小麦基因组DNA的分离及RAPD反应体系的研究

对普通小麦不同部位提取基因组DNA的方法进行分析比较,发现用黄化苗基因组DNA叶片提取的基因组DNA的质量和浓度均较好,可用于RAPD分析.并对小麦基因组DNA的RAPD反应优化过程中一些重要参数进行了探索、优化试验,建立了随机扩增多态性DNA分析应用反应体系.     

小麦基因组AFLP反应体系的建立

利用小麦抗叶锈近等基因系研究了小麦基因组AFLP反应体系,建立了适于小麦基因组的AFLP反应体系:40μL酶切体系中采用7.5UPstⅠ和5UMseⅠ37℃3h,65℃3h双酶切0.1～0.2μgDNA,然后加入10μL接头、T4连接酶混合液,16℃连接过夜;吸取未稀释的酶切连接液4μL,加入75ng预扩增引物,10mmol/LdNTP,1.5UTaq酶,1×buffer,加PCR水至40μL进行预扩,将预扩产物稀释20倍,吸取5μL,加入40ng选择性引物,1.25UTaq酶,7.5mmol/LdNTP,2%去离子甲酰胺,1×buffer,加PCR水至25μL进行选择性扩增。本研究为小麦抗叶锈基因的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供有力的工具。     

小麦基因组SRAP扩增体系的初步研究

对影响SRAP扩增结果的各种因素包括DNA、引物、dNTPMixture、TaqDNA聚合酶的浓度及变性、复性、延伸的时间及温度进行了摸索。获得了能够稳定扩增小麦基因组的体系:20μL体系中DNA25ng,dNTP188mmol/L,TaqDNA聚合酶0 75U,引物25ng。扩增程序为:94℃1min,37℃1min,72℃10sec,5个循环;94℃1min,50℃1min,72℃10sec,35个循环;72℃1min。     

小麦基因组DNA快速提取及SSR标记PAGE的银染检测

为了提高SSR-PCR速率,降低试验成本,以8份抗条锈小麦幼苗为材料,比较分析了两种DNA提取方法(CTAB法和SDS法)以及两种SSR标记PAGE银染法(Sanguinetti银染法和Bassam银染法).结果表明:用CTAB法和SDS法均可获得质量较好的DNA,但CTAB法花费的时间较长,提取效率低(在相同条件下SDS法提取速度约为CTAB法的2倍);Sanguinetti银染法染色背景较浅、条带清晰、分辨率高、具有较高的多态性检出率,并且在速度上优于Bassam法,仅需30多min,而Bassam银染法染色步骤烦琐,对试剂质量和水质要求均较高,且未能染色成功.     

冷暖型小麦基因差异的最佳RAPD反应体系研究

为了建立小麦RAPD反应的最佳体系,保证反应结果的稳定性和可靠性,寻找小麦冷暖型基因差异,降低试验成本,在相同PCR扩增程序(94℃预变性5 min,94℃变性45 s,38℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,40个循环,72℃延伸10 min,4℃保存)下,对冷暖型小麦基因组DNA的RAPD扩增体系各参数进行比较筛选,创建其最佳反应体系为:25μl反应体系中,模板DNA 20 ng,10×PCR缓冲液2.5μl,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1 U,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,ddH2O 12μl,随机引物10 ng。     

抗旱型小麦基因组DNA的提取及RAPD反应体系优化

采用CTAB法和SDS法提取抗旱性小麦基因组DNA.结果表明:CTAB法提取的DNA纯度高,RNA和蛋白质含量低,可用于RAPD反应.同时对影响RAPD反应的5个重要因素进行了筛选,确定了RAPD最优反应体系:25μL反应体系为2.5 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTP,10 pmol引物,25 ng模板,0.75 UTaq酶.     

树莓SSR反应体系的优化及应用

本研究主要对树莓SSR-PCR体系进行优化,以‘来味里（Reveille）’红树莓为试材,利用L9（34）正交试验设计和两因素完全随机试验,研究各主要参数的适宜浓度,建立适合树莓SSR反应的最佳体系,并通过16个不同的树莓栽培品种对优化后的体系进行验证。结果表明：各影响因素中,引物浓度的变化对扩增结果的影响最大,优化后的最佳反应体系（25μL）中,Taq DNA聚合酶和DNA最适用量分别为1.0U和30ng;Mg2＋、dNTP和引物最适浓度分别为1.5、0.2mmol/L和0.4μmol/L。利用优化后的反应体系和10对SSR引物对16个树莓品种进行PCR扩增,不同品种间扩增结果稳定,多态性位点丰富,共有54个等位位点,表明该体系稳定可靠,适合树莓的SSR分析。     

苎麻SSR反应体系的优化

[目的]优化苎麻SSR反应体系。[方法]以苎麻湘苎2号基因组DNA为模板,对其SSR反应体系中的部分影响因素进行探讨分析,并利用选定的7个苎麻品种基因组DNA为模板,对优化的SSR反应体系进行试验验证。[结果]在25μl SSR反应体系中,模板量为50 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.10 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U时,反应体系为最佳。利用该反应体系,对7个苎麻品种进行的SSR反应结果显示不同品种间DNA谱带多态性丰富,同时表明优化的反应体系重复性和稳定性良好。[结论]该研究结果为应用SSR技术进行苎麻种质资源的研究奠定良好的基础。     

果梅SSR反应体系的优化

以果梅品种小叶猪肝为试材 ,研究了果梅SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响 ,并比较了采用聚丙稀酰胺凝胶及琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明 :在PCR反应体系中 ,Mg2 + 的最适浓度范围为1 89～ 2 83mmol·L-1;dNTP最适浓度为 0 2 4mmol·L-1;引物的最适浓度为 0 38μmol·L-1;Taq 聚合酶在 2 6 5 μL反应体系中宜加入 1U。利用此反应体系 ,对 2 4个果梅代表品种进行了SSR反应 ,用 8%的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测 ,扩增产物在 10 0～ 2 0 0bp之间 ,不同品种间DNA谱带多态性丰富。琼脂糖电泳检测的DNA多态性不如聚丙稀酰胺凝胶丰富     

稻瘟病菌SSR反应体系的优化

稻瘟病菌SSR检测是分子标记辅助育种的一项重要技术。为优化SSR反应体系,以稻瘟病菌菌株504为供试材料,采用单因素筛选法及L9(34)正交试验设计,研究了稻瘟病菌SSR分析中PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响。结果表明:在总体积为20μl的PCR反应中,TaqDNA聚合酶的最适用量为1.0U;Mg~(2 )、dNTP和引物的最适终浓度分别为1.0mmol/L、100μmol/L和0.4μmol/L。利用该体系进行扩增,所得谱带清晰、稳定、非特异性带少。     

麻黄属植物SSR反应体系的优化

以中麻黄为材料,探讨了麻黄SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物退火温度进行了优化,确立了适合麻黄SSR分子标记的优化体系。为了节约成本,在综合分析优化条件的基础上,最终确定的反应体系为:总体系25μL,其中Mg2+1.5 mmol.L-1,dNTP 0.5 mmol.L-1,Tag聚合酶1.0 U,引物浓度0.6μmol.L-1,退火温度为53~54℃.     

马铃薯SSR标记多重PCR反应体系优化研究

以马铃薯品种克新18为试验材料,探讨了多重PCR反应体系主要成分、引物不同比例关系及退火温度对SSR标记扩增的影响。在不改变其他成分浓度的条件下,对PCR反应体系的4个组分(Taq酶、MgCl2、模板DNA、dNTPs)进行浓度或用量梯度试验;利用正交设计L(934)对反应体系的4对引物组合(STM0014、Pat、SSI、UGP)在3个水平上进行优化;最终确立了马铃薯SSR标记多重PCR反应优化体系,总体积为20μL;2.5μL 25 mmol.L-1 MgCl2,0.6μL 10 mmol.L-1 dNTPs,Taq酶0.8 U,模板DNA 80 ng;4 mmol.L-1的4对引物之间的用量比为2:1:2:3,退火温度为54.7℃。优化后的反应体系重复性好,扩增结果稳定可靠,能够明显区分不同的马铃薯品种。为进一步探讨马铃薯品种资源遗传多样性、构建DNA指纹图谱打下了坚实的基础。     

泡桐SSR分子标记反应体系的建立

以健康毛泡桐二倍体为材料,通过对影响SSR扩增效果的泡桐DNA,dNTP和引物浓度,Taq酶量及退火温度等因素的筛选,建立了适宜的泡桐SSR分子标记反应体系.结果表明,泡桐的适宜SSR分子标记反应体系中,退火温度为53℃,泡桐DNA质量浓度为0.05 mg·L-1,dNTP和引物浓度分别为0.1 mmol·L-1和0.3μmol·L-1,而Taq酶量和10×Taq酶缓冲液则为0.025 U·μL-1和2.0 mmol·L-1.     

半矮生桃基因组DNA的提取及SSR-PCR反应体系的优化

为获得高纯度高质量的DNA和建立稳定的SSR-PCR反应体系,采用常规CTAB法和改进CTAB法提取半矮生桃基因组DNA。结果表明:改良CTAB法提取的DNA纯度高,多糖和蛋白质含量低,可用于SSR反应。同时,通过对影响SSR反应的6个要素设计正交试验,确定了最优的SSR-PCR反应体系,20μL反应体系为:25 mmol/LMg2+1.5μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、5 U的Taq酶0.22μL、10×Buffer缓冲液4μL、10 mmol/L引物0.6μL、20 ng模板0.8μL,优化的退火温度为57.6℃。     

Assessment of wheat variety distinctness using SSR markers

Assessment of variety distinctness is important for both the registration and the protection of particular variety. However, the current testing system, which assesses a range of morphological characters of each pair of varieties grown side-by-side, is time-consuming and is not suitable for the assessment of hundreds of samples. The objective of this study was to develop a procedure for the assessment of wheat variety distinctness using simple sequence repeat(SSR) markers. A comparison between the molecular and morphological profile of 797 varieties was made. On the basis of the comparison, pairs of varieties with a genetic similarity value(GSV) ≤90% were deemed to be distinct, accounting for ~85% of varieties assessed in wheat regional trials. For the remaining ~15% of varieties, GSVs between different varieties were 90%, among which ~35% were not distinct and the other ~65% were distinct. Therefore, if given a GSV90%, the pairs of varieties should be morphologically assessed in the field. To avoid any errors in the assessments, we proposed the elimination of contaminant plants from the sample before comparing the varietal genotypes, scoring of the genotype at each locus with a pair of allele numbers when constructing a molecular profile, and faithfully recording two alleles at a non-homozygous locus. To reduce the workload and cost, a three-grade markers comparison among varieties is suggested. In addition, 80 SSR markers and a technical procedure for assessment of wheat variety distinctness have been proposed. Based on the procedure, the distinctness assessment of ~85% of all wheat varieties is completed in our laboratory annually. Consequently, total field assessment has been reduced considerably.     

蜡梅SSR反应体系建立及引物筛选

以素心蜡梅为材料,分别通过对影响蜡梅SSR扩增效果的模板DNA,dNTP,引物浓度,Taq酶和退火温度等因素的筛选,建立了其适宜的蜡梅SSR分子标记反应体系,同时筛选了适宜蜡梅SSR扩增引物.结果表明,蜡梅SSR扩增的适宜退火温度为55 ℃,在20μL反应体系中,蜡梅模板DNA质量浓度、dNTP引物浓度分别为5mg·L...     

高粱抗蚜虫SSR体系的建立

以抗蚜高粱———河农16为试材,采用单因素筛选的方法,摸索SSR反应体系中各个影响因素的浓度和用量,然后采用完全随机试验,进行优化组合,最终获得适宜高粱抗蚜虫基因定位的SSR体系。其中TaqDNA聚合酶0 3μL(5u μL),10×PCRBuffer(Mg2+)2 0μL,引物1 5μL(10μmol L),模板DNA60ng。利用该体系进行扩增,所得谱带清晰、稳定、非特异性带少。     

中国小麦地方品种的SSR遗传多样性分析

【目的】揭示我国主要麦区小麦地方品种的遗传多样性。【方法】选用分布于小麦各染色体臂上的42对SSR引物,对我国10个麦区81个小麦地方品种的遗传变异情况进行分析。【结果】共检测到316个等位变异,单个引物扩增的等位变异为1～17个,平均为7.5个。参试小麦地方品种的多态信息含量PIC值为0～0.90,平均为0.63。平均等位变异数A基因组D基因组B基因组,平均PIC值各基因组间差异不大。遗传多样性最丰富的麦区是黄淮冬麦区和西南冬麦区。聚类分析结果表明,来自同一生态区的全部材料没有完全聚在一起,但冬麦区和春麦区材料间差异较明显。【结论】我国小麦地方品种具有较高的遗传变异,不同麦区间遗传多样性差异较大。     

荔枝基因组DNA提取与SSR反应条件优化

对荔枝野生、半野生和栽培种质分子遗传多样性研究中遇到的DNA提取和SSR扩增条件优化问题进行了试验。针对荔枝体细胞内富含多酚、多糖、色素以及蛋白质等次生物质的特点,以叶片为试材,采用改良的CTAB法获得了高质量的基因组DNA,有效应用于SSR扩增。同时,对SSR反应中的一些重要参数进行了优化,确定了荔枝SSR分析的适宜反应体系。     

实秆小麦86-741遗传背景的SSR标记分析

川86-741,是采用CIMMYT小黑麦与小麦杂交培育出的高穗整齐度、实心矮秆种质。以四川地方品种中国春(CS)和育成普通小麦品种川麦47为对照,选用小麦A,B和D基因组的166个SSR标记,对实秆材料86-741的遗传背景进行了比较分析,共检测到264个等位变异,每对引物可检测到1~3个,平均1.59个;小麦遗传材料86-741与中国春在66个位点(39.76%)上存在差异;与川麦47在58个位点(34.94%)上存在差异。