cDNA文库构建策略及其分析研究进展

 cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，它是目前发现新基因和研 究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。经典 cDNA文库存在克隆的片段短等缺点，而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息，从而克隆cDNA全长；对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库，可以增加克隆低丰度mRNA的机会；差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义；改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主，介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。     

利用体外特异位点重组反应构建黄瓜灰霉菌cDNA文库

体外特异位点重组技术应用于cDNA文库的构建,克服了传统文库构建方法中的常见问题。本研究利用这一技术,以能够分离得到植物激活蛋白的黄瓜灰霉菌(B.cinerea)菌株为材料,用TRIZOL试剂提取总RNA,从中分离纯化出mRNA,用预先接有attB2位点的Oligo(dT)引物和SuperScriptTMⅡ反转录酶合成cDNA,双链cDNA与attB1接头连接,经重组、转化后构建了其cDNA文库。文库滴度为2.3×106pfu/mL,文库总容量达2.53×107。随机挑取24个克隆,经酶切检测,平均插入片断为1466bp,重组率达100%。     

Gateway技术构建酵母双杂分析用辣椒cDNA文库

构建cDNA文库是利用酵母双杂交技术开展特定cDNA分离的重要基础工作.利用Gateway技术,在成功提取辣椒总RNA并分离mRNA的基础上,合成了3种读码框的双链cDNA,通过BP反应构建其相应的入门文库,再通过LR反应将cDNA迅速且定向地重组到酵母双杂分析用目的载体pDESTTM22上,构建成高质量目的文库.经检测入门文库和目的文库滴度均达到(4.0～5.0)×106 cfu/ mL,文库总容量为(2.4～3.0)×107 cfu,平均插入片段大小为1 250 bp,其质量完全满足于进一步利用酵母双杂体系分析目的基因互作蛋白cDNA.     

利用SMART技术构建蓝狐脾脏cDNA文库

用Trizol试剂提取蓝狐脾脏总RNA.用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建全长cDNA文库.经测定,原始文库滴度达到3.0×106Pf/mL,文库的重组率达到了90%,通过随机PCR检测,扩增出的片断主要集中在0.6～1.8kb,平均插入片段长度约 为1.2 kb.这些数据表明,已获得高质量的蓝狐脾脏cDNA文库.构建的蓝狐脾脏的cDNA文库为进一步筛选、克隆脾脏特异表达基因奠定了基础.     

盐胁迫下大麦酵母双杂交文库的构建与鉴定

为研究盐胁迫下大麦耐盐相关蛋白的互作蛋白,利用Gateway技术构建盐胁迫下大麦的酵母双杂交文库。首先提取受盐胁迫的大麦总RNA,分离mRNA并合成双链cDNA,并通过位点特异重组系统(BP重组)将双链cDNA转入pDONR22载体,构建初级文库。然后,将初级文库质粒通过同源重组转入pGADT7-DEST载体,构建次级文库。最后,将次级文库质粒转入酵母菌株Y187中构建酵母双杂交文库。经鉴定,该酵母双杂交文库的滴度为7.0×10~7 CFU/mL,插入cDNA片段平均长度大于1 000 bp,重组率大于95.8%。所构建的酵母双杂交文库质量较高,可用于后续的互作蛋白筛选工作。     

新疆雪莲全长cDNA文库构建及表达序列标签(ESTs)特性分析

以野生新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kit)为研究材料,利用Creator SMARTTM cDNA Library Construction技术构建了雪莲全长cDNA文库,从野生雪莲中提取总RNA和mRNA , 用分离到的微量mRNA合成cDNA第1链.通过长距离PCR扩增得到足够量的双链cDNA .将SfiⅠ酶切后并纯化的cDNA片段连接到经SfiⅠ酶切的噬菌体λTripIEX2上, 并对噬菌体进行包装,建成cDNA的全长库.经大肠杆菌XL1-Blue平板检测,原始文库滴度达4.03×107(pfu/mL).随机挑选500个克隆进行序列测定,PCR鉴定结果显示多数插入片段均在500 bp以上.将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较,共有56个序列为非冗余数据.其中有14个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性,42个片段与已报道的基因有较高的同源性.这些EST数据为进一步筛选和克隆雪莲特异性表达基因提供了材料平台,为雪莲基因组数据增补了大量信息.     

紫外线照射辣椒叶片cDNA文库构建及部分防御信号基因cDNA的检测

对抗病的朝天椒地方品种,以紫外线(UV)处理叶片并提取叶片总RNA,采用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了一个cDNA文库.该文库含有2.6×106个独立的噬菌斑克隆,扩增后滴度达到1.5×109pfu.μL-1,随机挑取的噬菌斑PCR检测发现重组率达90.0%.在搜索、拼接与植物WRKY、bZIP、AP2和E2等重要调节基因同源的辣椒表达序列标签(ESTs),获得重叠群的基础上,分别设计上述基因ESTs重叠群特异性引物,以cDNA文库为模板进行PCR扩增.结果表明,部分上述基因cDNA存在于文库中.因此,本研究所构建的文库可用于进一步分离响应UV的重要调节基因cDNA的分离.     

山羊卵巢颗粒细胞差异表达基因消减文库的建立

为了从单卵泡水平建立非闭锁大小卵泡颗粒细胞基因表达的消减文库,选择繁殖性能正常、空怀高繁殖力黄淮山羊2只,以氯前列烯醇处理40h后取卵巢,计数卵泡并测量卵泡直径,钝性分离采集卵泡颗粒细胞,置于液氮内保存,取样后的卵泡部分组织采用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行闭锁鉴定。选择直径6和4mm非闭锁卵泡,提取颗粒细胞mRNA,扩增cDNA,监测抑制消减杂交及其文库构建的试验环节。结果表明:消减文库的阳性克隆测序成功率100%,从正向文库中随机挑取96个克隆进行差异表达的筛选,发现12个全新表达序列标签;应用RT-PCR对已知序列的抑制素βA亚基基因(INHBA)和谷胱甘肽S-转移酶A1基因(GSTA1)进行表达水平测定,证实了颗粒细胞2个基因mRNA的表达模式与差异显示的结果相同。表明消减文库构建成功。     

盐胁迫下小麦耐盐突变体后代差异cDNA的分离和鉴定

 采用cDNA AFLP(cDNA amplifiedfragmentlengthpolymorphism)技术分析了遗传背景相近的小麦后代突变体中 ,耐盐性较强的RH870 6 4 9(saltresistant,SR)和盐敏感的H870 6 34(saltsensitive ,SS)在盐胁迫和非胁迫情况下基因表达的差异。结果表明 ,其中 88.1%的条带在 4个样品中是一致的 ,只有 11.9%的条带在 4个样品中表现出差异。选取其中的 6 8个差异条带进行克隆 ,测序 35个 ,经Internet进行Blast比较 ,发现 11个片段 (31.4 % )与已知基因具有较高的同源性 ,主要涉及与离子转运有关的蛋白、与信号转导有关的蛋白以及与氧化胁迫有关的蛋白 ;另外2 4个片段 (6 8.6 % )与已知基因同源性较低或未发现同源性 ,可能是一些未知基因。     

应用抑制消减杂交技术克隆鼻咽癌转移调控基因

目的：分离并鉴定高低转移表型不同的人鼻咽癌细胞株差异表达cDNA序列,了解鼻咽癌转移抑制基因或具有抑制活性的核苷酸序列。方法：以具有高低转移潜能不同的人鼻咽癌细胞株为研究对象,应用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）和T／A克隆法构建差异表达cDNA消减文库,对差异表达的cDNA进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建人鼻咽癌细胞克隆株差异表达cDNA消减文库,从随机测序10个克隆中获得6个在低转移鼻咽癌细胞株中高表达cDNA序列,它们都与已知的人类基因片段具有高度同源性。结论：应用抑制消减杂交技术,从一对具有高低转移表型差异的鼻咽癌细胞株中获得6条可能与肿瘤转移抑制相关的cDNA序列,它们可能在维持肿瘤细胞的稳定和抑制肿瘤转移中起重要作用。     

Differential Gene Expression in Response to Drought Stress in Maize Seedling

To provide the useful information for the choice of molecular marker used in marker-assisted selection of drought tolerance, it is necessary to find out more candidate genes and fulfill the information gaps in gene expression regulation under drought stress. In this study, we isolated four differentially expressed cDNA fragments from leaves of a droughttolerant inbred line by suppression subtractive hybridization and reverse Northern hybridization, and validated their differential expression patterns among six inbred lines with different drought tolerance in response to drought stress by quantitative real-time PCR. Sequence similarity analysis indicated that two of four differentially expressed cDNA showed homology to gene DegP encoding trypsin-like serine protease, and gene PGAM-i encoding cofactor-independent phosphoglyceromutase, respectively. Expressions of the genes corresponding to four cDNA fragments was decreased at 6 h after drought stress treatment in most of the six inbred lines, and then returned to the control level with further stress in three of the tolerant inbred lines. The expression of the gene PGAM-i and the genes corresponding to fragments E4 and F4 were increased to a high level in tolerant inbred line 81565. In the two drought-sensitive inbred lines （Dan340 and ES40）, the expression of these genes was still down-regulated. The probable mechanisms of these genes in response to drought stress were discussed. These results indicated that the drought-tolerant inbred lines upregulated the expression of the drought-tolerant candidate genes, in contrast, drought-sensitive inbred lines downregulated the expression of the genes.     

番鸭就巢性状相关基因表达的cDNA-AFLP分析

【目的】寻找与番鸭就巢性状相关的表达基因,了解其就巢调控的分子机理。【方法】采用cDNA-AFLP (cDNA-amplified fragment length polymorphism)技术分析遗传背景相近的RF系白羽番鸭就巢个体和非就巢个体脑垂体基因表达差异。【结果】筛选到与就巢行为相关差异表达片段82条,选取其中15条进行测序。将测序结果在GenBank数据库进行BLAST比较和分析,发现 8个片段(53.3%)与已知基因具有较高同源性,涉及与繁殖性能紧密相关的下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)上的功能基因,如GnRH基因、FSH基因,同时也分离到位于GH／IGF轴上的功能基因,即GH基因;以及在功能上属于信号传导、转录调控、代谢的调节基因,如超氧化物歧化酶基因、角蛋白关联蛋白基因、硫氰酸酶释放硫基转移酶基因等。2个片段与未知功能的基因有同源性,5个与数据库中现有的基因没有明显的相似性。随机选择3个片段进行RT-PCR验证,检测片段的表达模式与cDNA-AFLP结果一致。【结论】揭示番鸭不同就巢性状基因表达调控模式,进一步阐明番鸭就巢的分子机理。     

Isolation and Characterization of the Wheat cDNA Fragments Involved in salt Stress

cDNA-AFLP(amplified fragment length polymorphism) is used to isolate genes differentially expressed in salt-stressed and unstressed wheat lines RH8706-49 and H8706-34 derived from a single seed,representing a salt-stress resistant (SR) and salt-stress sensitive(SS) line,respectively.About 88.1% cDNA fragment are expressed in all the four samples,11.9% are different between the samples.68 cDNA fragments were cloned,of which 35 were subject to sequence analysis.Database searches indicate that 11 cDNA fragment show high homology to known genes,which mainly include proteins related to ion transport,signal transduction and oxidative stress.The remaining 24 cDNA show no detectable homology to known genes,suggesting that they probably represent novel genes.     

抑制性消减杂交方法克隆棉属突变材料腺体发育相关的cDNAs

该文采用抑制性消减杂交方法 (SSH)构建了棉属突变材料“湘棉 18”种子萌发过程中腺体发育形成前后的两个不同时期的SSH差减文库 .通过差示筛选及反式Northern检测 ,获得了色素腺体形成时期特异表达或优势表达的cDNA片段 .结果表明 ,这些cDNA所涉及的基因 ,多数是棉属中新发现的 ,它们与发育调控、细胞凋亡、蛋白质合成等密切相关 .     

冀228纤维均一化全长cDNA文库的构建与鉴定分析

【目的】构建优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,降低纤维中存在的高峰度基因的拷贝数,提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。【方法】以优质陆地棉冀228开花后8-40 d纤维为材料,将纤维全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了棉花纤维的非剪切型全长cDNA原始文库。利用均一化技术获得均一化全长cDNA文库,进而测序获得大量的EST序列。采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接、比对、COG功能注释和GO注释。【结果】构建了优质陆地棉冀228纤维均一化全长cDNA文库,该文库初级文库库容为1.06×10⁷,初级文库的滴度为3.56×10⁶ cfu·mL^-1,平均片段长度为1.2 kb。qRT-PCR检测均一化程度结果表明,棉花2个高峰度表达基因在该文库中的表达量均下降了1 000倍。随机选取2 384个克隆进行单向测序,获得2 169条高质量的表达标签（EST）,拼接成1 745个单一基因（Unigene）;同源比对分析表明,70%的Unigenes与已知功能基因具有较高的同源性。基因进行COG功能分类结果显示,较多的COG功能分类集中在“翻译、核糖体结构和生物转化”、“碳水化合物运输与代谢”和“翻译后修饰、蛋白转移及蛋白伴侣”功能上。根据基因的GO注释结果,参与细胞构成、细胞器和膜构成的基因比例最高,参与细胞过程和新陈代谢等过程的基因比例较高,具有结合和催化功能的基因较多,这些基因可能在棉纤维发育中发挥比较重要的作用。【结论】构建了优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,经文库质量检测、均一化程度检测和随机选取克隆的测序分析结果表明,文库的代表性和重组片段的完整性均达到了分离筛选目的基因的建库要求,整个文库有着很高的非冗余性。构建的cDNA文库具有既能获得与已知序列同源性很高的基因,又能挖掘出优质陆地棉冀228特有的基因或同源序列的作用,能够提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,将为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。     

棉花银染mRNA差异显示分析体系的建立及优化

mRNA差异显示(mRNA differential display)技术是筛选差异表达基因的有效方法。本研究优化了棉花mRNA的银染差异显示体系,以陆地棉苏棉12为材料,分别提取叶片和开花期后10 d左右的纤维中的总RNA,利用差显技术筛选出了在棉花纤维中差异表达的cDNA片段。     

飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析

 【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。     

应用抑制差减杂交法分离粗枝大叶黄杨幼苗的冷诱导表达基因

 应用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建冷诱导表达的正向抑制差减cDNA文库，低温处理的幼苗为tester，常温处理为driver，通过cDNA宏阵列差异筛选cDNA文库，得到604个低温诱导或表达增强的候选克隆，对其中的84克隆进行DNA测序，去除冗余的cDNA，在GenBank中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析，共有36个单一序列，有 12 个cDNA未找到同源序列，可能为新基因，表明采用抑制差减杂交方法与cDNA宏阵列技术分离诱导表达的基因是可行的。