋白。疏水性分析显示RcSOS1基因编码蛋白N-末端具有12个跨膜结构域,C-末端具有一个很长且面向质膜内腔的亲水尾部。RcSOS1蛋白二级结构以α-螺旋,无规则卷曲为主,其次为延伸链和β-转角,所占比例最少。三级结构分析表明,RcSOS1蛋白是位于质膜上的Na~+/H~+逆向转运蛋白。根据RcSOS1全长序列设计带有Bam HⅠ和SalⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用Bam HⅠ和SalⅠ双酶切后与表达载体p CG-1301连接,成功构建了RcSOS1基因的正义表达载体,为深入研究RcSOS1基因的功能及耐盐的调控作用提供了帮助。     

烟草NtNHX1-1基因特征分析

烟草是中国重要的经济作物之一。盐胁迫对烟草生产造成巨大危害,克隆盐胁迫响应基因,为从分子水平抵御盐胁迫提供基因资源。本研究克隆了Na+/H+反向转运蛋白基因。该基因编码的蛋白为膜蛋白,具有12个跨膜区。进化分析表明,Nt NHX1-1与番茄的Sl-NHX1遗传距离最近,相似性为95%,其次为甜辣椒的Ca-NHX2,相似性为94%。组织特性表达分析表明,NtNHX1-1基因在茎中表达最高、其次为叶、花和根。NaCl处理后NtNHX1-1基因的表达明显上调,表明该基因可能在烟草抵抗盐胁迫中发挥重要功能。通过调控NtNHX1-1基因的表达有望获得耐盐胁迫烟草新品系。     

刺槐Na+/H+逆向转运蛋白RpNHX1基因的分离和生物信息学分析

盐分胁迫严重影响植物生长和产量.为了研究木本植物对盐分的适应性,利用5'RACE技术,从刺槐中克隆得到液泡Na /H 逆向转运蛋白基因RpNHX1.该基因长度为2 281 bp,含有一个开放阅读框,编码535氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白序列与大豆GmNHX1和拟南芥AtNHX1相似,氨基酸的同源性分别达85%和69%,RpNHX1属于NHX亚族的NHX-I分枝.用生物信息学的方法预测RpNHX1具有所有Na /H 逆向转运蛋白共同的结构特点,即含有疏水的N末端,10个跨膜螺旋区域和一个具有调节功能的C端亲水区域,其中氨氯吡嗪咪敏感基序和CaM结合域也是保守的.在4和5的螺旋区域之间,存在有一串带负电荷氨基酸,显示出有规律的排列模式,这些模式在生物界中的Na /H 转运蛋白中是保守的.结合亲疏水资料,我们认为Na /H 转运通道结构可能存在于这一区域.另外,也分析了RpNHX1可能的糖基化、酰基化和磷酸化位点.从这些数据中可以看出,RpNHX1可能在细胞中起到Na 区隔化作用.     

水稻OsABCC10基因的克隆及其功能分析

ABCC蛋白为ABC转运蛋白超家族中的一个亚家族,主要参与将各种分子从细胞质输出到外部介质或细胞器基质的过程。为了研究OsABCC10基因是否参与水稻Na+的运输,本研究从水稻基因组中克隆出OsABCC10基因,该基因cDNA全长4539 bp,编码1513个氨基酸。OsABCC10基因表达分析发现,其主要在水稻根中表达,表达量随盐处理浓度的升高及处理时间的延长而增强,表明OsABCC10基因的表达受盐胁迫的调控。亚细胞定位分析证实OsABCC10定位于液泡膜上。盐胁迫条件下,与野生型相比,osabcc10突变体表现出对盐更敏感,而且木质部汁液中Na+浓度升高。然而,当OsABCC10基因导入野生型酵母菌株BY4741表达时,与对照组实验相比,有OsABCC10表达的酵母细胞的生长受到了抑制。该结果与植物生理实验结果相反,这可能与OsABCC10蛋白在酵母中的定位有关。本研究初步推测OsABCC10基因参与水稻Na^+的转运,是一个新的耐盐基因。     

水稻(Oryza sativa)新型液泡Na+/H+逆向转运蛋白基因的特征分析和表达

以拟南芥AtNHX1 cDNA 片段作为探针,筛查水稻盐胁迫植株叶片cDNA 文库,获得与AtNHX1同源的水稻新型液泡Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（OsANT1）。序列分析表明,OsANT1 全长cDNA为2 178 bp,包括一个长度为1 608 bp的完整开放阅读框,编码535个氨基酸残基。在DNA水平上,OsANT1基因含有15个外显子和14个内含子,长度为4 835 bp。OsANT1含有12个跨膜域,系统进化树分析结果表明,与来自拟南芥、水稻、小麦、玉米、大麦、马蔺和芦苇等的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白高度同源。盐胁迫条件下,OsANT1的表达具有盐分诱导特征,且随着胁迫的增大而增加。表明该基因可能在水稻抵御盐分胁迫的过程中具有一定作用。     

玉米阳离子/质子逆向转运蛋白ZmNHX7的功能鉴定

植物阳离子/质子逆向转运蛋白可以维持细胞内的离子平衡,在抵御离子毒害过程中发挥重要作用。本研究克隆了一个编码玉米阳离子/质子逆向转运蛋白的基因,命名为ZmNHX7。该基因编码序列(codingsequence,CDS)全长3411 bp,编码一条含1136个氨基酸的多肽链。ZmNHX7基因在玉米各组织部位均有表达,在V7 (第7片叶完全展开)时期的根和茎中表达量较高。在NaCl与LiCl的胁迫条件下,该基因表达量上调。系统进化树分析将ZmNHX7与拟南芥质膜阳离子/质子逆向转运蛋白AtNHX7和AtNHX8归为一类,亚细胞定位结果表明该蛋白定位于细胞膜和核膜上。将ZmNHX7基因转入拟南芥T-DNA插入突变体中,转基因互补株系可以恢复该突变体对Li+的耐受性。这些结果表明, ZmNHX7编码一个玉米质膜阳离子/质子逆向转运蛋白,在缓解Li+对植物的毒害和维持细胞内的离子平衡等方面发挥重要作用。     

紫花苜蓿Na+/H+ 逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料, 利用反转录PCR方法分离了NHX1全长cDNA(命名为MsNHX1)。Southern杂交结果表明, 在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明, 该基因所编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达MsNHX1-GFP融合基因的结果表明, MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度NaCl诱导。MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性, 说明MsNHX1具有转运Na⁺的功能。在拟南芥中表达MsNHX1能显著提高植株耐受盐胁迫的能力; 而且在受到盐胁迫时, 转基因植株比野生型的渗透调节能力更强, 生物膜受破坏程度降低, 光合能力增强。以上研究结果表明MsNHX1是一个液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白, 在植物耐受盐胁迫过程中起重要作用。     

编码荔枝乙烯受体(LcERS1)的cDNA基因的克隆与分析

利用RT -PCR和RACE方法获得了编码荔枝乙烯受体的cDNA序列 ,长度为 2 ,193bp ,该序列中包含一个ORF全长 1,84 8bp ,编码 6 15个氨基酸 ,推测的分子量为 6 8kD。由该序列推定的蛋白质氨基末端存在疏水区 ,羧基端存在组氨酸激酶区和GAF区。与拟南芥的五个乙烯受体比较 ,推定的荔枝乙烯受体的激酶区有乙烯受体所具有的 5个基序 (H ,N ,G1,F ,G2 )中的H和N基序 (motif) ,分别位于第4 2 3- 4 32和 5 32 - 5 4 3氨基酸 ,其保守序列H为 :MNHEMRTPM ;N为 :LMQTILNIMGNA。结构分析和功能预测表明 ,本研究获得的荔枝乙烯受体编码序列推定的氨基酸序列具有乙烯受体的典型特征 ,初步分析表明获得的荔枝cDNA序列包含了编码荔枝乙烯受体 ,LcERS1,的全长cDNA基因 (lcers1) ,GenBank登录号为AY311484。     

大肠杆菌Top10甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的甘露醇-1-磷酸脱氢酶（mannitol-1-phosphate dehydrogenase,mtlD）的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌（Escherichia coli）Top10中克隆到了mt／D基因（Acession numeber：EU433565）。mtlD开放阅读框为1149bp,编码含有382个氨基酸残基,分子量为41．2kD的蛋白,预测等电点为5．37。mtlD含有38个碱性氨基酸,50个酸性氨基酸,158个疏水氨基酸及72个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约60．47％的α-螺旋、4．71％的β-转角、10．73％的延伸链和20．48％的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,mtlD是亲水性蛋白。亚细胞定位分析表明mtlD主要定位于细胞质中。序列分析表明大肠杆菌Top10 mtlD基因与大肠杆菌W3350、大肠杆菌DEC12a和盐生盐杆菌（Halobacterium salinarum）的mtlD基因同源性分别为99％、97％和93％。大肠杆菌Top10mtlD基因的克隆及生物信息学分析为今后对mtlD的进一步深入研究奠定了基础。     

马铃薯SoFtsH基因全长cDNA克隆与在干旱条件下表达研究

FtsH (Filamentation Temperature-Sensitive H)是一种ATP和Zn²⁺依赖型金属蛋白酶,广泛存在于原核生物和真核生物中,在真核生物中是多基因家族。FtsH具有ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侣活性,参与多种胁迫反应。从抗旱马铃薯（Solanum tuberosum）二倍体品系H145中分离得到cDNA-AFLP差异片段,利用RACE技术克隆了SoFtsH cDNA全长序列, 并对其进行分析。结果表明, 该序列包含完整的开放阅读框,长为723 bp, 编码129个氨基酸。SoFtsH具有2个铁氧化还原蛋白结合位点,并存在信号肽序列、跨膜区域和Zn²⁺结合域。SoFtsH基因序列与GenBank数据库中的其他FtsH基因进行同源序列比对, 并构建系统进化树, 发现该基因与番茄、烟草、拟南芥等高等植物FtsH基因同源性达90%以上。半定量RT-PCR和Northern Blot杂交结果表明SoFtsH基因在干旱胁迫下叶片和根系里的表达量明显增加, 且在抗旱品系H145与干旱敏感品系H214中表达模式不同。说明SoFtsH基因在马铃薯抗旱中起作用。