家蚕丝素蛋白对大鼠胆固醇代谢的影响

研究了经酸解后制得的家蚕丝素蛋白氨基酸组成以及对高血脂实验鼠血清和肝脏内胆固醇及转氨酶的活性变化的影响。结果表明 :所得的家蚕丝素蛋白粉氨基酸组成丰富 ,其中甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸含量占全部氨基酸总量的 95 %;家蚕丝素蛋白能显著地降低血清胆固醇含量和谷草转氨酶及谷丙转氨酶活性 ,提高动物肝组织中的胆固醇浓度和谷丙转氨酶的活性。     

家蚕丝素蛋白铜元素螯合物的制备及其对动物生理影响研究

以水解丝素粉螯合微量金属元素,通过改变螯合液的PH值可以调节微量金属元素的螯合量,螯合的金属元素改变了丝素肽的分子结构及其蛋白末端羧基的性质.经动物实验证明丝素蛋白-铜螯合物对小鼠和大鼠均无毒或异变影响.     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

家蚕丝素重链表达系统表达外源蛋白的应用研究进展

家蚕丝腺拥有出色的丝蛋白合成能力,家蚕又具有容易饲养、生长周期短等优点,利用家蚕丝腺来生产大量有价值的蛋白,生产出的重组蛋白可在生物、医药、材料学等领域广泛应用,所以家蚕丝腺是一种理想的生物反应器。高效表达系统的构建是家蚕丝腺生物反应器产生重组蛋白的关键步骤之一。为了构建出更加优良的表达系统,结合国内外研究进展,对家蚕丝素重链表达系统的建立、发展与应用情况进行综述,为该系统的深入研究与应用提供参考。     

家蚕丝素蛋白H链基因启动子区域的克隆及活性分析

家蚕(Bombyxmori)丝素蛋白H链基因(fib-H)具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为利用其时空调控机制,通过PCR扩增方法克隆fib-H启动子片段,并进行序列分析,进而构建由fib-H启动子控制报告基因DsRed的重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA,通过家蚕BmN细胞和丝腺进行瞬时表达。结果表明:克隆的fib-H启动子序列具有典型的丝腺特异性表达启动子的特征,并可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

家蚕丝蛋白基因的表达调控

至少有三种基因特定地在家蚕后丝腺(PSG)中表达,而在中丝腺(MSG)中至少有五种基因特异表达。在这些基因的表达过程中,有很多顺式和反式作用因子参与了对基因转录和翻译的调节,使基因表达体现出精确的时间和空间性。     

家蚕丝素轻链蛋白多克隆抗体的制备及应用

本研究通过用回收纯化的Fib-L蛋白为抗原免疫家兔,获得多克隆抗体,通过与家蚕大造5龄5d的10个不同组织进行Western blot,结果表明,制备的FbL抗体能识别在后部丝腺特异合成的Fib-L蛋白,表明该抗体有较好的特异性。利用此抗体进行丝腺组织的免疫组化,经抗体的一系列的梯度稀释和条件探索,发现当Fib-L-抗在1：50和荧光二抗1：1000的条件下得到理想的免疫组化结果,在荧光显微镜下观察到了二抗标记的绿色荧光。以上结果显示,本实验成功制得Fib-L蛋白抗体,获得丝腺组织免疫组化的一些重要参考信息,为家蚕丝腺功能基因的研究及细胞定位提供了一定的参考价值。     

家蚕丝素重链基因（fib-H）部分序列克隆及结构分析

通过PCR分别克隆了1个包含家蚕丝素重链基因启动子及旁侧序列（1380bp）、丝素重链基因第1内含子和第2外显子的部分序列（956bp）的2个片段,并进行了序列测定和分析,结果显示：该2个片段与已公开的家蚕丝素重链基因（GenBank登录号：AF226688）对应区域的同源性分别达98．48％和99．58％;2级结构分析显示,在启动子区域存在大量简单的反向互补序列,可形成多个潜在的茎环结构,推测这些茎环结构可能与调控蛋白的识别和作用有关;将第2外显子对应的部分氨基酸序列与其他昆虫的丝蛋白进行比对分析,发现不同的丝蛋白在比对的区域具有潜在的守恒基序,其差异序列可能与丝蛋白的特性相关。     

N-乙酰半胱氨酸联合家蚕丝素蛋白解酒效果的动物试验

为了开发解酒效果更好的蚕丝功能性食品,将具有氧自由基清除作用,易进入肝细胞的N-乙酰半胱氨酸添加入家蚕丝蛋白粉中,调查其对ICR种小鼠血液中乙醇的分解效果。N-乙酰半胱氨酸联合家蚕丝素蛋白灌胃处理较家蚕丝素蛋白灌胃处理对小鼠血液中的乙醇具有更好的分解效果:前者使小鼠血液中的乙醇浓度在灌胃乙醇30 min后就快速下降,至4 h时,小鼠血液中的乙醇浓度仅为对照组的8.1%;后者使小鼠血液中的乙醇浓度在灌胃乙醇120 min后开始下降,至4 h时,小鼠血液中的乙醇浓度为对照组的65.6%。N-乙酰半胱氨酸联合丝素蛋白对雌、雄ICR种小鼠和SD种大鼠的急性毒性试验结果显示,其LD50均大于10 g/kg,且在试验剂量范围(2.5、5.0、10.0 g/kg)内,对小鼠骨髓多染红细胞微核率及精子畸形发生率均未见有明显影响。在丝素蛋白粉中添加适量N-乙酰半胱氨酸后,能增强对供试动物血液中乙醇的分解作用,且无明显的毒副作用。     

冷冻干燥对丝素蛋白凝胶结构的影响

为了探讨冷冻干燥对丝素蛋白凝胶结构的影响,利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)研究了丝素凝胶在冷冻干燥前后二级结构的变化。发现在冷冻干燥过程中,丝素蛋白中分子链内β-折叠结构含量增加,分子链间β-折叠结构含量减少,并有部分无规卷曲结构转变为β-折叠结构;但冷冻干燥前后总的β-折叠结构含量变化不大。     

丝素、丝胶质量标准指标的研究

为进一步制订丝素和丝胶的质量标准,并用以指导蚕丝蛋白规范生产,检测分析了丝素与丝胶中的氨基酸含量、干燥失重和灰分等质量指标,砷、铅等重金属含量的安全性指标,以及菌落总数、大肠菌群和致病菌等微生物指标。参照食品、化妆品等国家标准限量规定,结合蚕丝蛋白的特性和生产制备现状,初步提出了评价丝素与丝胶质量优劣的指标及相应的数值范围。     

家蚕丝素固定化糖化酶的研究

茧丝经高浓度的氯化钙溶液处理或用稀碱溶液处理后,制成了粉末状丝素和碱化丝素,并以此为载体,用戊二醛为交联剂固定了糖化酶。经对固定化酶性质和动力学参数等的研究表明：丝素能较好地固定糖化酶;每克干粉末状丝素固定化酶的活力约为１８２２ Ｕ, 固定化酶的最适ｐ Ｈ 值比游离酶增加了１０ 到１２５ 个单位,最适温度比游离酶降低了５ ～１０ ℃;固定化酶具有较长的操作半衰期（１４ ～１８ｄ） ;通过米氏常数的测定,粉末状丝素固定化酶的 Ｋｍ １ ＝ ２ ．５３ ×１０ －５ , 碱化丝素固定化酶的 Ｋｍ ２ ＝３１５ ×１０ － ５ 。实验还发现： 在制备 固定化糖化 酶时, 酶的最适 浓度为 ８ ｍ Ｌ／ Ｌ,戊 二醛的 最适浓 度为０３ ％ 。     

丝素蛋白溶液乳化性质的研究

探讨了丝素蛋白质在生物材料领域内作为微胶囊壁材应具有的相关理化性质。经钙盐解的丝素蛋白质溶液具有良好的乳化特性和稳定性,在pH 3～10范围内其乳化特性和稳定性变化不是很明显。随着丝素浓度的增加,丝素蛋白的乳化特性、起泡性及其稳定性增强,溶液呈乳白色均匀体系。丝素蛋白的这些良好性质为制备丝素蛋白微胶囊奠定了物质基础。     

家蚕丝素固定化葡萄糖异构酶的制备方法及其理化性质

脱胶蚕丝用稀碱溶液处理后制成多孔的碱化丝素 ,分别经物理吸附和戊二醛交联方法制得固定化酶Ⅰ和Ⅱ。每克固定化酶Ⅰ的总活力为 791 0 4U ,活力回收率为 5 2 0 6 % ,活力表现率为 72 2 7% ;每克固定化酶Ⅱ的总活力为 811 39U ,活力回收率为 5 3 6 7% ,活力表现率为 72 97%。蚕丝经高浓度氯化钙溶液溶解、脱盐等处理后制成丝素粉末 ,经吸附后用戊二醛交联固定了葡萄糖异构酶 ,制成固定化酶Ⅲ。每克固定化酶Ⅲ的总活力为 84 4U ,活力回收率为 5 5 2 7% ,活力表现率为 72 4 2 %。经对固定化酶性质的研究表明 :碱化丝素和丝素粉末均能较好地固定葡萄糖异构酶 ;最适温度比游离酶升高了 15℃ ;最适pH没有变化 ,有较强的抗蛋白质变性剂 (8mol/L尿素溶液中的活力在 80 %以上 )能力 ;各固定化酶的Km值在 4× 10 -2 ～ 5× 10 -2 mol/L范围内。实验还发现Co2 + 和Mg2 +离子为固定化酶的激活剂 ,Fe3 + 和Ca2 + 离子为抑制剂。     

人脑源性神经营养因子基因(hBDNF)在转基因家蚕丝腺中的特异表达

家蚕丝腺具有强大合成与分泌蛋白质的能力,利用其作为生物反应器生产高附加值外源蛋白有着广阔的市场前景。以人血白细胞基因组DNA为模板,扩增并克隆了人脑源性神经营养因子基因(hBDNF)核苷酸序列。序列分析表明,克隆的hBDNF核苷酸序列与已发表序列(GenBank登录号:NM_170735)的同源性为100%。随后采用家蚕丝胶基因(Ser1)启动子,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,将hBDNF构建到piggyBac转座表达载体并注射入家蚕早期胚胎,在G1代筛选获得了54头转基因阳性个体。经分子检测证实,hBDNF已整合到家蚕基因组并在丝腺有较高水平的特异表达。     

不同温度下环氧化合物与丝素蛋白作用形成的凝胶结构

用氨基酸分析、热分析以及溶解法分析了丝素蛋白与环氧化合物(PGDE)在不同反应温度下形成的凝胶的微观结构。结果表明:在较高温度下形成的凝胶(CFG),其丝素蛋白上的酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)和赖氨酸(Lys)与PGDE发生了交联,热分解峰出现在299.4℃,难溶解。CFG形成了环氧化合物与丝素蛋白大分子交联的三维网络结构。而在冰点以下形成的凝胶(PFG),其丝素蛋白没有发生交联反应,热分解峰出现在294.7℃,较容易溶解。PFG具有丝素分子之间氢键结合的三维网络结构。     

VB_6对家蚕氮代谢的影响

用人工饲料无菌饲育方式 ,分析维生素B6(VB6)对家蚕丝腺生长、血淋巴蛋白质浓度、血淋巴游离氨基酸组成变化及氮代谢终产物尿酸形成的影响。结果表明 :5龄期家蚕在缺乏VB6条件下 ,丝腺生长严重受阻碍 ,血淋巴蛋白质不能正常合成 ,使体内氨基酸转化利用率下降 ,氮代谢终产物尿酸的排泄量增加 ,血淋巴中部分游离氨基酸浓度下降 ,特别是合成丝蛋白质主要成分的Ala、Ser和Tyr等蚕体非必需氨基酸的组成比率显著减少 ,而Gly、Orn和Cysta等的浓度增加异常 ,导致血淋巴中游离氨基酸组成动态平衡破坏 ,显示蚕体内因VB6缺乏引起氨基酸代谢失调。