副鸡嗜血杆菌分离株致病性和生长特性试验

为研究副鸡嗜血杆菌河北省分离株W菌株致病性及生长特性,以不同剂量对80日龄公鸡进行致病性试验.对W菌株16 h培养物进行100倍稀释,采用微量点板计数法在不同培养时间进行细菌计数以绘制生长曲线.结果表明,试验鸡接菌量在1.11×104cfu/只时发病率可以达到100%,由生长曲线计算W菌株的世代时间为25.33 min.W菌株可能成为研制优良鸡传染性鼻炎疫苗的候选菌株.     

15株禽源空肠弯曲菌的分离鉴定及CheW基因序列分析

为了解四川地区禽源空肠弯曲菌流行菌株的感染情况及其Che W基因的变异特点,本研究于四川地区采集禽源盲肠及内容物对空肠弯曲菌进行分离并纯化培养,将分离菌株进行染色镜检、生化试验、16S r RNA基因PCR鉴定,并对分离株的Che W基因进行克隆测序,选取Gen Bank中登录的10株国内外空肠弯曲菌菌株与分离株进行Che W基因的序列分析及遗传进化分析。结果显示:分离株经纯化培养于哥伦比亚血琼脂培养基上后出现无溶血现象的菌落;革兰染色为阴性;生化代谢类型较稳定且与相关报道一致;16S r RNA基因序列与空肠弯曲菌(NCTC11168、YQ2210)等菌株同源性为99%以上。15株分离菌株的Che W基因的核苷酸序列与所选参考株一致性为98.68%,其推导的氨基酸序列同源性一致性在98.9%以上。其中鹌鹑源分离株CJ-1、CJ-2、CJ-4、CJ-13、CJ-14在第22位和161位均出现单个碱基的置换为A→G。本实验中分离菌株均为空肠弯曲菌且分离菌株之间Che W基因保守性强,遗传变异动态性较弱。本研究为空肠弯曲菌遗传变异方面的相关动态研究提供参考依据。     

一株猪源奇异变形杆菌的分离鉴定

试验通过对阿克苏某生猪养殖场腹泻仔猪肛拭子进行病原分离,并成功分离到一株细菌。细菌纯化后通过革兰氏染色观察其形态结构,并提取其DNA测序。分离菌株得到的基因序列标记为W1,通过DNA star生物软件将菌株W1与国内外菌株进行基因序列对比,并做同源性和进化树分析。结果表明:W1与国内外15株奇异变形杆菌的同源性为96.4%~99.4%,其中与W1同源性最低的是KT216564,与W1同源性最高的是AB272366。遗传进化树分析表明,分离株W1与南京株JF775415处于同一分支,属于奇异变形杆菌,该菌株的成功分离为阿克苏地区对奇异变形杆菌的研究提供参考。     

17株鹅源鼠伤寒沙门氏杆菌的分离鉴定与耐药分析

为了对鹅源鼠伤寒沙门氏杆菌进行分离、鉴定与耐药性分析,试验从病料中分离出菌株后采用生化试验、亲膜蛋白基因invA的PCR扩增、血清型鉴定、药敏试验对分离株进行了研究。结果表明:分离得到的17株菌株均为鼠伤寒沙门氏杆菌,这些分离株能发酵葡萄糖,不发酵乳糖,不利用蔗糖等,符合沙门氏杆菌生化特性;亲膜蛋白基因invA的PCR扩增得到大小为330 bp的目的条带;血清型鉴定显示,分离株血清型符合鼠伤寒沙门氏杆菌的血清型。药敏试验显示,82.35%的菌株对左氧氟沙星、氟苯尼考敏感,64.71%的菌株对卡那霉素敏感,64.70%的菌株对诺氟沙星敏感,58.82%的菌株对庆大霉素敏感,52.94%的菌株对新霉素敏感;64.71%的菌株对多西环素耐药,58.82%的菌株对链霉素耐药,35.29%的菌株对庆大霉素、卡那霉素耐药,29.41%的菌株对环丙沙星耐药;有11株分离株至少对2类抗生素耐药,其中7株分离株对3类及3类以上抗生素耐药。说明分离自鹅的鼠伤寒沙门氏杆菌对多种抗生素具有耐药性且出现多重耐药。     

鸡源凝结芽孢杆菌的分离鉴定及耐受性分析

【目的】试验旨在寻找1株性能稳定、环境耐受性强的凝结芽孢杆菌菌株,以在实际生产中发挥其替抗功能。【方法】本研究采集160日龄健康海兰褐蛋鸡的粪便样本,进行细菌分离纯化,并对分离菌进行形态学特征观察、生理生化鉴定、16S rDNA测序分析。通过绘制该菌的生长动力曲线确定其生长规律;利用耐酸、耐胆盐试验分析该菌株的耐受性;通过单因素试验对分离菌株的培养条件进行优化。【结果】分离菌在普通培养基上长出表面粗糙、不规则的灰白色菌落,镜检为杆状、芽孢端生的革兰氏阳性菌。结合生化试验及16S rDNA基因序列分析综合鉴定该菌株为凝结芽孢杆菌,命名为NJ001。生长动力曲线表明,7～24 h为该菌株的对数生长期,24 h活菌数达到顶峰,凝结芽孢杆菌NJ001的最佳培养时间为24 h;耐受性试验结果显示,该菌株pH 3.0温育2 h存活率为59.5%,pH为4.0时存活率达到87.6%以上,对酸有较强耐受力;0.3%胆盐处理2 h存活率为54.0%,胆盐浓度升至0.5%时存活率仍有50%以上,该菌对胆盐有较强的耐受性。单因素试验结果发现,该菌的最佳培养温度为40℃,接种量2%,初始pH 7.0,摇床转速...     

牛源化脓隐秘杆菌的分离鉴定与黔中金荞麦体外抑菌试验

为分离致病性牛源化脓隐秘杆菌并探究黔中金荞麦对该菌的体外抑制作用,本试验对采集于贵州省凯里市某养殖场疑似患牛呼吸道综合征的病死牛肺组织进行细菌分离、形态学观察、生理生化鉴定、分子生物学鉴定、药敏试验和致病性试验,并运用打孔法探究黔中金荞麦提取物对分离菌株的体外抑制效果。结果显示,分离菌株为革兰阳性短棒状杆菌,结合生理生化和PCR鉴定结果,确定该菌为化脓隐秘杆菌,系统进化树分析也显示,分离菌株与化脓隐秘杆菌的模式菌株处于同一分支;该分离菌株可致10只小鼠于24 h内全部死亡;其对头孢他啶、利福平、青霉素等7种抗菌药敏感,对环丙沙星中介,对克林霉素、左氧氟沙星、庆大霉素等8种抗菌药耐药;黔中金荞麦不同组织部位、不同处理方法的提取物对该分离菌株均具有一定抑制效果,其中地下部分70%乙醇超声30 min提取物的抑菌效果最好,抑菌圈直径为(28.13±0.25) mm,与头孢喹肟的抑菌效果相当。本试验首次从贵州地区分离到致病性牛源化脓隐秘杆菌,黔中金荞麦对该菌具有良好的体外抑制效果。本试验结果可为该肉牛养殖场疫病防控以及牛化脓隐秘杆菌感染的治疗和预防提供参考依据。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株的分离鉴定及耐药性研究

为了确定引起2018年5月江苏泰州某规模化养猪场育肥猪发病死亡的病原,本试验无菌采取病死猪肺脏组织,通过病原分离培养、染色观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,随后对分离菌株进行致病性和耐药性试验。结果显示,该分离菌株在病原分离培养过程中,需在含有NAD的培养基中才能生长;该分离菌通过革兰氏染色,显微镜观察细菌呈红色,可判定新分离的菌株为革兰氏阴性菌;根据生化试验和PCR结果可判定该分离菌株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌;PCR血清型分型结果显示,分离菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株;小鼠毒力试验结果显示,当分离株菌液浓度达到3×10⁸ CFU/mL时便可引起BALB/c小鼠死亡,浓度为2×10⁹ CFU/mL时对BALB/c小鼠的致死率达到100%,表明该分离菌株对BALB/c小鼠有较强的致病力及致死性;药敏试验结果表明,该分离菌株对头孢噻吩、头孢噻肟、氨曲南、头孢吡肟、头孢曲松、氧氟沙星等14种抗菌药物高度敏感,对氨苄西林中度敏感,对链霉素耐药。综合以上试验结果表明该猪场存在猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株感染情况。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株的分离鉴定及耐药性研究

为了确定引起2018年5月江苏泰州某规模化养猪场育肥猪发病死亡的病原,本试验无菌采取病死猪肺脏组织,通过病原分离培养、染色观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,随后对分离菌株进行致病性和耐药性试验。结果显示,该分离菌株在病原分离培养过程中,需在含有NAD的培养基中才能生长;该分离菌通过革兰氏染色,显微镜观察细菌呈红色,可判定新分离的菌株为革兰氏阴性菌;根据生化试验和PCR结果可判定该分离菌株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌;PCR血清型分型结果显示,分离菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株;小鼠毒力试验结果显示,当分离株菌液浓度达到3×10~8 CFU/mL时便可引起BALB/c小鼠死亡,浓度为2×10~9 CFU/mL时对BALB/c小鼠的致死率达到100%,表明该分离菌株对BALB/c小鼠有较强的致病力及致死性;药敏试验结果表明,该分离菌株对头孢噻吩、头孢噻肟、氨曲南、头孢吡肟、头孢曲松、氧氟沙星等14种抗菌药物高度敏感,对氨苄西林中度敏感,对链霉素耐药。综合以上试验结果表明该猪场存在猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株感染情况。     

青岛地区奶牛临床型乳房炎病原的分离鉴定与药敏试验

2004～2005年,对青岛地区7个奶牛场的171例临床型奶牛乳房炎进行了病原菌分离鉴定.结果共分离鉴定出15种174株菌,其中以葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为3个主要病原菌种,分离率分别为29.87%、27.58%、17.28%.并对3个主要病原菌种进行了抗生素药敏试验,结果表明:葡萄球菌对痢菌净高敏菌株为100%,对新敏素高敏菌株为83.33%;链球菌对痢菌净高敏菌株为60.53%,对新霉素高敏菌株为76.3%;大肠杆菌对痢菌净和新霉素的高敏菌株均达90%.而3种主要病原菌对传统治疗药物青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素有较强的耐药性.     

河南驻马店地区猪源肺炎克雷伯氏菌分离菌株生物学特性

为了分析驻马店地区猪源肺炎克雷伯氏菌分离菌株生物学特性,从驻马店地区不同养殖场中采集患呼吸道疾病猪肺脏、鼻拭子等病料组织74份中分离得到了43株肺炎克雷伯氏菌。采用人工感染小鼠致病性试验、PCR方法和K-B药敏纸片分别检测49株肺炎克雷伯氏菌的致病性、血清型及耐药性。结果显示,30株肺炎克雷伯氏菌对小鼠具有很强的致病性;43株分离菌株以K5、K20为主要流行血清型,分别占分离菌株的37.2%、27.9%;43株分离菌株对氨苄西林、阿莫西林、大观霉素等7种药物耐药性较高,耐药率在51.2%以上,对其他药物的耐药率在18.6%~234.9%之间,且呈现多重耐药性,耐10、9种药物分离菌株最多,分别占分离菌株的25.6%、27.9%。本试验为该地区猪源肺炎克雷伯氏菌病的防治提供理论基础。     

鸡传染性支气管炎病毒分离株核衣壳基因克隆、序列分析和真核表达

根据GenBank公开序列自行设计一对引物，采用RT—PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）W和C9001分离株完整的核衣壳（N）基因，并将其克隆至pMD18-T载体进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，扩增的2个IBV分离株核衣壳基因片段长度均为1230bp，编码409个氨基酸，彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为88．0％和89．5％，与GenBank中有代表性的参考毒株相应基因核苷酸和氨基酸序列比较显示，w株核苷酸序列与GenBank中的广东分离株（AY646283）同源性最高，为94．1％，氨基酸序列同源性为94．6％；与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．1％～88．0％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～90．7％之间；C9001株与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．4％～99．8％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～99．8％之间。从核衣壳基因编码的氨基酸序列的系统进化树可见，W株与C9001株处于不同的进化分枝，亲缘关系较远。同时将核衣壳基因构建于真核表达质粒pVAX1中，用脂质体法将重组质粒转染入COS-7细胞中，间接免疫荧光检测出核衣壳蛋白的体外表达。研究结果为进一步研究IBV核衣壳蛋白的结构与功能以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

适用于猪场沼液处理的好氧反硝化菌筛选及其脱氮特性评价

试验旨在筛选适合于猪场沼液处理的好氧反硝化菌。从活性污泥中分离获得 16 株好氧反硝化菌,其中菌株 ZH-14 的总氮(TN)和硝酸盐氮的去除效果最好,分别达到 50.73%和 99.99%。该菌株经过平板形态观察、功能基因和 16S rDNA 基因分析,鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。结果表明:菌株 ZH-14 在硝酸钾为唯一氮源培养基中生长时,48 h 后硝酸盐氮与 TN 的降解率分别为 100%和41.76%;以亚硝酸钠为唯一氮源培养时,亚硝酸盐氮降解率为 99.24%;以氨氮为唯一氮源培养时,氨氮的降解率达 94.1%;使用菌株 ZH-14 处理畜禽沼液,当其接种终浓度为 107 CFU/mL 时,经过 48 h 处理,氨氮、硝酸盐氮和化学需氧量的去除率分别为 54.4%、97.7%和 77.9%。综上表明,菌株 ZH-14 具有较强的反硝化和处理猪场沼液的能力,具有良好的应用开发前景。     

微生态制剂中环状芽孢杆菌的分离鉴定及消毒技术评价

[目的]分离微生物发酵菌液中耐热的芽孢杆菌,并分析几种常用消毒技术对环状芽孢杆菌的效果评价。[方法]通过100 ℃热处理30 min的方法从微生物发酵菌液中筛选耐热菌株,采用观察菌落形态与培养性状、革兰染色、生化鉴定及分子生物学鉴定等技术对其进行鉴定,构建系统发育树进行基因序列比对分析,并采用热空气处理、紫外线照射、过氧乙酸消毒技术对其进行消毒处理。[结果]从微生物发酵菌液中分离筛选出1株耐热细菌,经鉴定该菌株为环状芽孢杆菌;比较不同消毒技术对微生态制剂中环状芽孢杆菌的消毒效果发现,120 ℃干热条件下处理菌液60 min,120 ℃湿热条件处理菌液10 min,紫外线（辐射强度达到110 μW/cm²）照射时间超过140 min,过氧乙酸体积分数大于2.75%的情况下,均可有效抑制环状芽孢杆菌生长。[结论]从微生物发酵菌液中成功分离到环状芽孢杆菌,其消毒效果试验为后续安全生产微生态制剂、优化菌种发酵条件提供了参考数据。     

葡萄枝叶自然青贮中优选乳酸菌的分离与鉴定

本研究旨在对葡萄枝叶青贮饲料中天然附着优势乳酸菌进行分离培养和鉴定,为葡萄枝叶资源的饲料化利用提供可靠的乳酸菌资源。利用分子生物学鉴定法(16S rDNA序列分析)与传统的微生物鉴定法对分离出的乳酸菌进行鉴定,最终得到5株乳酸菌菌株,其中Q1菌株鉴定为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenterica),Q2和Q5菌株鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium),Q3菌株鉴定为铅黄色肠球菌(Enterococcus casseliflavus),Q4菌株鉴定为海氏肠球菌(Enterococcus hirae)。所筛选出的乳酸菌除L.mesenterica在pH为9时不能生长,其余菌株均能在pH 3～9,4℃～45℃,3%和6.5% NaCl浓度环境下生长;其中E.hirae菌株在培养至24 h后其菌液pH可达到4.11,OD值为1.42,表现出最强的生长及产酸能力。     

2种侵入型乳酸菌生物学特性的研究

本研究旨在选择性能优良的乳酸菌表达载体，为后期研发新型乳酸菌活菌疫苗奠定基础。试验对诱导型和组成型表达的2种侵入型乳酸菌NC8-pSIP409-FnBPA和NC8-pLc23-FnBPA的生物学特性进行研究，从酸耐受性、胆盐耐受性、生长曲线、质粒稳定性、抑菌试验以及药敏试验这6个方面进行鉴定。结果表明，这2种乳酸菌在pH为2.5的酸应激条件下，存活率均达到125%，在质量分数为0.5%的高胆盐溶液中，存活率高达200%。2种类型的乳酸菌均能在9 h时达到平台期，生长性能优良，其中组成型表达菌株NC8-pLc23-FnBPA达到平台期时的D_{600 nm}值为1.3，高于诱导型表达菌株，生长性能优于诱导型菌株。pH生长曲线结果表明，乳酸菌产酸性能无明显性差异，在10 h时，溶液中的pH均降为3.5，产酸能力较强。2种类型乳酸菌的菌体和上清对常见致病菌均有不同程度的抑菌作用，其中菌体的抑菌效果优于上清，且表达FnBPA蛋白的组成型菌体的抑菌效果强于诱导表达型。2种侵入型乳酸菌均对绝大多数的抗生素敏感性高，具有一定的生物安全性。2种类型的乳酸菌的质粒稳定性均>90%。本试验发现诱导型乳酸菌NC8-pSIP409-FnBPA与组成型乳酸菌NC8-pLc23-FnBPA具有相似的生物学特性，其中组成型乳酸菌表达蛋白更方便，无需添加诱导肽便可自主表达，更适合作为新型乳酸菌活菌疫苗的受体菌株，为后期乳酸菌活菌疫苗的研制提供便利。     

血清4型禽腺病毒W株的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解血清4型禽腺病毒（fowl adenovirus genotype 4,FAdV-4） W株全基因序列、结构特征及遗传变异情况,本试验采集发病鸡肝脏和肾脏进行PCR鉴定、SPF鸡胚和鸡胚肝细胞分离、电镜观察证明该病毒为FAdV-4,TCID₅₀为10^-7.2/0.1 mL;电镜观察可见70 nm左右的二十面体无囊膜病毒颗粒;经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚后能明显抑制鸡胚发育出现侏儒胚,接种10 d内死亡率达100%;进一步对W株进行全基因组扩增及序列分析。病毒序列分析结果显示,其全基因组长为43 591 bp,共有60个开放阅读框,W株与GenBank中公布的FAdV-4参考毒株全基因组核苷酸序列同源性为98.4%~100%,其中与标准株非致病性毒株ON1（登录号：GU188428.1）的同源性为98.4%,主要缺失ORF19（脂肪酶基因）和ORF27;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Fiber-1和Fiber-2基因分析发现,W株与近几年国内分离株亲缘关系较近,与ON1株及其他国外分离株差异较大。综上说明,该分离株具有高致病性,与国外分离株存在较大差异,为进一步分析FAdV-4的毒力增强机制提供了基础依据。     

1株牦牛瘤胃源无色杆菌的鉴定及生物学特性评价

【目的】对分离得到的1株牦牛瘤胃源菌株进行鉴定和生物学特性分析,开发新型动物源益生菌。【方法】通过显微镜和菌落观察试验菌株的形态学特征,采用VITEK2微生物生化自动鉴定仪鉴定其生化特性,并对其16S rDNA进行PCR扩增、相似性比对和遗传进化树构建。进一步对其生长性能、产酸能力、自凝聚、疏水性、溶血性和耐药性、耐酸耐胆盐及胃肠环境适应性等生物学特性进行研究。【结果】试验菌株经过形态学、分子鉴定和16S rDNA扩增鉴定为无色杆菌（Achromobacter）,命名为无色杆菌YKS2。该菌株2 h进入对数生长期,持续增长至20 h后开始出现平台期并缓慢下降。发酵48 h后pH未降低,说明该菌株不具产酸性能;自凝聚力为28.7%,表面疏水性在氯仿中达到77.1%,其他溶剂均>60.0%,平均达到60%以上,表明细菌有一定的黏附能力;在血琼脂平板培养48 h后未出现溶血环;通过K-B法测试了对14种抗生素的敏感性,发现其对常见的12种抗生素敏感;在pH 2.0的培养基中不能存活,在pH 4.0的培养基中存活率为61.4%;对0.1%和0.3%胆盐培养基有较高的耐受;在人工胃液重悬后培养3 h的细菌存活率为78.18%,在人工肠液中处理4、8 h后,与对照组相比,菌落数极显著增长（P<0.05）,说明YKS2菌株能够耐受一定程度的人工肠液。【结论】牦牛瘤胃源YKS2菌株为肠杆菌科无色杆菌亚种,无溶血、产酸及耐强酸特性,非耐药菌株,增殖性能较好,具有耐胆盐、耐胃肠液、自凝聚及表面疏水特性,可作为一种候选益生菌菌株进行进一步的评价和研究。     

口蹄疫病毒株China/99 P3区一级结构及与参考毒株的比较分析

用RT－PCR法，以口蹄疫病毒China/99感染的牛舌水泡皮为材料，扩增目的cDNA，与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株，再经重组质粒电泳、PCR和EcoR1酶切鉴定。序列测定和分析结果表明，猪源毒在3A基因内缺失10个密码子，与牛源毒的核苷酸和氨基酸序列差异较大。A－G和T－C的转换率较高，而且A－G转换导致氨基酸变异的几率大于T－C转换，它们是影响氨基酸稳定的因素之一。China/99P3区编码产物在第8、120、121、127、132、193、493、501和538位具有特征性氨基酸，可能与该毒株的表型如毒力等有关。3A基因突变率较高，3B、3C和3D较低，3D最为保守，这对维持3C和3D蛋白酶和3B的引物功能至关重要。     

1株产碱性木聚糖酶的芽胞杆菌的分离鉴定及其相关研究

分离到1株产碱性木聚糖酶的革兰氏阳性菌株,通过菌落形态及16srDNA序列同源性分析,确定该菌株为短小芽孢杆菌。生长条件和产酶条件研究结果显示,最适温度和pH分别为50℃和pH8·0。培养基优化试验显示在有机和无机混合氮源条件下(NH4NO30·57%;牛肉膏1%;蛋白胨0·5%;酵母提取物0·5%;木聚糖0·5%)木聚糖酶产量达到最高(180U/mL)。酶学试验表明最适反应条件为50℃,pH8~9;在pH9的条件下,孵育120min时仍具有75%的活力,表明该酶具有较强的碱耐受性。