本氏烟NbWRKY40亚家族转录因子抗病相关功能研究

 植物WRKY类转录因子的IIa亚类广泛参与调控植物的生物胁迫和非生物胁迫过程。本研究根据拟南芥和普通烟中具有抗病和抗胁迫功能的IIa亚类WRKY40转录因子的序列,利用基因同源克隆法,获得本氏烟中NbWRKY40基因。序列分析表明在本氏烟中有5个属于IIa亚类的基因,其序列之间具有高度相似性。qRT-PCR检测发现NbWRKY40基因是受寄生疫霉侵染诱导上调表达的基因,通过VIGS技术研究该类基因在本氏烟中的抗病相关功能,用半活体营养型寄生疫霉进行抗病性试验,结果表明NbWRKY40基因的沉默降低了本氏烟对寄生疫霉的抗性,且在侵染点的细胞坏死程度增强,过氧化氢积累和胼胝质沉积都明显减少。NbWRKY40基因沉默同样降低了本氏烟对死体营养型灰霉菌的抗性。检测NbWRKY40基因沉默后4个不同抗病信号通路下游基因的表达,发现基因沉默导致参与抗病和SA途径的PR1b、PR2b基因受疫霉侵染诱导表达的水平明显下降。综上,推测NbWRKY40基因可能依靠SA介导的信号通路参与调控本氏烟抗病性。     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。     

小麦蔗糖非发酵相关蛋白激酶SnRK3基因的克隆与分析

为明确小麦蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶（sucrose non-ferment-1-related protein kinase,SnRK）在协调植物体内多种信号通路之间的作用,通过普通PCR方法从扬麦20中克隆SnRK基因,利用生物信息学方法对其进行分析,使用实时荧光定量PCR技术分析其在激素、干旱、盐和病菌胁迫下的表达模式,并测定瞬时过表达该基因对烟草叶片抗致病疫霉Phytophthora infestans侵染能力的影响。结果显示,从扬麦20中克隆获得SnRK3基因,命名为TaSnRK3.16-D;该基因编码蛋白可能通过与多种蛋白互作参与多种形式的调控;过表达TaSnRK3.16-D增强了小麦对脱落酸、NaCl、PEG、白粉病菌Blumeria graminis f. sp. tritici和赤霉病菌Fusarium graminearum胁迫的抗性,经亚细胞定位和根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens瞬时表达试验验证表明TaSnRK3.16-D定位于细胞膜上,且其在烟草叶片上过表达部位的致病疫霉侵染病斑颜色较对照病斑颜色浅,一定程度上抑制了致病疫霉的侵染。表...     

辣椒疫霉CRN编码基因的克隆、转录特征及在与寄主互作中的作用

 CRN (crinkling and necrosis-inducing protein)蛋白是一类卵菌特有的效应分子,然而目前对其功能和分子机制知之甚少。为分析CRN效应分子在辣椒疫霉(Phytophthora capsici)与植物互作中的作用,本研究利用前期转录组测序结果,对辣椒疫霉基因组数据库进行序列比对分析,获得了7个CRN编码基因的全长序列;采用RT-PCR方法分析其在辣椒疫霉生长发育阶段(菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发的休止孢)和侵染寄主阶段(本氏烟(Nicotiana benthamiana)灌根1.5、3、6、12、24、36和72 h后)的转录水平,发现3个基因在辣椒疫霉生长发育阶段和侵染阶段上调表达;将这3个基因克隆测序,发现其编码蛋白均含有保守的LFLAK和HVLVVVP基序;在本氏烟上的基因瞬时表达结果表明,Pc559084和Pc570403能够抑制由致病疫霉elicitin蛋白INF1或老鼠促凋亡蛋白BAX诱发的植物程序性细胞死亡,并且Pc559084能够促进辣椒疫霉侵染植物。这些研究结果为理解CRN效应分子在辣椒疫霉致病过程中的作用提供了重要的实验数据。     

NbRbohB基因在本氏烟与疫霉菌互作中的功能分析

活性氧(active oxygen species, AOS)在植物抗病中发挥着重要作用,主要由NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase)系统产生.为明确NADPH氧化酶NbRbohB基因在本氏烟与疫霉菌亲和与非亲和性互作中的功能,采用荧光定量PCR技术以及病毒诱导的基因沉默方法探究了NbRbohB基因在本氏烟中对2种疫霉菌抗性中的作用,并利用NADPH氧化酶抑制剂对辣椒疫霉的抗性进行了检测.结果发现:2种疫霉菌均能诱导本氏烟发生氧迸发,且NbRbohB基因可能参与了疫霉菌诱导本氏烟发生的氧迸发过程.该基因沉默后降低了本氏烟对亲和互作辣椒疫霉菌的抗性,但对非亲和互作疫霉菌的抗性没有肉眼可见的影响;NADPH氧化酶抑制剂处理本氏烟后也能降低其对辣椒疫霉的抗性.表明该基因通过介导AOS产生,参与植物对亲和性与非亲和性互作疫霉的抗病反应,在亲和互作中尤为重要.     

效应因子PsCRN77基因在本氏烟中的表达降低其对寄生疫霉的抗性

CRN(Crinkler)是一类疫霉菌胞内效应因子,绝大多数CRN的功能和作用机制尚不明确。本研究利用农杆菌介导的瞬时表达技术,发现大豆疫霉效应因子PsC RN77可以在本氏烟中抑制激发子诱导的细胞死亡。接种分析表明在本氏烟中表达该效应因子基因可以促进寄生疫霉的侵染。定量RT-PCR结果显示在本氏烟中表达PsCRN77可以负调控水杨酸信号途径标记基因PRb-1b的表达,正调控茉莉酸信号途径标记基因LOX的表达。进一步通过DAB染色表明,与表达GFP对照相比,表达PsCRN77可以降低疫霉菌侵染后本氏烟中的活性氧积累。以上结果表明PsCRN77是一个毒性效应因子,可以通过影响激素抗性信号途径和活性氧积累干扰植物的防卫反应,促进病原菌的侵染。该研究为认识疫霉菌的致病机制提供了线索。     

苹果类甜味蛋白编码基因Mdtl2克隆及功能的初步验证

植物类甜味蛋白(Thaumatin like proteins, TLPs)是一类具有抗菌活性和抗非生物胁迫作用的病程相关蛋白。本研究克隆获得富士苹果(Malus domestica cv. Fuji)TLPs家族蛋白Mdtl2编码基因，该基因开放阅读框全长为912 bp,编码303个氨基酸。生物信息学分析显示Mdtl2含有多个保守的半胱氨酸及TLPs家族保守序列片段，且具有TLPs典型的三维结构，属于TLPs家族的糖苷水解酶64家族(GH64-TLP-SF Superfamily)。在烟草中过表达Mdtl2能够显著抑制疫霉(Phytophthora infestans)的侵染。在苹果中过表达Mdtl2显著抑制苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的侵染，并且能够诱导胼胝质的积累。上述结果表明，Mdtl2作为糖苷水解酶家族蛋白，能够通过诱导胼胝质的积累，提高植物对病原菌的抗性。     

稻曲病菌SIX效应蛋白参与调控植物免疫

为明确稻曲病菌Ustilaginoidea virens的SIX(secreted in xylem)效应蛋白功能,利用生物信息学软件预测6个SIX1蛋白和1个SIX2蛋白的分泌特性,并通过酵母分泌系统对其分泌特性进行验证,在烟草上通过根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的瞬时表达系统检测SIX蛋白对小鼠促凋亡蛋白BAX、致病疫霉Phytophthora infestans激发子INF1、大豆疫霉Phytophthora sojae病原相关分子模式糖基水解酶XEG1引起烟草细胞坏死的作用,在烟草上表达SIX蛋白后接种辣椒疫霉Phytophthora capsici并观察其对辣椒疫霉侵染的作用。结果显示:所检测的SIX蛋白中有5个含有预测的信号肽,2个被预测为非经典分泌蛋白,但经酵母分泌系统验证均具有分泌功能;大部分SIX蛋白能够抑制BAX、INF1、XEG1引起的烟草细胞坏死,但抑制坏死的情况并不完全一致;大部分含信号肽的SIX蛋白能够促进辣椒疫霉侵染,UV8b＿3638去信号肽突变体也能够促进辣椒疫霉侵染。表明大多数SIX蛋白参与调控植物免疫,且能促进病原...     

马铃薯晚疫病菌效应子PITG_16427.2的基因序列分析及功能验证

 马铃薯晚疫病的病原是致病疫霉菌(Phytophthora infestans),该病原菌在侵染马铃薯过程中分泌大量RxLR型效应子,但目前绝大多数RxLR效应子的功能和作用机制尚不明确。本研究成功克隆了致病疫霉菌的一个RxLR效应子PITG_16427.2,在本氏烟中瞬时表达PITG_16427.2,发现该效应子能够抑制6种激发子(INF1、PsojNIP、BAX、SIF2、Avh238、Avh241)激发的植物免疫反应。进一步研究发现,效应子PITG_16427.2在晚疫病菌侵染马铃薯早期上调表达。在15个致病疫霉菌株和3个同属菌株中克隆该基因,克隆到氨基酸序列一致性超过93%的同源基因,这些同源基因均能在本氏烟中抑制INF1和Avh241引起的HR,揭示了该效应子在病原卵菌中序列和功能的高度保守性。在本氏烟和马铃薯感病品种Désirée中瞬时表达PITG_16427.2,发现该效应子能够显著促进晚疫病菌的侵染。通过qRT-PCR方法检测发现,乙烯信号的相关基因ERF1显著上调,而水杨酸信号相关基因PR1b显著下调,表明PITG_16427.2在晚疫病菌侵染过程中可抑制寄主的SA信号途径,促进晚疫病菌侵染。因此,RxLR型效应子PITG_16427.2是致病疫霉菌中一个重要的侵染致病因子。     

大豆中疫霉诱导性GmDRRP基因启动子的克隆与功能分析

本研究根据大豆与疫霉互作的基因芯片数据,筛选了一个受疫霉诱导表达的大豆抗病相关基因(Gm DRRP,glycine max disease resistance response protein),并对其启动子响应疫霉侵染的功能进行了研究。序列分析表明该基因编码一个大豆抗病相关蛋白。分别用SA、Me JA、ABA、ETH和GA3五种激素处理后,发现该基因的表达受激素的抑制。克隆其转录起始位点上游1 590 bp的启动子区,生物信息学分析发现该区域包含多个已知与逆境响应相关的顺式元件。进一步将启动子构建在融合Gus报告基因的植物表达载体上,分别瞬时转化烟草和稳定转化大豆根毛,并检测了Gus报告基因的表达情况。结果表明,Gm DRRP启动子均能在两种体系中不同程度的受疫霉诱导,其表达模式为接种后0.5 h被快速诱导,并在2 h时显著提高。根据生物信息学对顺式元件的预测结果,对启动子进行了分段分析,获得了一个222 bp的小片段,其疫霉诱导表达能力是全长启动子的34%。以上结果表明大豆的Gm DRRP启动子能被疫霉快速诱导。     

荔枝霜疫霉中双组分信号转导系统的鉴定与表达分析

 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)隶属于茸鞭生物界卵菌门疫霉属,由其引起的荔枝霜疫病是目前荔枝生产上一种最重要的病害,严重影响荔枝产量和鲜果品质。双组分信号途径在微生物中参与多种生命活动,但是在卵菌中尚未有相关研究。本研究通过生物信息学分析在荔枝霜疫霉中鉴定到2个杂合型组氨酸激酶(PlHK1、PlHK2)和1个响应调控蛋白(PlRR1)。其在卵菌中是保守存在的,并且与真菌在进化上相对独立。功能域分析表明,PlHK1和PlHK2的C端额外的融合了1个磷酸转移功能域(Hpt),这与真菌和植物的存在显著差异。转录分析表明3个基因在荔枝霜疫霉侵染阶段上调表达,并且响应渗透胁迫和氧化胁迫。以上结果揭示了双组分信号系统可能在疫霉致病过程中发挥重要作用。     

荔枝霜疫霉中双组分信号转导系统的鉴定与表达分析

 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)隶属于茸鞭生物界卵菌门疫霉属,由其引起的荔枝霜疫病是目前荔枝生产上一种最重要的病害,严重影响荔枝产量和鲜果品质。双组分信号途径在微生物中参与多种生命活动,但是在卵菌中尚未有相关研究。本研究通过生物信息学分析在荔枝霜疫霉中鉴定到2个杂合型组氨酸激酶(PlHK1、PlHK2)和1个响应调控蛋白(PlRR1)。其在卵菌中是保守存在的,并且与真菌在进化上相对独立。功能域分析表明,PlHK1和PlHK2的C端额外的融合了1个磷酸转移功能域(Hpt),这与真菌和植物的存在显著差异。转录分析表明3个基因在荔枝霜疫霉侵染阶段上调表达,并且响应渗透胁迫和氧化胁迫。以上结果揭示了双组分信号系统可能在疫霉致病过程中发挥重要作用。     

RXLR类效应分子PITG_21645.2的基因序列分析及功能验证

 马铃薯晚疫病黑龙江菌株效应分子PITG_21645.2在本氏烟(Nicotiana benthamiana)上可以抑制由INF1引起的过敏性细胞坏死(Hypersensitive response, HR)。为验证其为致病疫霉致病的重要效应分子,克隆了10个致病疫霉菌株以及3个同属卵菌菌株中的PITG_21645.2同源基因,它们在氨基酸序列上相似度为93%~100%。与INF1共表达的结果显示,仅有PITG_21645.2^MP903丧失了抑制HR的功能。其中PITG_21645.2^MP903的第31位氨基酸存在特异性,编码丝氨酸,其余同源基因在该位点均编码天冬酰胺。PITG_21645.2^MP903回复突变体(S31N)能够恢复该基因抑制INF1引起HR的功能,说明第31位氨基酸是影响抑制功能的关键位点。另外,PITG_21645.2还能抑制BAX、大豆疫霉PsojNIP和效应分子Avh238在本氏烟上激发的HR,而PITG_21645.2^MP903都丧失抑制功能。本氏烟上表达PITG_21645.2能够促进致病疫霉在寄主上的定殖,从而提示PITG_21645.2在致病疫霉的侵染中发挥致病性功能。     

转录因子OsEIL2正调控水稻对纹枯病的抗性

纹枯病(sheath blight)是水稻三大病害之一,对水稻产量和品质造成严重影响。基因芯片数据分析发现,水稻受到纹枯病菌侵染时,与拟南芥EIN3同源的基因OsEIL2表达量显著升高,预示OsEIL2与水稻对纹枯病的抗性反应相关。利用农杆菌介导的方法,构建了OsEIL2-RNAi植株,实时荧光定量RT-PCR分析表明,该基因被特异性沉默,接种结果显示,OsEIL2沉默后,水稻对纹枯病菌感病性增强。通过水稻原生质体和烟草亚细胞定位分析,发现该基因定位于细胞核,酵母单杂交结果表明,该基因具有转录激活活性。在OsEIL2-RNAi植株中,乙烯合成关键酶的编码基因OsACO1表达量下降。综上,OsEIL2是一个与拟南芥EIN3蛋白同源的转录因子,能正调控水稻对纹枯病的抗性。     

蛋白激酶TaPiPK1在小麦抗条锈病反应中的功能分析

由条形柄锈菌小麦专化型Puccinia striiformis f. sp.tritici(Pst)引起的条锈病,长期严重威胁小麦安全生产。Pst通过毒性变异产生新毒性小种或致病类型,能克服生产上已应用的抗病基因,导致抗病品种感病。因此,挖掘抗条锈病基因资源对小麦抗病遗传改良和加快抗病新品种培育具有重要意义。蛋白激酶在应答病原菌侵染,传递植物免疫信号中发挥重要作用。本研究通过小麦转录组数据分析,筛选到参与应答Pst、小麦白粉菌Blumeria graminis f. sp.tritici和赤霉病菌Fusarium graminearum侵染的蛋白激酶基因TaPiPK1。该蛋白激酶基因编码551个氨基酸,C末端含有一个STK激酶结构域。利用RT-qPCR检测发现,TaPiPK1在小麦与条锈菌非亲和互作的前期上调表达;TaPiPK1主要定位于细胞质与细胞膜。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)瞬时沉默TaPiPK1,显著降低小麦‘水源11’对条锈菌非亲和小种CYR23的抗性,表明TaPiPK1参与小麦抗条锈病反应并发挥重要作用。因此,TaPiPK1有可能作为潜在的基...     

番茄抗晚疫病基因Ph-3的分子标记开发及应用

正番茄晚疫病由卵菌疫霉属的致病疫霉菌(Phytophthora infestans)侵染引起。病菌对番茄致病性强,侵染寄主后通过气流散发孢子,多次重复侵染植株,引起晚疫病爆发,对番茄生产造成严重危害[1]。利用抗晚疫病资源,培育番茄抗病品种是降低晚疫病危害的有效途径。在野生番茄中发现     

OsDCL1基因沉默突变体诱导稻瘟病抗性的转录组分析

稻瘟病是严重危害水稻生长的真菌病害,每年给水稻生产带来重大经济损失。与野生型日本晴NPB相比,OsDCL1基因沉默突变体增强了水稻对稻瘟菌的广谱抗病性。为了解水稻OsDCL1-RNAi突变体的抗病机制,我们分析和比较了它和野生型日本晴NPB在稻瘟菌侵染前后转录组水平的变化。响应稻瘟菌侵染的7 129个差异表达基因(DEGs)中,NPB和OsDCL1-RNAi突变体分别有5 382和5 180个基因表达发生了变化,参与生物胁迫反应、信号通路、蛋白代谢和RNA调控4个通路的基因明显被富集。以野生型未受稻瘟菌侵染的基因表达为对照,在OsDCL1-RNAi突变体中共发现1 318个DEGs,且超过70%是上调的,其中很多基因参与了生物胁迫反应(26.9%)和信号通路(11%),上调表达基因中与生物胁迫反应相关的主要为PR基因和细胞壁相关基因。另外,还发现10个茉莉酸相关基因和11个水杨酸相关基因分别在OsDCL1-RNAi突变体中显著下调和上调表达。在OsDCL1-RNAi突变体中还发现WRKY和MYB等一些转录因子家族以及部分受体类激酶被诱导表达。用qRT-PCR方法验证部分差异表达的基因,其结果与DEGs基本一致。OsDCL1-RNAi突变体中转录组变化的分析,为深入了解该突变体抗瘟性增强的机制奠定了基础。     

小麦凝集素类受体激酶TaLecRLK1的鉴定及抗锈病功能分析

凝集素类受体激酶(lectin receptor-like kinase, LecRLKs)是一类在植物应答多种生物/非生物胁迫中发挥重要作用的类受体激酶。本研究在小麦与条锈菌互作的转录组中筛选到1个在小麦与条锈菌非亲和互作中显著上调表达的LecRLKs基因TaLecRLK1。该基因全长2 292 bp,编码蛋白含有1个胞外信号肽、B-lectin结构域、PAN＿AP结构域、跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。qRT-PCR分析表明：TaLecRLK1在小麦与条锈菌非亲和互作早期诱导表达,在烟草及小麦原生质体中瞬时表达,TaLecRLK1-GFP定位在细胞膜上。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)沉默TaLecRLK1,接种无毒性条锈菌小种CYR23后,沉默叶片表面产生少量夏孢子堆,组织学观察发现沉默植株中条锈菌菌丝长度增长、侵染点附近活性氧积累面积减少;TaPR1、TaPR2、TaPR5的表达受到抑制,TaCAT和TaSOD则被迅速诱导表达。综上所述,TaLecRLK1对小麦抗条锈病起到正调控作用。     

乙烯信号传导途径因子OsEIL 6调控水稻抗稻瘟病反应

稻瘟病(rice blast)是水稻生产上最严重的病害之一。抗病相关基因的挖掘对稻瘟病的防治具有重要意义。研究表明植物EIN3/EIL家族基因在抗病过程中发挥着重要作用。本研究采用RNAi技术探究OsEIL6参与的水稻抗稻瘟病反应。稻瘟菌侵染时基因表达谱检测结果表明,OsEIL6在水稻和稻瘟菌非亲和组合中受到诱导表达。稻瘟菌接种结果显示,水稻OsEIL6沉默株系和野生型植株‘TG394’相比抗性下降;实时荧光定量RT-PCR结果分析表明,OsEIL6的表达量下降导致乙烯合成途径中OsACO1和乙烯信号传导途径的OsERF063和OsERF073的转录水平下降。亚细胞定位研究发现该基因定位于水稻细胞质。OsEIL6沉默株系中ROS合成途径标记基因OsrbohA和OsrbohB的表达量均明显下调,表明该基因可能通过影响ROS的合成调控水稻抗稻瘟病反应。本研究结果将有助于进一步揭示OsEIL6参与的乙烯信号传导途径介导的水稻抗稻瘟病反应机制。     

荔枝霜疫霉自噬相关基因的鉴定与表达分析

 细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物中高度保守的胞内物质降解和循环再利用的生理过程,其调控细胞动态平衡、压力适应和细胞程序性死亡,与植物病原真菌生长发育、孢子形成、侵染等一系列过程密切相关。荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)侵染引起的荔枝霜疫病严重危害荔枝生产及采后贮藏。本研究利用模式物种中已知的自噬相关蛋白,采用同源比对的方法在荔枝霜疫霉基因组数据库中鉴定到19个同源蛋白,分属16种蛋白类型。分析基因结构和蛋白保守功能域,发现荔枝霜疫霉自噬相关基因均具有内含子,且数目差异明显;所鉴定候选蛋白都具有相应分组的保守功能域,而PlATG1a在C端具有2个额外的ATG11功能域,PlATG11则在其N端包含1个APG17功能域。进一步对具有核心功能且多成员的自噬相关蛋白ATG1、ATG6、ATG8和ATG18进行系统进化和序列模块分析发现,这些蛋白在不同物种之间十分保守,但是其同源蛋白间存在分化。通过转录组数据分析和qRT-PCR验证结果显示,荔枝霜疫霉中自噬相关基因在生长发育和侵染阶段均有表达,与菌丝阶段相比,PlATG1a、 PlATG2、PlATG3、PlATG6a、PlATG8、PlATG18a基因在游动孢子阶段特异上调表达,其中PlATG8最为显著;PlVPS34在孢子囊阶段特异诱导表达,PlATG1b、PlATG12、PlATG17在孢子囊与游动孢子阶段上调表达但是在侵染阶段下调表达;PlATG6b、PlATG9、PlATG10、PlATG13、PlATG14及PlVPS15基因在生长发育和侵染阶段均表现出不同程度的上调表达,PlATG7、PlATG11、PlATG18b 则在侵染阶段显著下调表达。结果表明,细胞自噬可能参与调控荔枝霜疫霉的生长发育及致病过程。