鹅α和γ干扰素基因的克隆及序列分析

从植物血凝素(PHA)刺激的鹅外周血白细胞提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增鹅IFN基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列分析.克隆到的鹅IFN-α和IFN-γ基因与GeneBank上已公布的鸭IFN核苷酸序列进行比较,其同源性分别为IFN-α96.70%、IFN-γ94.95%;氨基酸序列同源性分别为IFN-α93.72%、IFN-γ93.29%.这为进一步研究鹅干扰素的生物学特性和应用奠定了基础.     

成华猪γ-干扰素基因分子克隆与序列分析

为研究猪γ—干扰素在抗御传染性疾病和肿瘤生物治疗中的免疫增强作用，本实验以ConA刺激成华猪外周血淋巴细胞提取激活淋细胞的mRNA，设计合成特异的引物序列，应用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增和克隆成华猪IFN—γ基因并进行序列5ll定。成华猪IFN—γcDNA约长500bp，从第68位核苷酸开始编码其信号肽，到569位核苷酸为终止子。IFN—γ基因的开放框架(ORF)由498bp构成，编码166个氨基酸。成华猪IFN—γ与猪IFN—γ基因核苷酸间同源性为98％，在261—269存在点突变，在氨基酸水平完全一致。IFN—γ氨基酸与鼠同源性为30％，与人同源性为40％。     

长白猪γ-干扰素基因的克隆与序列分析

将长白猪外周血淋巴细胞进行体外培养,在ConA的刺激下培养8h～24h后,提取培养的淋巴细胞的总RNA,应用RTPCR技术扩增淋巴细胞γ干扰素cDNA,并将其克隆到pGEMT载体上,进行测序。序列测定结果表明,克隆获得的IFNγ基因全长为534个碱基,ORF为501个碱基,编码166个氨基酸,分子质量为19.4ku。此基因与我国藏猪、成华猪以及GenBank上发表的猪IFNγ基因的核苷酸同源性均为100%,并且在氨基酸水平上也完全一致。说明几种我国地方猪IFNγ在基因的核苷酸以及蛋白的氨基酸水平上不存在差异和突变,同时也证实了长白猪干扰素γ基因的正确、完整克隆。     

山羊催乳素受体基因部分片段的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出济宁青山羊催乳素受体基因长892 bp的片段，该片段含有97 bp的部分外显子8序列（外显子8全长为100 bp）、683 bp的内含子8、70 bp的外显子9及42 bp的部分内含子9。将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR进行阳性克隆鉴定，然后测定核苷酸序列，并推导其氨基酸序列。该序列与绵羊、母牛、人、大鼠、小鼠的催乳素受体基因mRNA的对应序列的核苷酸同源性分别为99.4 %、97.01%、89.22%、89.22%、88.02%，氨基酸同源性分别为100%、94.55%、81.88%、81.82%、83.64%。     

水貂 β-干扰素基因的克隆、测序与遗传进化分析

根据Genβank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂β干扰素（IFN—β）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT—PCR扩增水貂β干扰素基因,获得了约561bp片段,将其克隆到pEasy—T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂β干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的雪貂（EF581890．1）的IFN—β基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为100．0％,氨基酸同源性为100．0％。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在83．0％～100．0％之间和69．4％～100．0％之间。     

新城疫病毒TL1株P基因的克隆及序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒P基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR技术对新城疫病毒内蒙古分离株TL1的P基因进行了扩增。将扩增产物提纯后克隆入pGEM-Teasy载体,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。测序拼接得出P基因的序列长度为1248bp,该基因的ORF总长为1188bp,编码395个氨基酸。与GenBank下载的12株参考毒株比较P基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株核苷酸的同源性为99.8%,氨基酸的同源性为99.2%;与鹅源新城疫ZJ1株核苷酸的同源性为96.1%,氨基酸的同源性为95.5%,说明TL1株和与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株的同源性极高,它们三者亲缘关系较近,同属于基因VII型新城疫病毒。而与传统疫苗株LaSota核苷酸的同源性为83.4%,氨基酸的同源性81.8%,说明该毒株相对于经典的NDV在P基因上已发生了较大的变异。     

广西沼泽型水牛白细胞介素-10和干扰素-γ基因的克隆及其序列分析

将本地沼泽型成年水牛外周血单核细胞(PBMC)在刀豆素A(ConA)的刺激下体外培养,提取培养的单核细胞总RNA,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增水牛白细胞介素-10(IL-10)和干扰素-γ(IFN-γ),并克隆到pMD18-T载体上,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定筛选阳性克隆,然后进行测序。序列分析结果显示:IL-10开放阅读框(ORF)由536个核苷酸组成,共编码178个氨基酸;在核苷酸水平上与印度水牛、牛、绵羊、猪、马、人和鼠的IL-10基因的同源性为75.9%～99.6%;氨基酸的同源性为74.2%～100%。IFN-γ的ORF由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸;在核苷酸水平上与印度水牛、牛、绵羊、猪、马、人和鼠的IFN-γ基因的同源性为60.7%～99.6%;氨基酸的同源性为40.6%～100%。     

内蒙古绒山羊褪黑激素受体1a基因外显子1 克隆及序列分析

参考GenBank上已发表的绵羊(登录号:15U14109)、人(登录号:U14108)、牛(登录号:U73327)、鼠(登录号:U52222)等物种褪黑激素受体(melatonin receptor 1a,MTNR1a)基因 cDNA序列设计引物,以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到257 bp的基因片段,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较。结果表明,绒山羊MNTR1a基因外显子1序列与已发表的绵羊和牛该基因序列同源性分别为99%和96%,说明所得到的序列为绒山羊MNTR1a基因的外显子1序列。利用DNAStar软件分析,得到该基因序列的257个核苷酸。该序列包括5''UTR 23个核苷酸、翻译起始密码子ATG和N端78个氨基酸编码序列。     

水貂α-干扰素基因的克隆、测序与遗传进化分析

根据GenBank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂α干扰素（IFN-α）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT-PCR扩增水貂α干扰素基因,获得了约564bp片段,将其克隆到pEasy-T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂α干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的水貂的IFN-α基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为94.3%～95.5%,氨基酸序列同源性为89.3%～91.4%。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在78.1%～99.3%之间和69.4%～100.0%之间。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株（QY株）的F基因和HN基因.然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662 bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸.经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%.     

牛病毒性腹泻病毒P20和P14基因的克隆及序列分析

参考GenBank中BVDV Oregon C24V株的基因组序列设计两对引物,利用套式PCR方法扩增P20基因,扩增出预期525 bp的目的片段.扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序.测序结果与参考序列Oregon C24V比较,二者的核苷酸同源性仅为80.95%,推导氨基酸同源性为87.50%.测序结果经NCBI上的Blast(Http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)同源性比较,克隆得到的基因与Osloss株同源性最高,核苷酸同源性为93.65%,推导氨基酸同源性为95.83%.根据P20的测序结果,参照GenBank中BVDV Osloss株设计一对引物,扩增P14基因,经同源性比较,扩增的P14基因与Osloss株核苷酸同源性为94.77%,推导氨基酸同源性为95.10%,通过系统发生分析,推测P20基因和P14基因与Osloss株在进化上比较接近.     

猫细小病毒CC-1株VPl基因克隆与序列分析

根据GenBank登录的猫细小病毒（CU-4）VP1基因序列,设计了1对引物,用PCR技术对VP1基因进行整体扩增,将扩增产物纯化后克隆入PGM-T载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果表明,测序拼接得出VP1基因的序列长度约为2306 bp,该基因的ORF总长为2184 bp,编码727个氨基酸,应用DNAStar软件把所测得的序列与国内外代表性毒株的VP1基因编码区全长核苷酸序列和氨基酸序列进行比对分析,发现CC-1株与国内XJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.3%。     

猫细小病毒CC 1株VP1基因克隆与序列分析

根据GenBank登录的猫细小病毒(CU-4)VP1基因序列,设计了1对引物,用PCR技术对VP1基因进行整体扩增,将扩增产物纯化后克隆入PGM-T载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果表明,测序拼接得出VP1基因的序列长度约为2306 bp,该基因的ORF总长为2184 bp,编码727个氨基酸,应用DNAStar软件把所测得的序列与国内外代表性毒株的VP1基因编码区全长核苷酸序列和氨基酸序列进行比对分析,发现CC-1株与国内XJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.3%。     

猫细小病毒CC-1株VP1基因克隆与序列分析

根据GenBank登录的猫细小病毒(CU-4)VP1基因序列,设计了1对引物,用PCR技术对VP1基因进行整体扩增,将扩增产物纯化后克隆入PGM-T载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果表明,测序拼接得出VP1基因的序列长度约为2306 bp,该基因的ORF总长为2184 bp,编码727个氨基酸,应用DNAStar软件把所测得的序列与国内外代表性毒株的VP1基因编码区全长核苷酸序列和氨基酸序列进行比对分析,发现CC-1株与国内XJ-1株的核苷酸和氨基酸同源性均为99.3%。     

延边白鹅γ干扰素基因的克隆及序列分析

为了研究延边白鹅γ干扰素的生物学特性,本试验采用刀豆素（ConA）刺激延边白鹅外周血淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法扩增鹅γ干扰素基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行序列和序列分析。结果显示,延边白鹅γ干扰素基因全长495bp,经序列比对发现,克隆到的延边γ白鹅干扰素基因（JX966250）与哈尔滨鹅γ干扰素基因（AY524421）核苷酸序列同源性高达100%,与广东狮头鹅（EU030377）核苷酸序列同源性达99.6%,而三者的氨基酸同源性为100%。本试验成功克隆到延边白鹅γ干扰素基因,为进一步研究鹅干扰素的分子生物学特性和抗病毒作用机理奠定了基础。     

绵羊生长激素(oGH)的分子克隆与序列测定

本文旨在新疆绵羊生长激素(oGH)基因的克隆。从阿勒泰×中国美利奴杂交羊脑垂体细胞中提取总RNA,分离得到具翻译活性的mRNA。用RTPCR方法扩增出编码oGH的基因,长度为671bp。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,回收纯化。采用PCR克隆试剂盒将扩增产物连接至pTAdv质粒上,经PstI和XbaI双酶切鉴定正反插入后,筛选正向插入阳性克隆,并进行序列分析。结果表明克隆到的oGH基因序列与国外报道的序列有4个碱基差异,但所推导的氨基酸序列完全一致。oGH基因的开放阅读框架共含654个核苷酸,编码217个氨基酸,其中信号肽26个氨基酸,编码碱基为1～78(78bp);成熟肽191个氨基酸,编码碱基为79～651(573bp);终止密码子TAG(652～654bp)。其蛋白质的氨基酸序列与牛、人和鱼的序列同源性分别为99.08%、26.7%和5.9%。     

单增李斯特菌新疆分离株lmo2192基因克隆及生物信息学分析

试验旨在对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2192基因进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中lmo2192基因序列（登录号：CAD00270）设计特异性引物,利用PCR方法对lmo2192基因进行扩增,回收目的基因,连接到pMD19-T载体上进行克隆,筛选阳性菌进行测序,测序后对lmo2192基因核苷酸序列进行分析,预测其编码蛋白质的二级结构、三级结构,对其进行同源性比对及遗传变异分析。结果显示,新疆分离株LM90SB2的lmo2192基因序列全长为1 277 bp,包含969 bp开放阅读框,共编码322个氨基酸;LM90SB2株lmo2192基因核苷酸序列与CⅡMS-PH-1同源性为100.0%,与81-0861、10-0809、81-0592、81-0558、NTSN、F2365和WSLC1033的同源性为99.8%~99.9%,与L2074和NH1同源性分别为97.0%和96.9%。推导的氨基酸序列同源性为91.6%~100.0%。系统进化树显示,LM90SB2菌株lmo2192基因与4b血清型菌株亲缘关系较近,聚为同一分支。蛋白质二级结构预测表明,LM90SB2 lmo2192蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,不形成跨膜结构。蛋白结构域预测,lmo2192蛋白为ATP酶组分。本试验成功克隆LM90SB2分离株lmo2192基因,为进一步研究其基因功能提供理论依据。     

呼和浩特地区布鲁菌OMP25基因的克隆、序列分析

为了扩增呼和浩特地区布鲁菌OMP25基因的序列,试验参照GenBank上已登录的布鲁菌外膜蛋白OMP25的基因序列设计1对引物,采用聚合酶链式反应(PCR)技术从灭活的羊种布鲁菌中扩增出OMP25基因片段,将其克隆到pMD19-T载体后测序并应用计算机软件进行分析。结果表明:所测定的序列与羊种布鲁菌(B.melitensis)U33003 OMP25基因的核苷酸同源性为99.5%,推导出的氨基酸同源性为98.1%;与绵羊种布鲁菌(B.ovis)U33004 OMP25基因的核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为97.0%。     

单增李斯特菌新疆分离株lmo2192基因克隆及生物信息学分析

试验旨在对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2192基因进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中lmo2192基因序列(登录号:CAD00270)设计特异性引物,利用PCR方法对lmo2192基因进行扩增,回收目的基因,连接到pMD19-T载体上进行克隆,筛选阳性菌进行测序,测序后对lmo2192基因核苷酸序列进行分析,预测其编码蛋白质的二级结构、三级结构,对其进行同源性比对及遗传变异分析。结果显示,新疆分离株LM90SB2的lmo2192基因序列全长为1 277bp,包含969bp开放阅读框,共编码322个氨基酸;LM90SB2株lmo2192基因核苷酸序列与CIIMS-PH-1同源性为100.0%,与81-0861、10-0809、81-0592、81-0558、NTSN、F2365和WSLC1033的同源性为99.8%～99.9%,与L2074和NH1同源性分别为97.0%和96.9%。推导的氨基酸序列同源性为91.6%～100.0%。系统进化树显示,LM90SB2菌株lmo2192基因与4b血清型菌株亲缘关系较近,聚为同一分支。蛋白质二级结构预测表明,LM90SB2lmo2192蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,不形成跨膜结构。蛋白结构域预测,lmo2192蛋白为ATP酶组分。本试验成功克隆LM90SB2分离株lmo2192基因,为进一步研究其基因功能提供理论依据。     

乌鬃鹅a干扰素基因的克隆及生物信息学分析

采用RT-PCR方法从乌鬃鹅肝脏中扩增a干扰素（Interferon,IFN-a）基因片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体上,经PCR和双酶切鉴定为阳性后进行序列测定,并用生物信息学软件Lasergene v7．1DNAStar和在线分析方法对IFN—a基因的核苷酸序列及其氨基酸序列进行了生物信息学分析,同时与GenBank中登录的鸡、鸭和鹅IFN．仅基因核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明,所扩增的IFN—a基因编码完整的开放阅读框,基因长度为576bp,与鸡、鸭与鹅IFN-a基因核苷酸序列同源性在72．0％～99．7％,遗传进化树显示鸡、鸭、鹅IFN-a因在遗传进化上各处一支。乌鬃鹅IFN-a基因的克隆及生物信息学分析为进一步研究鹅干扰素抗病毒的作用机理奠定基础。