野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌，能引起十字花科作物发生黑腐病．本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变，获得17280株Tn5gusA5突变体，并从中筛选到一批致病缺陷突变体，采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位，发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORFl857内(未发表资料)，该ORF功能尚未见报道．序列分析表明，ORFl857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的ωbpL基因演绎的编码产物具有33％的一致性和45％的相似性，并具有第4家族的糖基转移酶功能域，因此本暂将ORFl857命名为ωbxL基因．对ωbxL基因进行缺失，获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时，缺失突变体完全丧失致病性，一段PCR合成的包含ωbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体，恢复缺失突变体的致病性．这证实ωbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因．     

胞外多糖对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种气孔入侵能力的 …

利用Ｔｎ５ｇｕｓＡ５插入诱变和标记置换等分子遗传学方法,构建了时取油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ,ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）８００４菌株的系列突变体,其中有６个突变体的胞多多糖产量显著降低,将它们喷雾接种寄主植物萝卜时,有２个突变体仍具有一定的致病性,４个突变体无致病性,结合扫描电镜观察,我们认为胞外多糖产量影响着该病菌气孔入侵能力。     

不同接种浓度对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种胞外多糖突 …

利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变和标记置换方法,构建了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）系列标记置换变突体,其中６个突变体的胞外多糖产量显著降低,致病试验结果表明,胞外多糖产量对Ｘｃｃ的致病性有明显的影响,不同接种浓度对Ｘｃｃ胞外多糖突变体致病性亦有明显影响。     

野油菜黄单胞菌葡萄糖激酶基因的克隆与表达

葡萄糖激酶催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸,是糖酵解的第一步反应,在野油菜黄单胞菌(Xcc)利用碳源代谢及其致病性中起重要作用.为了初步鉴定Xcc葡萄糖激酶基因功能,为研究其利用碳源相关代谢及致病性提供理论依据,以pQE30为表达载体,采用常规PCR技术对野油菜黄单胞菌Xcc8004基因组上注释为葡萄糖激酶的3个基因(XC_1166、XC_1223和XC_1976)进行了克隆与表达,该3个基因在大肠杆菌JM109中有较高表达量,经Ni2+金属层析柱纯化后分别得到带有3个His的融合蛋白XC_1166-His6、XC_1223-His6和XC_1976-His6,分析表明仅XC_1976的表达产物具有葡萄糖激酶活性,为Xcc8004葡萄糖激酶基因,经测定XC_1976-His6的最适反应温度为45℃,最适pH值为7.1,最适反应条件下比活力为(380.6±1.123) U/mg.     

野油菜黄单胞菌重组克隆pIXU9278对黄原胶生物合成的影响

用ＰＩＪ３２００作为载体,构建了包含１５６２个重组克隆野生型野油菜黄单胞菌的粘粒文库,通过三亲交配法,基因文库中的重组克隆可以在ＰＲＫ２０１３的帮助下,从Ｅ．ｃｏｄｉ中以ＸＣＣＮＡＵ－９２中,绝大多数重线克隆对黄原胶合成无影响,但导致菌株生长缓慢,工程菌株ＸＣＣＮＡＵ－９２７８（ＰＩＸＵ９２７８）在２８℃、１２０ｔ／ｍｉｎ条件下发酵７２ｈ,产量达３７．５０ｇ／ｋｇ,发酵液度力为１４６００ｍＰａ．ｓ     

转录调节因子VrhR负调控野油菜黄单胞菌的致病力

以野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc）转录调节因子VrhR,VrhA和VrhB为研究对象,通过基因敲除和致病性分析确定它们在Xcc与宿主互作过程中的作用。结果表明:VrhR只含有HTH（helix-turn-helix）结构域;在基因组上vrhR位于其他2个lysR类转录调节因子（vrhA和vrhB）之间,但转录方向相反。vrhR突变会提高Xcc的致病能力,但vrhA和vrhB突变对病原菌的致病能力没有影响。同时, vrhR,vrhA和vrhB突变均不影响细菌的运动性及胞外酶（蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶）的活性。     

水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种非寄主互作体系中病原细菌过氧化氢的作用

 【目的】探讨互作体系中病原菌来源过氧化氢的作用。【方法】采用组织化学法通过透射电子显微镜技术观察水稻与油菜黄单胞菌菜豆致病变种互作体系中的过氧化氢积累的定位。【结果】突变体菌株细胞中烷基过氧化物还原酶亚基C的缺失导致胞内其余过氧化氢清除酶活性的补偿性显著上升,使胞内内源过氧化氢积累水平显著下降,并引起病原菌与水稻互作体系中的过氧化氢积累水平发生显著变化。【结论】病原细菌很可能是互作体系中过氧化氢的一个重要来源。病原细菌产生的过氧化氢很可能在非寄主互作中造成细菌周围植物细胞的损伤,对植物细胞具有潜在的毒性。     

野油菜黄单胞菌8004α-淀粉酶酶学性质研究

对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶进行了定位,确定该酶为胞外酶,且只有一型α-淀粉酶。采用切胶纯化得到纯酶,SDS-PAGE测得其相对分子质量为52ku。研究显示,该酶的最适作用温度为50℃,最适pH值为6.2,通过酶的稳定性研究发现该酶热稳定性较差,而pH值在4.86～10.47具有较好的稳定性。     

黄单胞菌葡萄糖转运系统相关基因的敲除及功能分析

分别敲除了植物病原体野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv. campestris 8004）的3个葡萄糖转运蛋白和2个葡萄糖脱氢酶,获得了5株相应基因敲除的突变体。在营养丰富的培养基中,这5株突变体的生长曲线、胞外纤维素酶活性和胞外多糖量与野生型相比并无显著差异。在以葡萄糖为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除显著影响了黄单胞菌的生长;在以CMC作为唯一碳源的M63培养基中,XC_2460基因的敲除使突变体的胞外葡萄糖累积量达到野生菌株的167倍。这些结果首次显示阻遏葡萄糖的跨膜转运是改进纤维素分解菌株积累葡萄糖量的有益途径。     

野油菜黄单胞菌中长链3-酮脂酰ACP合成酶的鉴定

【目的】研究野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris 8004基因组中3个标注为3-酮脂酰ACP合成酶的基因Xcfab F1、Xcfab F2和Xcfab B在脂肪酸合成过程中的功能.【方法】将这3个基因分别克隆到表达载体p BAD24M,然后转化大肠埃希菌Escherichia coli的fab B和fab F温敏型突变株CY242和CY244,同时利用体外无细胞抽提物酶学分析Fab F1、Fab F2和Fab B蛋白活性.【结果和结论】Xcfab F1和Xcfab B基因分别能遗传互补大肠埃希菌fab F和fab B突变,而Xcfab F2基因则不能互补大肠埃希菌fab F或fab B突变.体外无细胞抽提物酶学分析表明Fab F1和Fab B都能完成辛脂酰-ACP的延伸,但Fab F2则不能完成该酶促反应.Xcfab B基因编码3-酮脂酰ACP合成酶I,Xcfab F1基因编码3-酮脂酰ACP合成酶II,而fab F2基因不参与中长链脂肪酸的合成.     

几种杀菌剂对柑桔溃疡病的生物活性

为筛选防治柑桔溃疡病的有效药剂,按大田推荐使用浓度,用抑菌圈法测定17种非铜药剂和5种含铜药剂对柑桔溃疡病的毒力,并研究7种非铜药剂田间防治效果。结果表明,代森锰锌、福美双、福美双.溴菌腈、农用链霉素、金核霉素和琥胶肥酸铜.乙磷铝.硫酸锌抑菌作用最强,其次为福美双.福美锌、大蒜素、络氨铜.络氨锌和盐酸吗啉胍.乙酸铜,过氧乙酸、噻唑锌、春雷菌素、中生菌素、琥珀酸铜和噻菌铜有微弱的抑菌作用,百菌清、多菌灵、苯醚甲环唑、叶青双、复硝酚钠和井冈霉素无抑菌作用。大田试验结果表明,30%金核霉素WP 500 mg/L和72%农用链霉素WP 200 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为76.34%和74.94%,显著优于其它药剂处理;80%代森锰锌WP 2000 mg/L、50%福美双WP 400 mg/L和50%福美双.溴菌腈WP 500 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为70.36%、66.55%和69.37%,与对照含铜药剂20%噻菌铜SC 67 mg/L处理无显著差异;大蒜素和叶青双对柑桔溃病防效较差,6%大蒜素EC 120 mg/L和20%叶青双WP 400 mg/L处理对柑桔溃病的防效分别为41.84%和21.8...     

十字花科黑腐病菌中假定糖基水解酶基因与致病力相关研究

[目的]已报道的十字花科黑腐病菌Xcc 8004菌株基因组中XC1077被注释编码一个假定糖基水解酶,初步研究XC1077基因的致病性,为深入研究Xcc 8004中的糖基水解酶在植物病原菌侵染及定殖过程中的作用奠定基础.[方法]通过同源单交换构建XC1077整合突变体NK1077,用带有全长XC1077基因序列的pLAFRJ质粒对NK1077进行功能互补并检测致病性.[结果]PCR及酶切验证表明整合突变体NK1077和互补菌株C1077构建成功.在MMX基本培养基上,NK1077及C1077的生长情况与Xcc 8004一致.致病性试验结果表明,NK1077在满身红萝卜的致病性下降到Xcc 8004的48.3％,过敏反应(HR)检测结果表明NK1077在辣椒ECW-10R上产生的HR反应明显滞后,而互补菌致病力及过敏反应能恢复至野生型水平.[结论]XC1077基因在Xcc 8004中是一个与致病相关的基因.     

水稻白叶枯病菌菌落类型及致病力变异研究

在1983～1988年间从182个菲律宾水稻白叶枯病菌菌株和97个中国菌株中获得2万多个单菌落,根据菌落特征(形态,大小,色泽)及在鉴别品种上致病性测定的结果,供试菌株可区分为野生型,突变型和中间型三个类型,野生型代表菌株的原始致病力;突变型不但在菌落特征上有别于野生型,且致病力接近于无毒菌;中间型菌落的特征和致病力均不稳定,多糖体的产生量与病菌菌株的菌落特征及致病力间无明显的规律性可循,突变型菌落的出现频率与致病力有一定关系,但因菌而异,采用低温和冰冻真空干燥保存法、减少移植次数、延长移植间隔时期、选用适宜的培养基有减少突变型菌落而延缓致病力下降的作用。     

PCR-based Assay for the Detection of Xanthomonas campestris pv. Mangiferaeindicae Causing Bacterial Black Spot in Mango

[Objective] This study aimed to develop a PCR assay for detecting Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae(Xcm) in culture and in planta. [Method] Primers(Xcm HF and Xcm HR) were designed based on the partial sequence of hrp B gene from xanthomonads to develop a PCR assay for Xcm. Furthermore, specificity and sensitivity of the primer pairs were analyzed in detection of genomic DNA and cell from Xcm. [Result] Amplication was positive only with genomic DNA from positive control ATCC11637 and 12 Xcm strains; no PCR products were amplified with genomic DNA from ten other xanthomonads and seven other bacterial species. The sensitivity of detection was 2.4 pg/μl genomic DNA, and 1.8 × 104CFU/ml cells. The primers also worked well for pathogen detection in direct PCR assays of Xcm colonies grown on liquid medium and in PCR assays of total DNA from leaf, branch and fruit lesions. [Conclusion] A PCR assay was successfully established for rapid detection of Xcm in culture and in planta.     

水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas campestris pv.Oryzicola Dye)的致病力变异和菌系鉴别

1988-1991年,从福建省内外收集和分离了161个菌株,用针刺接种法,先后在25个水稻品种上进行了病菌致病力的测定.根据从中选择的17个水稻品种对选择的16个菌株所做的试验结果表明,稻条斑病菌菌株间存在明显的致病力差异,而且这种差异是数量性的.1991年,根据125个菌株对选择的4个鉴别品种的侵染反应,将这些菌株划分为致病力强弱不同的4个菌群.0群菌致病力退化;Ⅰ群菌致病力弱;Ⅱ群菌致病力中等;Ⅲ群菌致病力最强.其中Ⅱ和Ⅲ群菌占优势,在福建省34个县市已有分布.     

六种复配剂对芒果细菌性黑斑病菌的室内抑菌效果评价

为筛选出有效防治芒果细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae)的复配剂,采用Horsfall法对6种复配剂进行室内增效评价。试验结果表明,硫酸链霉素与噻菌铜各配比、敌磺钠与中生菌素以1∶4、4∶1配比及噻菌铜与盐酸四环素以4∶1、3∶2、2∶3配比时有明显的增效作用;其余的组合则表现协同或拮抗作用。     

水稻白叶枯病菌gacA基因的克隆、测序及敲除研究

根据黄单胞菌gacA基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pvoryzae,Xoo）中克隆了gacA同源基因,命名为gacAxoo。序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的。蛋白质保守结构域搜索表明,GacAxoo属于LuxR家庭的一员,具有与其他GacA蛋白相似的结构。通过同源重组的方法,构建了gacAxoo的插入突变体,为下一步研究gacAxoo的功能奠定了良好的基础。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。