转基因杂交稻的抗性表达及其综合性状分析

通过对7个由粳稻转基因恢复系7个稳定株系(含有抗除草剂basta的bar基因和抗二化螟的SCK基因)与3个不育系(341A、1187A、早花二A)配制的杂交组合进行田间抗性检测及综合性状分析,得知杂交种F1喷施0.2%除草剂basta,表现与父本一致,生长正常,高抗除草剂,表明转基因恢复系的抗性基因在杂交种F1代得到高效表达;7个组合全部正常结实,正常成熟,F1结实率在88%以上,表明转基因恢复系具有很高的配合力和很强的恢复度;杂交稻小区产量显著高于父本及对照,表明转基因恢复系所配组合具有很强的杂种优势。     

粳稻转基因恢复系的研究

利用基因枪转化法将抗除草剂的bar基因和抗二化螟的SCK(修饰后的CpTI)基因导入到优质粳稻恢复系超优一号中。经对转基因植株进行分子检测,表明外源基因已整合到水稻基因组中;经田间除草剂抗性检测和二化螟接种鉴定,表明转基因稳定株系直到T6仍表现高抗除草剂且没有分离,说明bar基因能稳定遗传并高效表达;转基因恢复系与非转基因恢复系相比,抗虫性有所提高,但提高程度在株系间有差异。经对转基因恢复系所配杂交组合进行除草剂检测和优势测定,表明转基因杂交稻也高抗除草剂,且F1全部正常结实,结实率达80%以上,并具很强的杂种优势,说明亲本抗性基因通过制种已转移到F1中并得到高效表达,同时说明外源基因的导入没有改变原受体的优良性状;经对部分转基因杂交稻进行纯度鉴定,表明秧田喷施除草剂后,本田的不育株率和杂株率明显降低,特别是两系杂交稻效果更明显。     

农杆菌转化花粉愈伤组织获取纯合的转基因水稻植株

应用农杆菌介导法成功地将玉米转座子Ds导入粳稻(OryzasattvaI.subsp.japontca)中花11的花粉愈伤组织中,基因转化以对除草剂PPT有抗性的Bar基因和潮霉素抗性基因Hpt为选择标记.共获得了18个独立的转基因绿苗,其中单倍体11株,二倍体7株.转基因植株均抗除草剂BASTA.考查了二倍体植株种子后代(T1)对BASTA的抗性,7个株系的所有植株均抗BASTA,而未发生感抗分离,表明外源基因在转基因植株中是纯合的.PCR和Southernblotting的研究支持上述结果.对获得纯合转基因株系的各种方法做作了比较和讨论.     

雪花莲外源凝集素基因在水稻保持系上的转化

通过把雪花莲外源凝集素基因(GNA)与潮霉素抗性基因(Hyg)构建到同一表达载体上,利用基因枪转化方法,把雪花莲外源凝集素基因导入粳稻保持系中,通过PCR方法和潮霉素抗性筛选,检测该基因的导入情况,发现部分克隆植株只具有单一潮霉素抗性,需要结合抗虫性测定来确定GNA基因的导入及表达。     

分子标记辅助选择Xa23基因改良节水抗旱稻亲本的白叶枯病抗性研究

以携带抗白叶枯病基因Xa23的水稻材料‘CBB23'为供体材料,以优良节水抗旱稻保持系‘沪旱1B'为受体材料,采用杂交和回交的方式,在后代分离群体中利用与Xa23基因紧密连锁的SSR标记RM206进行分子标记辅助选择,同时将改良的保持系与不育系成对回交,通过分子标记检测、田间抗性鉴定和综合农艺性状选择,在BC_3F_5后代株系中获得Xa23基因纯合且表型与‘沪旱1B'相似的株系10份,以及与改良保持系回交3代的纯合不育系材料4份。使用P6菌系采用人工剪叶接种鉴定,发现纯合株系材料明显提高了对白叶枯病的抗性。     

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

[目的]利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株.[方法]以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验.利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组.[结果]愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50 mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30 mg/L.获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株.MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%.[结论]建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率.     

籼稻R996转Pi9基因纯系的筛选及稻瘟病抗性鉴定

采用农杆菌介导法将抗稻瘟病Pi9基因导入籼稻品种R996,获得转基因植株,并对这些转基因植株进行遗传分析。结果表明:Pi9基因已经整合到受体细胞基因组中,并在转录水平上得到了有效表达;对转基因植株后代进行潮霉素抗性、GUS染色和PCR检测分析,鉴定出Pi9基因阳性转化子;经稻瘟病抗性鉴定,从T1代符合孟德尔分离比(1∶2∶1)的分离群体中,成功筛选出转Pi9基因的籼稻R996纯系。     

用花粉管通道法将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻获得转基因植株

采用花粉管通道法遗传转化技术,将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻品系9311中,获得了转基因植株。抗虫性鉴定结果表明:部分转基因植株对水稻螟虫的抗性比对照明显提高;PCR扩增获得了与引物扩增片段长度相同的DNA片段,证实API基因已整合到受体植株的基因组中。遗传分析表明,API基因能在有性生殖过程中传递给后代,并于T4代分离出抗性纯合的株系。     

利用标记辅助选择培育抗褐飞虱水稻三系保持系和不育系

以广西普通野生稻的高抗褐飞虱渗入系HS204为抗源供体材料,采用杂交、回交,结合分子标记辅助选择的方法,选育抗性保持系和不育材料,以期为杂交稻抗性育种提供良好的材料基础。结果表明,通过标记辅助选择获得4份抗性基因纯合的保持系中间材料(100B、101B、102B和103B),2份抗性不育系材料(100A和103A)。与高抗不育系100A测交的10个组合均表现出较好的抗褐飞虱抗性水平,其中属高抗水平的为100A/R2586、100A/KR838和100A/KR527,其余为抗至中抗水平;100A/KR527、100A/R2586、100A/明恢63、100A/辐恢838和100A/桂99等组合单株产量比对照(特优7118)显著增高,增幅为14.45%~49.26%。获得的抗性保持系,可为杂交稻抗性不育系的育种提供更好的基因源;获得的抗性不育系可直接应用于三系杂交稻的配组选育。     

粳稻转基因恢复系的研究*

 利用基因枪转化法将抗除草剂的bar基因和抗二化螟的SCK（修饰后的CpTI）基因导入到优质粳稻恢复系超优一号中。经对转基因植株进行分子检测，表明外源基因已整合到水稻基因组中；经田间除草剂抗性检测和二化螟接种鉴定，表明转基因稳定株系直到T6仍表现高抗除草剂且没有分离，说明bar基因能稳定遗传并高效表达；转基因恢复系与非转基因恢复系相比，抗虫性有所提高，但提高程度在株系间有差异。经对转基因恢复系所配杂交组合进行除草剂检测和优势测定，表明转基因杂交稻也高抗除草剂，且F₁全部正常结实，结实率达80%以上，并具很强的杂种优势，说明亲本抗性基因通过制种已转移到F₁中并得到高效表达，同时说明外源基因的导入没有改变原受体的优良性状；经对部分转基因杂交稻进行纯度鉴定，表明秧田喷施除草剂后，本田的不育株率和杂株率明显降低，特别是两系杂交稻效果更明显。     

巴西橡胶树HbMT2植物表达载体的构建及遗传转化烟草

将巴西橡胶树金属硫蛋白基因HbMT2插入到植物表达载体pCAMBIA 1304,得到HbMT2基因的植物表达载体pCAMBIA1304-HbMT2.通过电击法将该载体导入根癌农杆菌菌株中并转化烟草.将获得的具有潮霉素(Hyg)抗性的再生植株进行PCR鉴定.结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中.抗逆性分析试验显示,转基因烟草对H202处理和紫外线照射耐受性显著提高;重金属离子胁迫下,转基因烟草叶绿素含量、过氧化物酶和过氧化氢酶活性明显高于对照.     

Pi9基因标记辅助选择改良水稻不育系金23A稻瘟病抗性

以携带广谱持久的抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75–1–127为供体亲本，以保持系金23B及其不育系金23A为受体亲本，采用Pi9基因共显性标记CoInDF1R2进行MAS回交育种，以改良三系不育系金23A及其保持系金23B的稻瘟病抗性；用25份稻瘟菌代表性菌株进行室内苗瘟接种，观察苗瘟抗性表现。结果显示：金23A和金23B的抗性频率仅为28%，而75–1–127的抗性频率为92%；田间病圃抗性鉴定结果显示，75–1–127高抗苗瘟，而金23A和金23B受体亲本均高感苗瘟；共显性标记CoInDF1R2在75–1–127 基因组上扩增出大小为354 bp的PCR产物，对金 23A或金23B基因组的扩增产物大小约470 bp，说明该标记在2个亲本间的多态性明显且稳定；利用CoInDF1R2开展连续多年MAS回交育种实践，培育出了农艺性状优良、丰产性较好的抗病不育系金23A–Pi9–1及抗病保持系金23B–Pi9–1，为三系法杂种优势利用提供了新的抗稻瘟病亲本材料。     

同核异质大豆叶绿体DNA的SNP分析

在前期对大豆细胞质雄性不育系JLCMS9A和其相应的保持系JLCMS9B这2个同核异质的材料叶绿体基因组高通量测序数据分析的基础上,以可育系细胞质PI437654(GenBank:DQ317523.1)和保持系JLCMS9B叶绿体基因组序列为对照,挖掘了不育系JLCMS9A叶绿体基因组特有的位于基因区和非编码区的SNP,并对不育系JLCMS9A基因区特有的2个SNP所对应基因的功能、结构及其对大豆育性可能的影响进行了分析。提取JLCMS9A和JLCMS9B的叶片RNA,对不育系JLCMS9A基因区特有的2个位于基因区的SNP基因进行了qPCR的表达分析,发现在不育系材料中matK基因表达量明显高于保持系,而ycf1基因表达量在不育系和保持系中相近,推测不育系JLCMS9A位于叶绿体基因区特有的SNP基因matK的表达,会对大豆育性产生影响。     

自然昆虫传粉转Bt基因棉花核质不育系的主要性状研究

研究了昆虫自然传粉条件下转Bt基因棉、常规棉核质不育系及其相应同核异质保持系的主要经济性状。结果表明 :不育系的单株成铃、衣分、霜前籽棉和皮棉产量极显著低于保持系 ,子指显著高于保持系 ;转Bt基因不育系的单铃重显著低于保持系 ,霜前种子产量差异不明显 ;转Bt基因不育系霜前种子产量极显著高于常规不育系 ;转Bt基因不育系昆虫自然授粉率比常规不育系大幅提高。     

聚合抗稻白叶枯病双基因三系不育系R106A的选育研究

 中国杂交水稻的多数不育系不抗白叶枯病，携有单个的白叶枯病抗病基因的品种易于丧失抗性。本研究通过杂交、回交和自交将两个抗病基因聚合到不育系中，进行抗性改良。用育成的抗3418S（携有Xa21）为受体，CBB23(携有Xa23)为供体，通过1次杂交、1次回交和3次自交，采用足够大分离群体在分蘖前期进行接种初筛，再进行分子标记检测复筛，确认了目标基因的聚合，实现了均位于第11染色体上的Xa21和Xa23基因间交换重组，获得双基因纯合稳定的新品系R106。又用我们育成的矮败型不育系5801A进行转育，杂交一次后，向保持系（轮回亲本）定向选择，经回交3次迅速稳定，所育成的不育系及保持系对中国的7个病原型代表菌株均表现全生育期高度抗病，可能会大大延长其抗性寿命。并讨论了改良不育系抗性的研究方法、回交次数和选择世代等问题。论。     

向大白菜A1,A2同步转育抗根肿病基因和显性核不育基因的研究

根据大白菜复等位基因遗传假说及抗根肿病基因由一个显性核基因控制的结论,以现有的抗根肿病雄性不育系作为不育源,以大白菜自交系A1,A2为轮回亲本,经过抗病筛选、连续回交、测交、自交等转育方法,将抗根肿病基因和核不育基因同时向A1,A2中转育,分别得到抗根肿病的新甲型两用系、临时保持系。     

转无毒基因马铃薯抗晚疫病的研究

晚疫病菌(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是危害全球马铃薯生产的严重病害.通过基因工程方法把外源基因导入植物体内以增强抗病性被证明是一条行之有效的途径.应用植物基因工程技术将具有能激活植物自身防御系统的无毒基因与适合于植物背景、非专一性的病原物诱导启动子组合成嵌合基因构建到植物表达载体中.通过农杆菌或基因枪的介导转化植物,可筛选出高效广谱的抗真菌和细菌病害的转基因植株.本研究从病原细菌Pseudomonas syringae PV.tomato中获得的无毒基因avrD(0*93kb)和从病原真菌Phytophthora parasitica中获得的无毒基因Elicitin(0.294kb)分别与非专一性病原物诱导启动子Pill和BG组成含2个嵌合基因(Pill-avrD,BG-Elicitin)的植物表达载体pYH144和pYHEt.通过农杆菌LBA4404介导转化马铃薯,其中用pYH144载体转化2个品种(克新1号,2号),用pYHEt载体转化3个品种(Desiree,克新2号,4号),通过组织培养分别获得潮霉素(HygromycinB)标记的转基因马铃薯试管苗.将转基因试管苗扩繁,应用马铃薯脱毒微型种薯生产技术获得转无毒基因微型薯,在温室(15～25℃和湿度高)条件下,观察转无毒基因马铃薯植株中对晚疫病菌自然感染的抗性.1998年和1999年(每年的3-5月)的温室试验初步表明用avrD和elicitin基因分别转化的转无毒基因马铃薯植株都具有较明显的对晚疫病菌侵染的抗性,大部分转基因植株不表现或表现轻微的感病症状,对照植株(未转化)则表现明显的感病症状.转基因植株生长正常,且在感染后期(恢复期)生长良好.对照植株在恢复期生长弱和缓慢.在获得较多数量的转无毒基因马铃薯微型种薯的时候,将进行人工接种晚疫病菌和田间种植试验,从中筛选出抗真菌病和细菌病的转基因马铃薯株系.     

番茄BADH2基因转化水稻

用分子生物学手段,构建含番茄BADH2基因的过表达载体,通过农杆菌介导的方法将其导入日本晴幼胚诱导的愈伤组织,获得了303块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织。获得1 059个转化植株。随机选择115个T0植株进行Hyp离体叶片筛选,结果表明,绝大多数植株均呈抗性,并且与PCR检测结果相吻合,说明T0植株中不存在假阳性。