云南西瓜银灰斑驳病毒病害的鉴定

 应用DAS-ELISA和RT-PCR方法从褪绿和银色斑驳的西瓜叶片中检测到病毒分离物（WSMoV-YN）,感病样品能与WSMoV/GBNV复合抗血清（Agdia）呈阳性反应。获得WSMoV N蛋白的多克隆抗体,抗体能与WSMoV血清组成员CaCV和TZSV反应,但不能与INSV、TSWV、HCRV和GYSV反应。为明确引起该病害的病毒种类,采用Tospovirus通用引物对样品的总RNA进行RT-PCR扩增,获得长度为3 554 nt的S RNA全序列,经Blastn比对分析与WSMoV中国台湾分离物同源性最高,为95.8%,其N和NSs蛋白氨基酸序列同源性分别为99%和97.6%。构建系统进化树发现,西瓜银灰斑驳病毒云南分离物（WSMoV-YN）与其他WSMoV聚为一支。确定引起云南西瓜病害的病毒为WSMoV。     

上海崇明水仙病毒病病原种类鉴定

 2005~2007年对上海崇明水仙病毒病的种类进行了调查和鉴定。崇明水仙病毒病田间主要表现为花叶、斑驳、黄条和白条等多种症状,以花叶和斑驳为主。采用ELISA和RT-PCR方法,从36个水仙样本上检测到水仙普通潜隐病毒(NCLV)(GenBank登录号:EU200454)、水仙退化病毒(NDV)(GenBank登录号:EU200456);此外,有两类分离物被初步鉴定为新病毒,暂命名为水仙斑驳相关病毒(NMaV)(GenBank登录号:EU182651)和水仙白条相关病毒(NWSaV)(GenBank登录号:EU182652)。4类病毒的总检出率分别为11.1%、13.9%、100%和2.8%,其中NMaV为危害水仙的优势病毒。约20%的样本检测出有2种以上病毒的复合侵染,但是未检测出Potexvirus属的病毒。     

广西局地西番莲病毒病的病原鉴定及优势病毒分析

 在广西采集表现斑驳、花叶症状疑似病毒病的西番莲叶片样品,利用小RNA测序技术,结合生物信息学分析,鉴定侵染西番莲的病毒种类。参考测序结果采用DAS-ELISA和RT-PCR方法对2015~2018年间采集的385份疑似病毒病样品进行检测,分析引发广西西番莲病毒病的优势病毒种类。结果显示:小RNA共获得20 921 061 clean reads,拼接获得560个contigs,其中99个contigs被注释为夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus,TeMV),97个contigs被注释为黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV),69个contigs被注释为东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus,EAPV),12个contigs被注释为大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)。提取送测序的同批样品叶片的总RNA进行RT-PCR验证,可检测出TeMV、EAPV和CMV 3种病毒,未检出SMV。采用DAS-ELISA和RT-PCR对采集的样品进行检测,结果发现284份样品为阳性样品,检出率为73.76%,其中TeMV的检出率最高为64.16%,其次为EAPV和CMV,检出率分别为41.30%和11.43%;3种病毒存在复合侵染现象,其中TeMV+EAPV的检出率最高为24.94%,TeMV+CMV的检出率为4.16%,EAPV+CMV的检出率为0.26%,3种病毒复合侵染的检出率为4.94%。     

广东西瓜上检测到甜瓜黄斑病毒

在广东发现了可能被番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒侵染的西瓜,采用ELISA和RT-PCR法对该西瓜病样进行了检测,西瓜病叶粗汁液不与番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和西瓜银斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus,WSMoV)的血清发生反应;利用引物J13/UHP通过RT-PCR可以扩增出约1400 bp的基因片段,该片段包括一个840 bp的核衣壳蛋白ORF,其推导的氨基酸序列与已报道的Melon yellow spot virus(MYSV)NP基因氨基酸序列的同源率都为99%,进化树分析表明侵染广东西瓜的病毒(命名为MYSV-GZ)属于Tospovirus的MYSV血清组。     

侵染西瓜的小西葫芦花叶病毒的生物学特性鉴定

西瓜病毒病是制约西瓜产量及品质的顽疾.据报道,该病害造成的经济损失达到30%～50%.1981～1999年皖、苏、鲁、豫西瓜的病毒病曾几次大发生.危害西瓜的病毒病有西瓜花叶病毒1号(WMV-1)、西瓜花叶病毒2号(WMV-2)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、南瓜花叶病毒(SqMV)等32种[1].小西葫芦花叶病毒(ZYMV)是侵染葫芦科的主要病毒之一,1973年首次在意大利北部发现此病毒,至今已成为一个全球性的植物病毒[2].笔者对ZYMV合肥分离物的生物学特性进行了研究.     

侵染番茄的番茄褪绿病毒山东泰安分离物的分子鉴定和序列分析

2012年秋季, 在山东泰安番茄主要种植区中采集到叶片褪绿, 叶脉颜色变深的疑似番茄褪绿病毒病和番茄侵染性褪绿病毒病的番茄样品。利用番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)的特异引物 ToCV1/ToCV2和番茄侵染性褪绿病毒(Tomato infectious chlorosis virus, TICV)的特异引物TICV1/TICV2分别对样品进行扩增, 最后仅得到利用引物 ToCV1/ToCV2 扩增的101 bp 的核苷酸序列, 对该核苷酸序列克隆并测序。序列比对表明, 山东泰安地区分离物与已登录的番茄褪绿病毒(ToCV)分离物相似性都在99%以上。随后, 对山东泰安种植区ToCV番茄分离物进行外壳蛋白(CP)及热激蛋白(HSP70)序列的扩增、克隆和测序(GenBank登录号KC812620/KC812625), 经NCBI BLAST比对发现, 目的序列与番茄褪绿病毒日本番茄分离物ToCV Japan/Tochigi (GenBank登录号AB513442/AB513443)相似性最高为99%, 同属于毛型病毒属的番茄褪绿病毒, 这是首次明确山东地区番茄受到番茄褪绿病毒的侵染。     

侵染西瓜的5种病毒ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV的多重RT-PCR检测体系的建立与检测应用

 根据5种病毒小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的核苷酸保守区序列,设计特异性引物对,从影响多重RT-PCR (mRT-PCR)扩增的引物浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行反应体系的优化,建立了一种能够同时检测ZYMV、WMV、TMV、SqMV和CMV的多重RT-PCR技术体系,并进行了实际应用。在一个体系中对上述5种病毒复合侵染的西瓜材料进行多重RT-PCR扩增,得到与试验设计相符的5条特异性条带,依次是542、485、410、354和293bp。该体系实现了对侵染西瓜的5种病毒的同时检测,极大地提高了检测效率,降低了检测成本,体现了多重RT-PCR的优越性。     

京郊番茄主要病毒病毒原鉴定

近年来, 番茄病毒病, 特别是番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）病在北京地区空前暴发, 给番茄生产造成严重威胁, 使番茄的产量和品质显著降低。2012-2013年在北京周边7个区县, 采集疑似感染病毒的番茄植株样品325份, 分别针对TYLCV、烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）3种病毒进行了PCR或ELISA 检测。检测结果表明, 目前在北京地区大棚或温室内发生的番茄病毒病以TYLCV为主; 露地番茄病毒复合侵染现象比较普遍, 病毒检出率100%, 其中TYLCV检出率达到75%以上。在TYLCV侵染的样品中, TYLCV和CMV复合侵染占20%左右, TYLCV和TMV复合侵染占15%左右。部分样品检测到TYLCV、CMV 和TMV 3种病毒复合侵染的现象。     

新疆番茄病毒病检测及南方番茄病毒全基因组序列测定与传播特性分析

为了解新疆番茄上病毒病的发生情况,利用一步法RT-PCR技术检测了南北疆番茄上南方番茄病毒(Southern tomato virus,STV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)以及马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的感染情况,并利用分段克隆的方法进行全基因组测序,通过RT-PCR方法检测健康植株与携带病毒植株杂交育种的F1代植株带毒率以分析STV的种子传播特性。结果显示,新疆番茄上CMV、STV、ToMV和PVY在北疆的检出率分别为52%、37%、27%和14%;在南疆的检出率分别为79%、60%、69%和0;且以STV、CMV及ToMV的复合侵染为主。从我国加工番茄上首次获得了长3 437 nt的STV SHZ-1核苷酸序列,序列比对分析发现其与已报道STV只有1~9个核苷酸的变异,且序列变异与地域无相关性。分析杂交F1代加工番茄植株上STV的传播特性,发现其除可由种子传播外,也可通过花粉传播。表明STV是侵染新疆番茄的主要病毒之一,且该病毒可通过种子或杂交育种途径进行传播。     

番茄环纹斑点病毒核壳体蛋白抗血清制备及其血清学特性分析

 番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)是番茄斑萎病毒属的一个新种,对云南番茄、辣椒生产造成严重危害。用RT-PCR 从感病番茄中扩增得到长度为837 bp TZSV 的核壳体蛋白基因(N 基因),将其克隆到原核表达载体pET-28a( + ),获得重组原核表达载体pET-TZSV-N,在大肠杆菌BL21 中表达,SDS-PAGE 分析表明,该载体高效表达33kDa 的融合蛋白;以纯化的融合蛋白作为抗原免疫家兔制备TZSV 核壳体蛋白(N 蛋白)的多克隆抗体,间接酶联免疫测定(ID-ELISA)表明效价为1 / 6 000;Western blot 分析表明,该抗血清能与西瓜银色斑驳病毒(WSMoV)血清组的辣椒褪绿病毒(CaCV)反应,而与番茄斑萎病毒(TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(INSV)无血清交叉反应,说明获得的抗血清能用于WS-MoV 血清组成员的检测,TZSV 属于WSMoV 血清组成员。     

吉林、黑龙江毛葱病毒病调查

本研究为明确吉林和黑龙江省毛葱病毒病发生率,从两省5个地区共采集255份毛葱样品。根据毛葱4种主要病毒基因组序列设计特异性引物,对胡葱黄条病毒Shallot yellow stripe virus(SYSV)和青葱X病毒Shallot virus X (SVX)、洋葱黄矮病毒Onion yellow dwarf virus (OYDV)和葱潜隐病毒Shallot latent virus (SLV)进行双重RT-PCR检测。结果表明,229份样品检出病毒,带毒率为89.8%,SLV的检出率最高,达87.06%,OYDV次之,为36.86%,SYSV检出率偏低,为0.78%;同时存在病毒复合侵染,其中双病毒复合侵染为SLV和OYDV,检出率为33.3%;三病毒复合侵染为SYSV、OYDV和SLV,检出率为0.78%,未发现4种病毒复合侵染。本研究为吉林和黑龙江种植区毛葱病毒病防治提供了参考依据。     

云南三七病毒病的发生及病毒种类检测

 对云南省文山市、昆明市、红河州、曲靖市的三七主要种植区进行病毒病调查及相关病毒检测,发现病毒病在上述地区均有发生,年平均发病率均在5%以上,且种植年限越长发病率越高,已成为三七上仅次于根腐病的主要病害。三七病毒病症状类型复杂多样,主要有白化、黄化、褪绿、斑驳、皱缩、卷叶和坏死等。利用PCR/RT-PCR对2011年~2015年,以及2017年采集的466份疑似病毒病样品进行检测,发现侵染三七的病毒主要有三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)、中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)及其卫星(tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)、三七A病毒(Panax notoginseng virus A,PnVA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV),基中PnVY为当前为害云南三七的优势病毒,TVDV在三七上侵染为害系黄症病毒科成员侵染人参属植物的首次报道。PnVY、TYLCCNV、PnVA和TVDV的平均检出率分别为51.5%、31.9%、10.7%和7.0%,存在PnVY + TYLCCNV、PnVY + PnVA以及PnVA + TVDV复合侵染的现象,复合侵染的检出率分别为20.6%、3.4%和0.3%。未检测到番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒、毛形病毒属(Crinivirus)病毒,以及菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)中除TYLCCNV以外的其他病毒。     

从云南蝴蝶兰上检测到番茄斑萎病毒属病毒

 应用电镜观察、DAS-ELISA以及RT-PCR检测,从症状表现黄化、环斑的云南蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)病样中分离得到的一个病毒分离物Tospo-Pha。该分离物粒子近球形、具包膜、直径约90nm,与番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的西瓜银色斑驳病毒(Watermelon silver mosaic virus,WSMoV)/花生芽坏死病毒(Groundnut bud necrosis virus,GBNV)复合抗血清呈强阳性反应,分子检测发现该分离物SRNA5'末端序列与CaCV大岩桐分离物(CaCV-Gloxinia)同源性最高(91.0%),在系统进化树中与CaCV聚于同一分支。上述结果表明,从云南蝴蝶兰中分离到的Tospo-Pha属于Tospovirus病毒。     

深度测序发现贵阳发生的辣椒病毒病由多种病毒复合侵染所致

2016年9月贵州省贵阳市发生严重的辣椒病毒病,症状复杂,主要表现为植株矮化,叶片黄化、花叶、皱缩、畸形以及枯死斑,果实有坏死斑等,根据症状难以判断病毒种类。本文采用小RNA深度测序技术对田间自然发病的2株辣椒标样进行了毒源鉴定,发现样品1由蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2,BBWV2)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和辣椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus,BPEV)4种病原复合侵染;样品2中除鉴定到上述4种病毒外,还检测到马铃薯Y病毒(Potato virusY,PVY)。进一步通过反转录PCR(RT-PCR)对深度测序结果进行了验证,证明其准确可靠。其中4个辣椒标样中均有的辣椒内源RNA病毒(BPEV)为贵州省首次报道。多种病毒复合侵染是辣椒产量和品质的重要限制因素之一,是辣椒生产的主要威胁。     

云南三七病毒病的发生及病毒种类检测

 对云南省文山市、昆明市、红河州、曲靖市的三七主要种植区进行病毒病调查及相关病毒检测,发现病毒病在上述地区均有发生,年平均发病率均在5%以上,且种植年限越长发病率越高,已成为三七上仅次于根腐病的主要病害。三七病毒病症状类型复杂多样,主要有白化、黄化、褪绿、斑驳、皱缩、卷叶和坏死等。利用PCR/RT-PCR对2011年~2015年,以及2017年采集的466份疑似病毒病样品进行检测,发现侵染三七的病毒主要有三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)、中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)及其卫星(tomato yellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)、三七A病毒(Panax notoginseng virus A,PnVA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV),基中PnVY为当前为害云南三七的优势病毒,TVDV在三七上侵染为害系黄症病毒科成员侵染人参属植物的首次报道。PnVY、TYLCCNV、PnVA和TVDV的平均检出率分别为51.5%、31.9%、10.7%和7.0%,存在PnVY + TYLCCNV、PnVY + PnVA以及PnVA + TVDV复合侵染的现象,复合侵染的检出率分别为20.6%、3.4%和0.3%。未检测到番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒、毛形病毒属(Crinivirus)病毒,以及菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)中除TYLCCNV以外的其他病毒。     

云南辣椒正番茄斑萎病毒属病毒的分子鉴定

辣椒是云南省主要经济作物之一,近年来病毒病尤其是正番茄斑萎病毒属病毒发病严重,影响了辣椒产量和品质。利用RT-PCR技术对从云南辣椒主产区采集的疑似感染正番茄斑萎病毒属病毒的25份辣椒样品进行分子鉴定,结果显示,12份样品检测出正番茄斑萎病毒属病毒,检出率为48.0%,其中6份是番茄斑萎病毒tomato spotted wilt orthotospovirus (TSWV),检出率为24.0%;5份是番茄环纹斑点病毒tomato zonate spot orthotospovirus (TZSV),检出率为20.0%;有1份是TSWV和TZSV复合侵染,检出率为4.0%,这是在云南辣椒生产上首次发现TSWV和TZSV的复合侵染。通过鉴定,初步了解正番茄斑萎病毒属病毒在云南辣椒生产中的发生情况和种类,为制定云南地区该属病毒的防治策略提供理论依据。     

河南甜樱桃病毒病害调查及病原检测

在河南省郑州市、巩义市、荥阳市、新郑市选择具有代表性的甜樱桃生产园对病毒病发生情况进行调查,采集表现为疑似病毒病症状的样本65份,利用7种病毒引物进行RT-PCR检测。5种病毒检测结果呈阳性,分别是李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李矮缩病毒(Prune dwarf virus,PDV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus,CGRMV)、樱桃坏死锈斑病毒(Cherry necrotic rusty mottle virus,CNRMV)及樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA);序列分析结果表明,5种病毒扩增片段与GenBank中注册的相应病毒核苷酸序列均具有较高的一致性;样本病毒检出率为100%,其中13份样本为单独侵染,其余52份样本均为多病毒复合侵染,占比高达80%,复合侵染比例随着侵染病毒种类的增多逐渐降低;病毒侵染组合与叶片表型症状无明显对应关系。     

基于小RNA深度测序和RT-PCR检测侵染广东省冬种马铃薯的病毒

为明确侵染广东省冬种马铃薯的病毒种类及优势病毒,结合小RNA深度测序技术及RTPCR检测方法,对采集于广东省冬种马铃薯7个主产区的189份疑似病样进行检测分析。结果表明,经小RNA深度测序技术检测马铃薯病毒病混合样,发现存在马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)和马铃薯卷叶病毒(Potato leaf-roll virus,PLRV)3种病毒。进一步设计3种病毒的特异性引物并利用国内已报道的其它5种马铃薯病毒的特异性引物进行RT-PCR检测,发现189份马铃薯病毒病疑似病样中仅检测到PVY、PVS和PLRV这3种病毒,检出率依次为75.13%、10.05%和4.76%,且3种病毒在马铃薯上还存在复合侵染,复合侵染率为14.19%,其中PVY在各马铃薯产区均可检测到。表明侵染广东省冬种马铃薯的病毒为PVY、PVS和PLRV,其中PVY是优势病毒。     

广西柑橘衰退病和黄脉病调查及其病原病毒的遗传多样性分析

为明确柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus, CTV)和柑橘黄脉病毒(citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)在广西柑橘上的发生?分布及其遗传变异情况, 于2020年至2021年对百色?北海?崇左?贵港?桂林?河池?贺州?来宾?柳州?南宁?梧州和玉林等12个柑橘产区进行了病毒病调查?采用RT-PCR对采集样品进行了病毒检测, 并基于病毒分离物外壳蛋白(coat protein, CP)基因的核苷酸序列进行比对分析, 构建系统发育树?结果表明:采集的737份柑橘样品中, CTV的检出率为20.62%, CYVCV检出率为18.32%, CTV的检出率略高于CYVCV?病毒复合侵染的现象在采集的柑橘样品中普遍存在, CTV和CYVCV复合侵染率高达34.50%?对RT-PCR产物测序共获得12个CTV分离物和6个CYVCV分离物的CP基因序列?遗传多样性分析发现, CTV和CYVCV的CP基因序列都较保守, CTV分离物的遗传进化与地理来源?寄主来源均没有明显相关性, 但CYVCV分离物的遗传进化与地理位置具有相关性, 而与寄主来源无明显相关性?上述研究结果可为深入了解CTV和CYVCV在广西的流行情况以及柑橘病毒病的检疫和防控提供参考?