鸡白痢沙门氏菌感染对雏鸡脾脏miRNA表达谱的影响

【目的】鉴定感染鸡白痢沙门氏菌后雏鸡脾脏差异表达的miRNA，为阐明miRNA在鸡白痢沙门氏菌感染中的调控机制提供理论基础。【方法】采集感染和未感染鸡白痢沙门氏菌的SPF雏鸡脾脏，提取脾脏RNA，构建6个miRNA文库；利用Illumina Hiseq 2500测序技术和生物信息学分析筛选差异表达miRNA，通过TargetScan和miRanda算法预测差异表达miRNA的靶基因，并进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，最后利用RT-qPCR方法验证测序结果。【结果】鉴定到29个差异表达miRNAs，其中15个显著上调、14个显著下调。GO分析表明：脂多糖介导的信号通路正调控以及NIK/NF-κB介导的信号通路负调控等免疫相关生物学过程显著富集；KEGG分析显示：差异表达的miRNA主要参与溶酶体和内吞作用等免疫相关通路。高通量测序结果与RT-qPCR结果一致。【结论】成功鉴定到鸡白痢沙门氏菌感染雏鸡脾脏miRNA表达谱，获得29个鸡白痢沙门氏菌感染潜在相关miRNAs。     

家蚕miR-14的上调表达与靶基因的预测分析

【目的】了解家蚕细胞中上调miRNA的方法及靶基因预测,为家蚕miRNA的功能研究提供方法参考。【方法】构建家蚕miR-14的真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14并在家蚕BmN细胞中表达,同时通过转染化学合成的miRNA mimics上调BmN细胞中miR-14的水平。首先通过PCR扩增miR-14的前体及其侧翼序列（pri-mir-14）并克隆至真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP的EGFP基因下游。分别将重组质粒pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14、对照质粒pSK-hr3-ie1-EGFP、bmo-miR-14 mimics和negative control mimcs转染至家蚕BmN细胞,观察EGFP及FAM在细胞中的荧光情况,以检测其转染效率,qRT-PCR方法检测bmo-miR-14在细胞中的水平。分别采用RNAhybrid和miRanda预测bmo-miR-14的靶基因。【结果】重组表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14与miRNA模拟物bmo-miR-14 mimics都能上调BmN细胞中的miR-14水平,与对照相比分别提高了2.1、984倍。利用生物信息学方法预测bmo-miR-14靶基因,RNAhybrid和miRanda分别预测得到153和171个潜在bmo-miR-14靶基因,其中两者共同预测的靶基因有49个。GO分析结果显示,预测的49个靶基因的分子功能集中于结合和催化;而生物学过程集中于细胞过程和代谢过程。【结论】通过转染重组质粒及化学合成miRNA mimics,使细胞中相应的miRNA上调,可用于bmo-miR-14后续的功能研究。     

猪心肌和骨骼肌miRNA转录组比较分析

【目的】研究microRNA(miRNA)在猪不同类型肌肉生长发育中的作用。【方法】以猪心肌以及2种骨骼肌(背最长肌和腰大肌)为材料,采用Illumina高通量测序技术鉴定其miRNA转录组,并进行差异表达分析和靶基因富集分析。【结果】从猪心肌、背最长肌和腰大肌组织的3个小RNA测序文库中共获得约56M的序列,通过生物信息分析共鉴定出907个非冗余miRNA,其中441个miRNA在3个文库共同表达,123个miRNA在文库间表现为显著的差异表达(P10-6)。对3个文库差异表达miRNA的相关性分析发现,背最长肌与腰大肌的相关性最高(r=0.94),证明2种骨骼肌的表达模式十分相近,而心肌与2种骨骼肌的表达模式不同。通过对各文库高表达的miRNA分析发现,表达量前十的miRNA中有6个miRNA的表达量在心肌中极显著上调。对在心肌内上调的6个miRNA进行的靶基因预测和生物学功能预测发现,这些差异miRNA主要靶向作用于钙信号通路和胰岛素信号通路。荧光定量PCR(qRT-PCR)验证结果表明高通量测序结果准确可靠。【结论】从miRNA层面揭示了猪心肌和骨骼肌的差异,这种差异在一定程度上印证了心肌和骨骼肌之间迥异的生理学特征。     

乙型脑炎病毒感染猪睾丸细胞的miRNA表达谱差异分析

[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8 h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。     

亚洲棉短纤维发育相关长链非编码RNA的鉴定及表达

【目的】长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类无蛋白质编码能力，但参与许多重要生命活动调控过程的长度大于200 nt的RNA。通过对亚洲棉无短纤维突变体（GA0149）和野生型（GA0146）纤维发育早期的转录组数据进行分析，挖掘调控短纤维发育的lncRNA，并明确其调控网络，为进一步解析棉花纤维发育机制奠定基础。【方法】选择GA0146和GA0149 2个材料在开花后当天（0 DPA）及花后3 d(3 DPA)、5 d(5 DPA)和8 d(8 DPA)的胚珠和纤维为材料进行转录组测序。鉴定lncRNA并预测其调控的靶基因；通过mRNA和lncRNA的差异表达分析，比较2个材料在不同纤维发育时期的差异。进一步利用KOBAS软件预测对差异lncRNA的靶基因进行富集分析并预测其参与的生物过程；最后通过实时荧光定量（RT-qPCR）技术对25个差异表达的lncRNA转录组数据进行验证。【结果】共鉴定获得15 339个lncRNA，其中11 595个lncRNA位于基因间区，包括2 428个反义lncRNA、350个内含子lncRNA及966个正...     

梅山猪Ghrelin和Motilin基因克隆、结构分析及组织表达谱

分析克隆梅山猪Ghrelin和M otilin基因全编码序列并分析其核苷酸和氨基酸序列,系统研究它们的组织表达分布;用RT-PCR方法克隆梅山猪M otilin和Ghrelin基因全编码序列,并利用生物信息学和分子生物学技术相结合的方法分析它们的核苷酸和氨基酸序列;采用半定量RT-PCR技术检测梅山猪不同组织M otilin和GhrelinmRNA的相对丰度;显示,梅山猪Ghrelin和M otilin基因具有编码区cDNA单核甘酸多肽性(cSNPs);Gh-relin和M otilin基因呈广泛分布,在所取组织中均有不同程度的Ghrelin和M otilinmRNA表达。     

鸡miR-133a靶向调控BIRC5基因的表达

【目的】研究miR-133a在鸡不同组织中的表达情况,对baculoviral IAP repeat containing 5（BIRC5）进行靶基因的试验验证,探讨鸡miR-133a对BIRC5的靶向调控作用。【方法】采用生物信息学方法对miR-133a靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统及点突变试验对BIRC5进行靶基因验证,同时运用实时荧光定量PCR检测miR-133a在鸡不同组织中的表达量。【结果】在鸡3′UTR数据库的11 891个基因中预测到287个miR-133a的靶基因;miR-133a在鸡的组织表达谱中显示其在肌肉中的表达量较高,尤其是在骨骼肌中表达量最高;报告基因试验显示BIRC5是miR-133a的靶基因,点突变试验证实了miR-133a在BIRC5上结合的靶位点。【结论】miR-133a是与鸡骨骼肌发育高度相关的miRNA,且鸡BIRC5基因是miR-133a的靶基因。     

牦牛Linc24063的克隆鉴定及其与miRNAs 表达水平的相关性分析

【目的】通过对牦牛长链非编码RNA Linc24063进行克隆鉴定,分析其在乳腺组织中与miRNAs表达量的相关性,为Linc24063通过调控miRNA发挥功能的调控机制研究提供试验依据。【方法】选取4.5岁处于第一泌乳期的健康母牦牛12头,清晨空腹屠宰后,迅速采集大脑、乳腺、肾脏、心脏、肝脏和卵巢组织,提取组织总RNA,利用5′ RACE和3′ RACE方法克隆牦牛Linc24063序列;利用生物信息学对其序列保守性、染色体定位及编码潜能进行分析,然后利用原核表达试验对其编码能力进行验证;利用RT-qPCR检测其在大脑、乳腺、肾脏、心脏、肝脏和卵巢的表达水平。利用普通牛和绵羊的miRNA数据库,结合miRanda和mireap软件预测与Linc24063具有相互作用的物种间保守miRNAs,与前人研究表明在牛不同泌乳时期乳腺组织中具有差异表达的miRNA取交集,然后对其靶基因进行GO富集和KEGG信号通路分析;最后使用皮尔逊相关系数在乳腺组织中进行Linc24063与miRNAs表达量的相关性分析。【结果】Linc24063 5′RACE和3′RACE片段大小分别为476 bp和356 bp,测序分析表明Linc24063大小为758 bp,位于牦牛21号染色体的Dlk1-Dio3印记域,与普通牛的序列保守性最高。生物信息学预测其编码潜能较低,原核表达试验进一步验证Linc24063不能有效的翻译蛋白,表明Linc24063是一个真正的长链非编码lncRNA。组织表达谱分析表明,Linc24063在牦牛乳腺组织中表达量最高,在肝脏和卵巢中表达量较低。生物信息学分析后共筛选到与Linc24063具有相互作用的物种间保守miRNAs 21个,其中有研究报道在乳腺中有差异表达的13个;13个miRNAs靶基因富集到TGF-β、PI3K-Akt、胰岛素等信号通路中,表明Linc24063可能通过这些信号通路参与牦牛乳脂和乳蛋白的生物合成过程。在乳腺组织中,Linc24063表达水平与miR-200a（P=0.001）、miR-141（P=0.02）显著负相关,与miR-27a（P=0.023）显著正相关,与miR-24（P=0.601）不具备相关性。【结论】Linc24063位于Dlk1-Dio3印记域内,在乳腺组织中具有较高表达量,且可能通过与miR-200a、miR-141和miR-27a相互作用从而参与牦牛乳脂和乳蛋白的生物合成过程。为深入探讨牦牛Linc24063在乳脂和乳蛋白合成中的生物学功能提供了基础数据。     

山羊卵巢富集chi-miR-100f-5p的鉴定与表达分析

【目的】探讨山羊卵巢中富集的miR-100及预测的靶基因与山羊卵巢功能及卵泡发育的潜在关系,为山羊繁殖机理研究提供数据。【方法】 以山羊卵巢组织为材料,通过miRNA的分离、克隆及测序得到山羊卵巢中表达的miR-100,采用RT-qPCR进行表达检测,用生物信息学方法预测miR-100的靶基因及其功能。【结果】① 山羊卵巢的测序结果中,一段成熟体为21nt 的序列与果蝇dan-miR-100高度同源,将其命名为chi-miR-100f-5p,其前体位于基因组负（-）链上,长度为59 bp,定位于山羊CM000899.1:33 997 894—33 997 914序列;② chi-miR-100f-5p 在山羊卵巢、垂体及心脏等组织中均有表达,说明此miRNA不是卵巢组织所特有;心脏和垂体组织中均有较高表达,其次是卵巢,而在肝脏、脾脏、肺及肾脏中表达显著低于卵巢（P ＜0.01）;在单产羔内蒙古绒山羊卵巢中chi-miR-100f-5p的表达极显著高于高繁殖力大足黑山羊卵巢（P＜0.01）;③ chi-miR-100f-5p主要靶作用于整合蛋白β1亚基基因及垂体特异性转录因子1基因,可能参与整合蛋白信号通路,促进垂体内分泌细胞的生长与分化,调节下丘脑-垂体-性腺轴激素分泌。【结论】山羊卵巢中新发现的chi-miR-100f-5p 可能是与繁殖调控有关的重要候选miRNAs 之一。     

猪卵泡闭锁过程中circINHBB的鉴定及其对颗粒细胞凋亡的影响

【背景】卵泡的发育状况和成熟排卵数量是哺乳动物的繁殖力和生产性能的重要决定因素。卵泡闭锁是卵泡停止发育并发生退化的过程,可能发生在卵泡发育的各个阶段,而闭锁的发生与卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡情况密切相关,而颗粒细胞的凋亡过程十分复杂并且受到各种细胞因子的调控作用。环状RNA（circRNA）是近年来在生物体内发现的一种环状结构非编码RNAs（ncRNAs）。研究证明circRNA普遍存在于各个组织且参与到各种生理过程的调节中,但其在家畜繁殖学领域,尤其是猪卵巢和卵泡中的表达变化、位置分布和生物学功能研究较少。抑制素（INH）是一种性腺糖蛋白激素,主要由雌性动物卵巢卵泡的颗粒细胞产生,是控制哺乳动物排卵的重要因子。前期实验发现,猪卵泡中INHβ亚基INHBB编码基因的mRNA的前体可能形成一个circRNA,即circINHBB。【目的】在猪中等有腔卵泡组织中验证circINHBB的序列结构及其在颗粒细胞中的分布情况;分析其在健康、闭锁卵泡中的表达差异;在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中探索了circINHBB对细胞凋亡的调控作用,并对circINHBB可能介导的功能性miRNA做出预测,为家畜繁殖领域的circRNAs研究扩宽思路,为提高家畜繁殖力研究提供参考。【方法】采集中等大小猪卵泡,进行RNA提取及反转录获得猪卵泡的cDNA,利用反向引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经Sanger测序证明circINHBB的序列和环状结构;设计circINHBB的特异性荧光探针,运用FISH实验验证circINHBB在猪卵泡颗粒细胞核、质中的分布情况;然后,通过外观、激素和颗粒细胞密度指标选取健康和闭锁两组,用qRT-PCR检测circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的表达差异;最后,设计circINHBB的特异性siRNA（si-circINHBB）,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,转染si-circINHBB及其对照,利用流式细胞术检测circINHBB对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用,预测circRNA可能参与的miRNA调节。【结果】PCR及Sanger测序验证了circINHBB在猪卵泡中的特异性存在,且证实了circINHBB是由INHBB编码基因的mRNA的前体经反向可变剪切形成的环状结构RNA;FISH实验进一步验证了circINHBB在猪卵泡颗粒细胞的细胞质中分布;qRT-PCR结果证实,与猪健康卵泡相比,circINHBB的表达量在猪闭锁卵泡中显著降低;流式细胞术检测结果表明当敲减circINHBB后,猪卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著上升,说明circINHBB对猪卵泡颗粒细胞的凋亡有显著的抑制作用;生物信息学分析表明,circINHBB可能与10个已知miRNA相互作用,通过TGF-β、Notch等信号通路参与调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁过程。【结论】在猪卵泡中验证了circINHBB的环状结构及胞质中的特异性表达分布,证实了其在闭锁卵泡中表达量低于健康卵泡,通过体外实验证实了circINHBB是细胞凋亡的抑制因子,可能通过吸附相关miRNA参与调节卵泡的发育和闭锁过程。     

毛竹Ph-TElncRNA1的鉴定及对靶基因的调控

【目的】旨在探究毛竹Phyllostachys edulis Ph-TElncRNA1及靶基因的表达模式,初步分析lncRNA的功能。【方法】基于高温、低温、紫外、高盐胁迫处理毛竹实生苗全转录组测序数据,筛选在胁迫下差异表达的lncRNA。通过CNCI、Pfam、CPC2、PLEK等4个软件对lncRNA的编码特性进行分析,用LncRNATar软件鉴定lncRNA的靶基因,通过实时荧光定量PCR分析lncRNA和靶基因在紫外胁迫下和叶片着色过程中的表达模式。【结果】筛选到1个在紫外胁迫下差异表达的lncRNA,此lncRNA来源于LARD转座子序列(large retrotransposons derivatives),命名为PhTElncRNA1 (Phyllostachys edulis transposable element derived lncRNA1)。Ph-TElncRNA1是一个典型的非编码RNA,全长为342 bp,其中,185个碱基来源于外显子,157个碱基来源于内含子。Ph-TElncRNA1的靶基因为psbA,编码photosystemⅡprotein D1。...     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌flic基因的克隆表达及生物信息学分析

【目的】构建猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actionobacillus pleuropneumoniae,App)鞭毛蛋白(flic)编码基因的重组表达质粒,对其编码蛋白进行生物信息学分析,并将其在原核细胞中进行表达。【方法】利用PCR方法扩增flic基因片段,将其克隆至pMD-18T载体后测序,利用生物信息学软件对其编码蛋白的二级结构及跨膜区进行预测。构建重组表达质粒pGEX-flic,转化大肠杆菌工程菌BL21,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE及Western-blo对表达蛋白进行鉴定。【结果】获得的目的基因片段长度为528 bp,测序表明其序列与GenBank公布的一致;软件预测结果显示,该蛋白具有多个明显的二级结构成分及跨膜区;SDS-PAGE检测表明,在约50 ku处有一特异性条带;Western-blot检测表明,表达蛋白具有良好的抗原活性。【结论】成功获得了App的flic基因,其编码的蛋白质具有较多的α螺旋区和无规则卷曲区域,表达的鞭毛蛋白具有生物学活性。     

大尾寒羊和小尾寒羊尾部脂肪lncRNA差异表达分析

【目的】通过识别影响绵羊尾部脂肪沉积的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA),深入研究lncRNA参与绵羊尾部脂肪沉积的规律。【方法】采集大尾寒羊和小尾寒羊2个品种各3只公羊的尾部脂肪组织样本，通过Illumina NextSeq500高通量测序技术对样本RNA进行转录组测序，对所获得的reads进行lncRNA分析，筛选出差异表达lncRNA,通过GO和KEGG富集分析挖掘lncRNA靶基因参与的生物学过程和代谢途径。【结果】研究共筛选获得22个差异表达的lncRNA,对其进行靶基因预测，获得20个顺式靶基因。通过对靶基因功能分析，检测到包括调控血管生成、细胞迁移、胰岛素反应和MAPK级联反应正调控的4条生物学过程，以及胞外区、细胞外间隙的2条细胞组分。KEGG富集分析筛选到20个靶基因参与脂肪细胞因子信号通路、进入脂质代谢、代谢途径、AMPK信号通路和磷脂酶D信号通路等19条信号通路。【结论】本研究鉴定了影响绵羊尾部脂肪沉积的差异表达lncRNA及其靶基因，为进一步研究绵羊尾部脂肪沉积过程的作用机理奠定基础。     

育成期高能饲喂下开产与未开产蛋鸡肝脏miRNA表达谱差异分析

【目的】对育成期高能饲喂下开产与未开产蛋鸡的肝脏进行miRNA高通量测序分析,探明高能饮食状态下蛋鸡肝脏中影响其开产的miRNA,为提高产蛋性能打下基础。【方法】以代谢能水平为12.14 MJ/kg的高能饲粮饲喂育成期蛋鸡,通过Illumina NextSeq500高通量测序平台对开产与未开产蛋鸡肝脏进行small RNA测序,使用DESeq分析miRNA表达量,并以实时荧光定量PCR进行验证;采用miRanda对差异表达miRNA进行靶基因和靶位点预测,同时以超几何分布对差异表达的靶基因进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析。【结果】 6个样本（3个开产蛋鸡样本,3个未开产蛋鸡样本）能注释到的miRNA均超过300个,约占miRBase中已鉴定鸡miRNA的30.00%,且前体鉴定结果显示各样本注释到的miRNA有部分定位在同一前体上。与未开产组样本相比,开产组样本有9个miRNA表达上调、3个miRNA表达下调。其中,gga-miR-132c-5p、gga-miR-132b-5p、gga-miR-2184a-5p、gga-miR-132c-3p、gga-miR-132b-3p及gga-miR-2184a-3p属于同一miRNA基因簇,且gga-miR-1682、gga-miR-132b-3p和gga-miR-2184a-3p等3个上调miRNA在未开产蛋鸡样本中不表达。通过miRanda共预测得到129个差异表达潜在靶基因,以miR-203a预测得到的靶基因最多,为32个;其次是gga-miR-2184a-5p、gga-miR-148a-5p和gga-miR-12211-5p,分别预测到30、25和23个靶基因;而miR-132c-5p预测得到的靶基因最少,仅为9个。129个靶基因显著注释到8条GO功能条目上,生物学过程（Biological process）主要注释到脂质代谢过程、细胞脂质代谢过程、脂质生物合成过程、磷脂生物合成过程、磷脂代谢过程、甘油磷脂生物合成过程和解剖学结构发育,分子功能（Molecular funcion）仅注释到1条GO功能条目,即利钠肽受体活性,未发现涉及细胞组分（Cellular component）的GO功能条目;在注释到的8条GO功能条目中有6条与脂质代谢相关,涉及的靶基因有22个,占总潜在靶基因的17.10%。KEGG信号通路富集分析结果显示共显著富集到7条KEGG信号通路,其中脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、酮体合成与降解及PPAR信号通路等4条信号通路与脂质代谢相关。【结论】育成期高能饲喂下开产与未开产蛋鸡中共存在12个差异表达miRNA,涉及129个差异表达潜在靶基因,且主要富集在肝脏脂质代谢相关过程和信号通路,说明miRNA是通过调控脂质代谢及其相关基因表达而影响蛋鸡开产。     

蜜蜂球囊菌中长链非编码RNA的调控作用

【目的】长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类二、三级结构高度保守,长度>200 nt且不具蛋白编码能力的RNA,在转录和转录后水平广泛参与调控剂量补偿、细胞分化和生长发育等生命活动。本研究基于前期获得的蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）菌丝和孢子混合样品的高质量lncRNA组学数据进行球囊菌lncRNA的顺式（cis）作用、反义lncRNA（antisense lncRNA）作用和竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）作用的分析和探讨,以期揭示lncRNA在球囊菌中的潜在功能。【方法】基于lncRNA基因在染色体上的位置,预测lncRNA上下游100 kb以内的蛋白编码基因;使用Blast软件将上下游基因比对到GO和KEGG数据库,以获得功能和通路注释。利用LncTar软件对反义lncRNA的靶mRNA进行预测,并使用Blast软件将上述靶mRNA比对到KEGG和eggNOG数据库。利用TargetFinder软件预测lncRNA靶向结合的miRNA及miRNA靶向结合的mRNA,根据靶向结合关系建立lncRNA-miRNA和lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进而通过Cytoscape v3.7.1软件进行调控网络的可视化。利用RT-PCR对调控网络中的lncRNA、靶miRNA和靶mRNA进行表达验证。【结果】共预测出371个lncRNA的5 852个上下游基因,可注释到细胞进程、代谢进程和应激反应等48个功能条目,以及新陈代谢途径、次生代谢产物的生物合成和抗生素的生物合成等121条通路,表明部分lncRNA可通过顺式作用调节上下游基因的表达,从而参与调控球囊菌的生长发育及物质能量代谢等基础生命活动。球囊菌的7个lncRNA与7个靶mRNA存在序列互补关系,其中5个mRNA在eggNOG数据库中仅注释为假定蛋白,仅gene3444在KEGG数据库注释为核孔复合体蛋白An-Nup120和假定蛋白,表明上述1个反义lncRNA可能参与调控核孔复合体蛋白的生物合成等生物学过程。此外,共预测出227个lncRNA与73个miRNA之间存在靶向结合关系,其中多数lncRNA(79.02%)仅能结合1—2个miRNA,部分miRNA可被多个lncRNA靶向结合;进一步构建氧化磷酸化通路和MAPK信号通路相关的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,分析结果显示氧化磷酸化通路相关的222个lncRNA靶向78个miRNA及50个mRNA,MAPK信号通路相关的222个lncRNA靶向76个miRNA及46个mRNA,表明部分lncRNA通过ceRNA作用调控此两条通路,从而影响球囊菌的能量合成、环境适应以及生长发育等过程。【结论】部分lncRNA可能通过顺式作用和ceRNA作用调节球囊菌的生长发育、物质能量代谢以及环境适应等生物学过程;MSTRG.5393.1可能作为反义lncRNA调控球囊菌的核孔复合体的蛋白合成。     

猪miR-192/-215的组织表达谱及其关键靶基因分析

【目的】在前期通过Illumina Solexa高通量测序技术并结合荧光定量验证筛选出断奶仔猪E.coli F18菌株感染下表达量极显著上调的microRNAs-miR-192和miR-215的基础上,为了解miR-192和miR-215的组织表达情况,进一步筛选确定miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染的关键靶基因,为探讨miR-192和miR-215调控断奶仔猪E.coli F18感染的分子调控机制奠定基础。【方法】试验采用Real-time PCR方法检测miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪各个组织中的分布情况,同时利用MEGA 5.0分析了其保守性,TargetScan预测miR-192和miR-215的靶基因,并对靶基因分别进行Gene Ontology和Pathway通路的富集分析,进一步利用DAVID对靶基因蛋白进行功能分类,最后将预测的靶基因与课题组前期筛选出的断奶仔猪E.coli F18感染抗性相关的调控基因取交集。【结果】miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪十二指肠和空肠中均高度表达,二者成熟序列在脊椎动物中高度保守。miR-192和miR-215对应的靶基因相同,具有156个靶基因,只在轴突导向通路（axon guidance pathway）显著富集（P-value < 0.05）以及25个GO功能中显著富集（P-value < 0.05）。靶基因蛋白按功能分为12类,其中信号转导功能的磷蛋白（phosphoprotein）和DNA结合蛋白（dna-binding）占主要部分。靶基因与前期筛选的E.coli F18感染抗性相关的调控基因（GEO登录号：GSE26854）取交集,发现DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3 等5个基因为miR-192和miR-215的重要靶基因,其中DLG5为维持小肠上皮细胞结构完整性的重要因子。【结论】miR-192与miR-215是参与维持断奶仔猪肠道正常功能与抗F18大肠杆菌感染的重要因子,DLG5可能是miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染中关键的靶基因,今后需要进一步验证其能否作为梅山猪抗F18大肠杆菌的有效遗传标记。     

陆川猪ACOX1基因不同亚型克隆及其表达差异分析

【目的】克隆陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1(Acyl-CoA oxidase 1,ACOX1)基因不同亚型,进行生物信息学分析,并分析ACOX1基因及其亚型在不同品种猪背最长肌中的表达情况,为研究ACOX1基因在陆川猪机体内的功能作用提供参考依据。【方法】根据GenBank中ACOX1基因序列（NM＿001101028.1）及所克隆获得陆川猪ACOX1基因编码区（CDS）序列,设计特异性扩增和验证引物,采用TRIzol法提取0月龄陆川猪肝脏及8月龄陆川猪、杜洛克猪、杜陆猪和陆杜猪背最长肌的总RNA,反转录合成cDNA,以0月龄陆川猪肝脏cDNA为模板进行克隆和验证,获得陆川猪ACOX1基因不同亚型序列,并利用在线工具进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测ACOX1基因不同亚型在背最长肌组织中的表达情况。【结果】陆川猪ACOX1基因存在2种亚型结构（ACOX1-Ⅰ和ACOX1-Ⅱ）,NCBI登录号分别为OQ701687和OQ701688;2种亚型CDS长度均为1986 bp,共编码661个氨基酸残基,2种异构体主要是第270～429位氨基酸进行选择性剪切,陆川猪ACOX1-Ⅰ型编码蛋白...     

miR-221-3p靶向BCL2L11调控小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡

【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡,同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗,文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响,为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上,获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p,利用半定量和组织荧光定量（RT-qPCR）分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况;通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况;构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体,在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照,采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系;在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达,使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响;同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织;RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和 BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达,miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期,而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期,表现出负调控的现象;双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性（P<0.05）,阴性对照组则没有显著影响;过表达miR-221-3p,靶基因BCL2L11 mRNA表达水平显著降低,同时,卵泡颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas的表达量也显著降低（P<0.05）;EdU试验分析显示,过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%,极显著高于阴性对照组的10.43%（P<0.01）。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件,BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一,miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡,该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。     

基于芯片筛选螺原体感染中华绒螯蟹血细胞的免疫microRNAs

为筛选分析螺原体(Spiroplasma eriocheiris)感染中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血细胞免疫相关microRNAs(miRNA)及其差异表达情况,利用微流体芯片技术,对正常和感染螺原体的中华绒螯蟹血细胞miRNA进行系统的鉴定与表达检测;结合生物信息学方法,分析其靶基因和免疫信号通路。利用前期研究和已有报道897条成熟miRNA作为探针订制单色芯片,使用Cy3染料标记,通过与中华绒螯蟹血细胞总RNA样本杂交,鉴定miRNA,检测其表达情况;对差异表达的miRNA进行靶基因预测、功能聚类和通路分析;随机挑选部分差异表达的miRNA进行茎环RT-qPCR验证。结果显示,总共鉴定出中华绒螯蟹血细胞miRNA共303个;健康组和试验组共表达miRNA有48个;差异表达miRNA为27个,其靶基因共注释到116个GO和63个KEGG通路;通过茎环RT-qPCR检测,结果与芯片基本一致。研究发现,差异表达miRNA靶基因,许多均存在于重要免疫信号通路之中,研究结果可为进一步分析中华绒螯蟹血细胞螺原体感染中的miRNA与其靶基因间的免疫调控机制提供借鉴。