H5N1亚型禽流感病毒对鸡的致病性研究进展

对鸡感染H5N1亚型禽流感病毒（AIV）后的临床表现、大体病变、病理组织学、生理生化指标、细胞免疫功能、病毒的组织分布和细胞凋亡的研究进展进行概述,探讨了该病毒对鸡高致病性的分子基础．     

H5N1亚型禽流感病毒的鸭致病性研究

 【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性（IVPI=3），而且对鸭也具有高致病性。雏鸭人工感染该病毒后临床表现典型的神经症状，剖检可见脑膜点状出血，肝脾肿大并见有坏死灶，肺脏严重充血、出血，消化道粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征，并表现为不同程度的损伤。感染鸭死亡集中在感染后的4～6 d，致死率75%。雏鸭在病毒感染后2～4d的气管、泄殖腔及全身各主要器官均可分离到病毒。虽然攻毒后14 d耐过鸭血清中可检测到1∶16的HI抗体；但是此时胰腺中仍然可分离到低水平的病毒。【结论】本研究继从野鸟分离到对鸭具有高致病性禽流感病毒之后，首次证实家禽中也存在对鸭具有高致病性的禽流感病毒流行。     

H7N3亚型禽流感病毒分离株的生物学特性研究

为了了解经分离纯化、鉴定保存的1株鸭源H7N3亚型禽流感病毒株的一些生物学特性,参照判定禽流感致病性的标准方法对其进行生物学特性的研究.结果显示其鸡胚半数感染量(EID50)、组织培养半数感染量(TCID50)及最小致死量致死鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为0.5×106.3 Ml-1、0.5×10-2.3 Ml-1及136.8 h;1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0;本毒株不引起鸭及BALB/c鼠的发病和死亡,这些都表明本毒株为低致病性禽流感病毒.     

H9N2亚型禽流感病毒的致病特性研究

将SS，KMI，KMIII3个禽流感病毒的感染性胚液分别中2周龄及5周龄的SPF鸡，观察其症状及病理变化。结果显示：1，3个毒株均可引起攻毒鸡体温升高，部分出现水样淡黄色稀粪，但不能致死攻毒鸡，表明3个毒株均为非高致病力毒株，2，攻毒鸡除胰腺充血出血外，其他器官不见明显的肉眼病理变化，但组织病理病理学的变化较为明显和一致，主要为：脑及脊髓充血出血，神经元变性坏死，胶质细胞增生；心肌在出血，组织变性坏列, 腺充血出血，组织坏死，3个毒株对5周龄SPF鸡的病理变化无明显差异，但KMI毒株对2周龄SPF鸡的病理损害稍大于SS株。     

1998-2021年我国人感染H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化规律

【目的】通过分析1998—2021年间我国人感染H9N2亚型禽流感病例的发病时间、所在省份、年龄和性别等信息,明确H9N2亚型禽流感病毒的流行病学特征;通过分析人源H9N2亚型禽流感病毒的基因特征,阐明人源H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化规律;为H9N2亚型禽流感病毒跨种间传播的预警和防控提供数据支撑。【方法】基于流感基因数据库、病例报道和文献资料,获得1998—2021年我国人感染H9N2亚型禽流感病毒的病例信息和毒株序列数据。从时间、空间、性别和年龄的分布对感染病例进行分析,明确人源H9N2亚型禽流感病毒感染的流行病学特征。通过DNASTAR中的MegAlign软件对人源H9N2病毒的各基因片段的核苷酸序列进行同源性分析,利用MEGA7.0软件构建系统进化树和分析病毒蛋白关键位点,揭示遗传演化趋势和病毒蛋白关键氨基酸位点的变异情况。通过GISAID网站下载2019—2021年间我国H9N2亚型禽流感病毒的核苷酸序列,利用mafft比对后在MEGA7.0中查看人源与禽源H9N2病毒关键氨基酸位点的突变差异,揭示当前人源和禽源H9N2病毒可能引起的风险。【结果】1998—2021年我国...     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

强普生Ⅲ号对H5N1亚型禽流感病毒的杀灭试验

强普生Ⅲ号是以多种植物为原料,采用科学方法提练精制而成的中草药,其富含鞣质、毛莨黄素、生物碱、酚类、黄酮甙、靛甙、蒽醌甙等物质,能增强动物机体的免疫功能.提高动物机体抗应激的能力,有很好的抗病毒作用。与常用的消毒药物相比较,强普生Ⅲ号具有不含任何化学物质,无毒副作用、不易产生耐药性、无残留的特点。本试验结果表明:强普生Ⅲ号与禽流感病毒作用10分钟后,原液、1:5、1:10、1:20、1:40、1:80的受试液对病毒的杀灭率均为100%,有完全的杀病毒作用, 是一种理想的绿色环保型消毒剂。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

基于荧光熔解曲线模式RT-PCR快速检测H5N1亚型禽流感病毒

针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR Green Ⅰ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因.熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(795±03)℃和(833±03)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列.该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰.AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA 无扩增信号.本法最低可检测210拷贝·μL-1和195拷贝·μL-1 H5和N1重组质粒,敏感度分别是RT-PCR的100、1 000倍.本研究建立的基于荧光熔解曲线模式RT-PCR可用于H5N1亚型AIV的检测.     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。     

一株广西鸡源H6亚型禽流感病毒全基因组序列分析及其重要生物学特性

2017年对广西地区活禽交易市场进行低致病性禽流感流行病学调查,从采集的鸡咽喉和泄殖腔拭子中分离鉴定出一株鸡源H6N6亚型禽流感病毒,命名为A/chicken/Guangxi/286C10/2017(H6N6)。应用RT-PCR方法分别对分离毒株的8个基因片段进行扩增,同时将产物进行克隆和测序,然后对测序结果进行同源性比对及遗传进化分析。另外,还通过固相受体结合试验对毒株的唾液酸受体进行测定。结果显示,该分离株的HA基因与广东分离株A/chicken/Guangdong/G3249/2014(H6)的核苷酸同源性最高,裂解位点符合低致病性禽流感病毒的分子特征;NA基因与江西分离株A/duck/Ganzhou/GZ148/2016(H6N6)核苷酸同源性最高;内部基因中,PB1和NS基因来源于广东的鸡,PB2基因来源于越南的鸡,PA、NP和M基因来源于广西的鹅;同时,研究还发现该病毒的HA、NA、PA、NP和M基因来源H6亚型AIV,PB2、PB1和NS基因来源H9N2亚型AIV,推测A/chicken/Guangxi/286C10/2017(H6N6)可能是由不同地区、不同宿主来源的H...     

陈化兰:H5N1亚型禽流感疫苗的研究及应用

1996年,我国首次在广东病鹅体内发现H5N1亚型高致病力禽流感病毒.其后,在有关主管部门的领导下,我国兽医科学工作者开展了大量的禽流感主动监测和研究工作.通过系统研究发现,我国H5N1禽流感分离株的抗原性存在相对保守性,为使用疫苗防治该病提供了重要理论依据.     

H5亚型禽流感病毒分离株对金刚烷胺耐药性的鉴定

对1株H5亚型禽流感病毒（AIV）分离株进行了金刚烷胺耐药性的鉴定．应用RT—PCR获得了AIV178株的M基因,序列分析显示M2蛋白有S31N的点突变;动物试验发现该毒株对200mg／L金刚烷胺饮水途径给药仍有抗性．结果表明AIV178分离株具有对金刚烷胺的耐药性,而且M2蛋白的第31位氨基酸突变可能与此有关．     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及在E.coli中的表达

选择一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(简写为GD/1/96),根据测得的NS基因序列,设计一对特异性引物NS1U/NS1L,RT-PCR方法扩增该毒株的NS1基因。将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体PET-32a( ),并进一步酶切分析和序列测定,鉴定出NS1基因的阳性重组子。阳性质粒转化E.coliBL 21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定,成功的在细菌包涵体中表达出45 kD的NS1融合蛋白。重组蛋白经Ni-NTA His.Bind Resins纯化。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立

 A/goose/Guangdong/1/96（GSGD/1/96）是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒，它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株，而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统，并通过细胞转染成功拯救了该病毒（R-GSGD/1/96）。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和 Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性，即对鸡都是高致病性毒株，R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10；救获病毒与野生病毒一样，尽管106EID50经鼻腔感染小鼠后1～2 d内能从肺脏检测到低滴度的病毒，但不能在小鼠体内成功复制。GSGD/1/96反向基因操作系统的成功建立为进一步开展中国高致病性禽流感病毒分离株的生物学特性、遗传衍化及结构与其功能关系研究奠定了基础。     

华东地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传演化分析

为了解华东地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传特点和流行规律,利用RT-PCR方法扩增华东地区2008~2013年分离的17株H9N2亚型AIV血凝素(HA)基因片段,进行序列测定和遗传进化分析,并对HA蛋白质的裂解位点、受体结合位点和潜在的糖基化位点进行分析。结果显示,17株H9N2亚型AIV HA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为84.6%~99.3%和86.0%~99.5%,均属于欧亚分支。其中15株鸡源病毒属于Y280-like亚系,2株鸭源病毒属于G1-like亚系。HA裂解位点都是非连续碱性氨基酸,属于低致病力毒株。HA受体结合位点149、150、191、198和234位氨基酸存在变异,尤其是234位氨基酸有14株毒株变为L,表现出人流感病毒受体结合特性。有2株毒株在145位氨基酸出现新的糖基化位点,5个毒株在218位氨基酸缺失1个糖基化位点,13个毒株在313位氨基酸增加了一个新的糖基化位点。研究结果表明华东地区近年来H9N2亚型AIV存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。     

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

为制备H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组HA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-HA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-HA通过电转化法导入根癌农杆菌EHA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,HA基因已插入到水稻基因组中,重组HA基因大小为4 660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组HA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组HA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组HA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒HA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组HA蛋白...     

新型H3N3亚型禽流感病毒对鸡致病性与传播性研究

新型禽流感病毒对家禽养殖业可造成严重经济损失,及时发现和阻断其传播具有重要意义。2022—2023年,本实验室在我国发病鸡群中监测到新型H3N3亚型禽流感病毒的出现和传播。本研究对发病鸡群开展了临床发病情况调查,对分离病毒进行了全基因组演化分析,并对分离的代表性病毒进行了鸡致病性以及空气传播性试验。结果表明：1)H3N3最早于2022年12月在华东地区发生产蛋下降的蛋鸡群出现,随后陆续在华东、华北、东北等多个地区的鸡群中监测到,发病群体主要为产蛋鸡,鸡群发病率高,死亡率低(1%～5%),主要引起产蛋率急性下降(10%～40%)。2)病毒全基因组序列分析显示,H3N3病毒为新型重排病毒,由鸡群中流行的H3N8病毒与H10N3病毒重排产生,6个内部基因来源于H9N2病毒。3)与H3N8病毒类似,新型H3N3病毒对鸡群高度易感,可在鸡鼻甲、气管、肺等呼吸器官中高效复制并排毒,引起呼吸系统严重病理损伤。4)空气传播性结果表明,新型H3N3病毒可在鸡群之间空气传播,而H3N8病毒不能在鸡群间空气传播。综上,新型H3N3禽流感病毒对鸡具有较强的致病性和传播性,有可能成为新的优势流行病毒,对我国家禽...     

一株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列的遗传变异分析

[目的]了解H9N2亚型禽流感病毒分离毒株A／Chicken／Hebei／WD／98（简称WD98）与其他参考毒株的遗传变异关系。[方法]采用RT—PCR技术扩增了WD98分离株8个基因片段的全基因序列,并将其与7个参考毒株进行同源性比较及遗传进化分析。[结果]分离株WD98与7个参考毒株全基因组同源性为91．1％～95．8％,与A／duck／HongKong／Y280／97的全基因组核苷酸同源性最高（95．8％）,而与A／chicken／Pakistan／2／99同源性最低（91．1％）。WD98株的HA基因裂解位点为R—S-S—R↓G,其第226位受体结合住点为Q。[结论]禽流感病毒WD98毒株为低致病性禽流感病毒,不易感染人,与A／duck／HongKong／Y280／97亲缘关系最近,同属于欧亚种系A／Chicken／Beijing／1／94亚系。而在这同一亚系中,WD98株与A／Chicken／Beijing／1／94株的亲缘关系最远。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。