浙江省鸭疫里氏杆菌的优势血清型

鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)主要引起1～7周龄鸭发生鸭传染性浆膜炎.其中以2～3周龄的鸭最易受感染,发病率达20%以上,死亡率在25%～57%,其主要症状为困倦、咳嗽、共济失调、歪颈等.该病还会引起纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎,是目前养鸭业中最为严重的细菌性传染病,给养鸭业造成重大的经济损失.因此,该病的研究受到广泛的关注和重视,北京、福建、海南等地学者对该病进行了大量的研究,并研制出了疫苗及兽药等[1～3].但由于该病原菌的血清型国内外报道就有21种之多,各个血清型之间缺乏交叉保护,这给该病的控制带来了困难.因此,探明各地该病流行的主要血清型[1～3].可为该病的防治提供重要的科学的依据.我们自1999年以来,先后多次对浙江省的杭州、桐乡、绍兴等地各品种的病鸭中分离的RA,进行了血清型鉴定.现报道如下.     

鸭疫里氏杆菌(2型)灭活疫苗的研制

以 2型鸭疫里氏杆菌江西分离株为菌种 ,制备了含不同菌数的 2型铝胶疫苗 ,分别经颈背部皮下接种 5日龄雏鸭 (0 .5mL/羽 ) ,免疫后 5 ,1 0 ,1 5d分别用同源菌株攻击 ,保护指数为 60左右 ;于 2 5日龄第 2次免疫 ,二免后第 5d的保护指数达 91 .7～ 1 0 0。本试验还对鸭疫里氏杆菌的培养条件、灭活条件进行了优化。     

应用抑制性差减杂交技术筛选锦橙CTV应答基因

【目的】探讨易感柑橘衰退病病毒（Citrus tristeza virus,CTV）品种锦橙CTV应答分子机理,筛选和分析CTV应答基因。【方法】以嫁接CTV强毒株TRL514的锦橙阳性材料叶片为试验方（Tester）,用嫁接无毒枝条的CTV阴性锦橙叶片为驱动方（Driver）,构建CTV侵染的锦橙的正向差减文库。【结果】随机挑选850个阳性克隆测序,其中742条测序成功,去除载体片段和接头序列后得到有效EST 692条。将所有EST序列对应到柑橘的预测基因组转录物,共涉及137个柑橘基因。应用BLAST2GO对这些特异性表达的基因进行功能归类和KEGG分析。结果表明,受CTV侵染的影响,锦橙能量代谢相关基因上调明显,与光合器官碳固定、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢等途径相关的EST出现频率较高。另外,与抗逆防御以及苯基丙氨酸合成、类苯基丙烷代谢、类胡萝卜素合成等与植物防御素类物质合成密切相关的代谢途径相关基因较多。【结论】由于CTV的侵染,CTV易感品种锦橙基础代谢改变明显,须通过增强能量代谢和提高自身防御能力来维持自身生长和发育。     

Ⅰ型鸭疫里氏杆菌基因组质粒表达文库的构建

提取Ⅰ型鸭疫里氏杆菌的基因组DNA,以KpnⅠ进行酶切,回收、纯化0.5~6 kb之间的DNA片段,与经同样酶切并去磷酸化的质粒载体pQE30连接,转化BL21(DE3)感受态细胞,从而构建了Ⅰ型鸭疫里氏杆菌基因组的质粒表达文库,经试验表明其库容量为12 000个。随机挑选的阳性克隆提取质粒酶切后证明有外源DNA片段的插入,该文库为应用体内诱导抗原技术筛选鸭疫里氏杆菌的体内诱导基因奠定了基础。     

应用抑制性差减杂交技术构建副猪嗜血杆菌基因组差减文库

为构建副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)间的差异表达基因文库,采用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)分析SW124和H465菌株细菌基因组的表达差异,并进行两轮差减杂交和两次PCR扩增,将第2次PCR产物与pMD19-T载体相连,转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞并进行文库扩增和蓝白斑筛选,RT-PCR鉴定差异表达文库。结果共获得327个阳性克隆,筛选100个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2 000 bp大小的片段。差异DNA差减文库的构建为进一步筛选、克隆HPS特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。     

雏鸭爆发鸭疫里氏杆菌的诊治

鸭疫里氏杆菌病的是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella Anatipestifer,RA）引起的鸭、鹅、火鸡等多种禽类的一种急性或慢性传染病。1-7周龄鸭最易感,发病率为5%-90%,死亡率高达80%,是目前危害养鸭业的主要传染病之一。病鸭主要表现为精神萎靡、缩颈、共济失调,主要根据临床症状诊断疾病,可以通过实验室检查确诊。鸭疫里氏杆菌极易产生耐药性,主要以预防为主。     

鸭疫里氏杆菌的耐药性情况调查与思考

临床中最常见的是鸭疫里氏杆菌是引起鸭传染性浆膜炎的病菌。由于鸭疫里氏杆菌极易产生耐药性,常使首次使用的抗生药物治疗效果不佳,要反复不断更换药物,既增加了药物成本又常导致病死率增加,给广大养殖户造成了重大的经济损失。对鸭疫里氏杆菌的耐药性情况调查,找出问题,提出解决对策,能最大程度减少养殖户的经济损失。     

江西地区鸭疫里氏杆菌微生物学特性的研究

从江西省鸭鹅中分离到 6 0株鸭疫里氏杆菌 ,采用凝集试验和琼脂扩散试验对其血清型进行了鉴定 ,结果表明江西存在 5个血清型的鸭疫里氏杆菌 (2、JX1、JX2、JX3、JX4型 ) ,2、JX1、JX2型为目前江西地区主要流行的血清型。 80 %以上分离株对青霉素、痢特灵、氨苄青霉毒和氯霉素高度敏感 ,对阿米卡星、庆大霉素和链霉素耐药。不同血清型鸭疫里氏杆菌的培养特性较为一致 ,但部分生化特性存在较大差异     

鸭疫里氏杆菌油乳剂灭活疫苗的研制及应用

用从河北某肉鸭场分离的鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA)菌株,经人工感染雏鸭后分离提纯,通过增菌培养、甲醛灭活后制成油乳剂灭活疫苗。经无菌检验、安全检验、效力检验合格后,在该肉鸭场及周围几个鸭场进行田间试验。皮下免疫7日龄雏鸭0 5ml/只,试验表明,该疫苗对鸭传染性浆膜炎的预防效果良好,保护率达90%以上。     

抑制性消减杂交技术在植物基因克隆中的应用

抑制性消减杂交(SSH)技术是近十年来才发展起来的一种克隆差异新基因的快速、高效的技术。本文通过与其他几种目前主要的差异基因分离技术的比较,介绍了SSH技术基本原理、基本过程及优缺点,并对SSH技术在植物基因研究应用上的最新进展进行评述。     

抑制消减杂交在热带作物研究中的应用

介绍了抑制消减杂交(SSH)技术的原理和步骤以及在热带作物发育、逆境胁迫或人为诱导条件下不同组织中差异基因表达和突变等研究方面的应用。     

PCR法快速检测鸭疫里氏杆菌的研究

根据Gen-Bank中25株鸭疫里氏杆菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,在其高度保守区设计了一对特异性引物,成功地建立了鸭疫里氏杆菌的快速、准确PCR检测方法。RA参考菌株J04(2型)、J07(JX1型)均能扩增出67lbp的特异性目的条带,而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌、鸭源葡萄球菌的扩增结果均为阴性。PCR产物经EcoRI酶切鉴定得494bp和177bp两个预期条带。最低检出基因组DNA浓度为800fg。用全菌体进行PCR时,本实验室分离鉴定的60株RA均能够扩增出特异性目的条带。25份临床疑似病例的分离菌株的PCR扩增阳性率与生化鉴定率完全一致。该方法表明能从痫料组织培养8h的混合菌群中快速、准确地检测到RA,可用于RA的快速诊断和流行病学调查。     

应用抑制消减杂交技术克隆鼻咽癌转移调控基因

目的：分离并鉴定高低转移表型不同的人鼻咽癌细胞株差异表达cDNA序列,了解鼻咽癌转移抑制基因或具有抑制活性的核苷酸序列。方法：以具有高低转移潜能不同的人鼻咽癌细胞株为研究对象,应用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）和T／A克隆法构建差异表达cDNA消减文库,对差异表达的cDNA进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建人鼻咽癌细胞克隆株差异表达cDNA消减文库,从随机测序10个克隆中获得6个在低转移鼻咽癌细胞株中高表达cDNA序列,它们都与已知的人类基因片段具有高度同源性。结论：应用抑制消减杂交技术,从一对具有高低转移表型差异的鼻咽癌细胞株中获得6条可能与肿瘤转移抑制相关的cDNA序列,它们可能在维持肿瘤细胞的稳定和抑制肿瘤转移中起重要作用。     

多花水仙花瓣抑制消减杂交cDNA文库的构建及分析

采用抑制消减杂交(SSH)技术,以多花水仙的栽培品种‘黄花水仙2号’黄色花瓣和‘金盏银台’白色花瓣的cDNA分别作为测试子和驱动子,建立正、反向抑制消减杂交cDNA文库.随机挑选正、反向文库各216个阳性克隆测序,对已知功能的uniESTs进行基因本体论(GO)分类分析,荧光定量PCR检测部分可能参与色素形成的uniESTs.结果表明:水仙花色差异表达正、反向消减文库经检验质量可靠,为分离花色形成相关基因奠定了基础;GO功能分类分析显示,水仙花色差异可能受到多个代谢途径的影响;经初步筛选得到11个与水仙花色形成相关的uniESTs,为进一步克隆基因全长和功能验证提供参考.     

鸭疫里默氏杆菌PCR快速检测方法的建立与应用

根据GenBank中16株鸭疫里默氏杆菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,在其保守区设计了一对特异性引物,建立了PCR方法,并对已有5个血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌和6株临床分离未定型的里默氏杆菌菌株,及病死鸭病料组织进行了检测。结果表明,5个血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌和6个未定型的里默氏杆菌的DNA都可扩增出592 bp的特异目的条带,而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌的扩增结果均为阴性,在对11只不同鸭场病死鸭各种组织的检测中,脑的检出率为5/11(高于细菌分离的3/11),肝脏的检出率为4/11(高于细菌分离的3/11),心血的分离率为3/11(等于细菌分离的3/11),其它脏器未检测到里默氏杆菌。分别将鸭疫里默氏菌基因组DNA和菌落提取液进行10倍梯度稀释,基因组DNA的最小检出量为10 pg,菌落最小检出量为10 CFU/m l。此法可用于快速鉴定鸭疫里默氏杆菌,也适用于病料的直接检测。     

2型鸭疫里氏杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

以2型鸭疫里氏杆菌裂解物作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的兔抗鸭IgG抗体为第二抗体,以TMB为显色剂,成功地建立了检测鸭血清中2型鸭疫里氏杆菌抗体的间接EL1SA方法。经检测表明该方法特异性强,敏感性比常规的试管凝集试验高320倍。以该方法对免疫2型鸭疫里氏杆菌灭活油乳剂疫苗的试验鸭进行抗体水平的跟踪测定,发现试验鸭于免疫后7d开始产生抗体,28d达到最高峰,然后开始下降,于免疫后56d其抗体水平仍高于免疫后14d的水平。     

鸭疫里氏杆菌-大肠杆菌二联四价苗研究

从浙江省分离鉴定的67株鸭疫里氏杆菌、43株大肠杆菌中,筛选出免疫原性良好的优势血清型RA二株RA-J(Ⅰ型),RA-Y(Ⅱ型),Escherichia coli二株Ed6(O78)、Ed15(O1)作为制苗菌株,采用改进的液体培养工艺,使RA和E.coli含菌量分别稳定在(220~260)×1010cfu/ml和(230~280)×1010cfu/ml,然后加佐剂研制出鸭疫里氏杆菌—大肠杆菌二联四价苗。免疫剂量1 ml,对RA和E.coli的攻毒保护率分别达95.8%和91.7%;疫苗保存1年,经野外扩大试用,效果良好。     

A/J小鼠感染猪链球菌2型后脾脏消减cDNA文库的构建及相关差异基因表达分析

为了分离与猪链球菌2型感染密切相关的基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建了8周龄A/J小鼠感染猪链球菌2型后的脾脏消减cDNA文库,并对其中169个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后共获得110条差异表达序列标签(EST)。利用GenBank的BLAST软件分析比较核酸和蛋白质同源性,发现共有36个基因与这些EST具有高度的同源性,它们分别参与细胞成分、免疫、信号转导、凋亡、转录等重要功能。这些差异表达基因主要有ATP/GTP结合蛋白1(Agtpbp1)、天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸盒多肽5、核蛋白p68、ATP-依赖RNA解旋酶、真核生物转录因子2亚基(Eif2s2)、Na+/K+-ATP酶转运β3多肽、溶菌酶1、溶菌酶2等基因。结论:这些差异表达基因在猪链球菌2型感染过程中可能发挥重要功能。