D型产气荚膜梭菌最佳产毒时间及毒素大小的确定

本实验测定了D型产气荚膜梭茵在肝片肉汤培养基的生长曲线、培养液的pH值变化曲线以及不同培养时间提取的毒素液的蛋白质含量,并用SDS--PAGE电泳方法检测了所提毒素为α、ε毒索。结果表明,D型产气荚膜梭茵在肝片肉汤培养基培养18h是其α、ε毒素的最佳产毒时间,毒素大小分别是43kD、35kD。     

D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的研制及保护效果的评价

为研制更有效的预防家畜D型产气荚膜梭菌肠毒血症的疫苗,本研究采用D型产气荚膜梭菌标准菌株增菌培养,经自制产毒培养基高效产毒,制备成D型产气荚膜梭菌氢氧化铝类毒素疫苗和白油类毒素疫苗。通过不同剂量疫苗免疫绵羊的攻毒保护试验和免疫绵羊的抗体水平监测,评估疫苗的免疫保护效果。结果表明:D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗安全性良好,氢氧化铝苗和白油苗对绵羊有效免疫剂量均为4 m L(外毒素对小鼠半数致死量为2-6.4/m L),绵羊接种一个有效免疫剂量后,氢氧化铝疫苗免疫保护周期为6周以上;白油疫苗免疫保护周期为21周以上。本研究结果表明两种疫苗均具有良好的应用前景。     

A型产气荚膜梭菌α-毒素生产发酵工艺

利用全自动机械搅拌发酵罐对A型产气荚膜梭菌α-毒素的生产发酵工艺进行研究。设立温度、pH值和发酵时间3个因素,采用L9(34)正交优化设计方法,确定各因素对A型产气荚膜梭菌α-毒素产毒量的影响程度,并绘制发酵过程细菌生长曲线和产毒曲线。结果显示,pH对细菌的产毒量影响显著(0.01P0.05),发酵时间、温度对细菌产毒量影响不显著(P0.05)。结果表明,pH7.0、发酵温度43℃、发酵时间6 h为A型产气荚膜梭菌α-毒素生产发酵工艺条件。     

A型产气荚膜梭菌最佳产毒时间的确定

测定了A型产气荚膜梭菌在庖肉培养基的生长曲线、培养液的pH值变化曲线以及不同培养时间提取的毒素液的蛋白质含量、溶血活性及卵磷脂酶活性。结果表明，A型产气荚膜梭菌在庖肉培养基培养8h是其a-毒素的最佳产毒时间。     

C型产气荚膜梭菌合成培养基使用参数及培养毒素浓缩工艺优化

确定C型产气英膜梭菌合成培养基使用参数及建立配套的毒素浓缩工艺。比较不同pH值、灭菌温度、配制用水的合成培养基及其不同培养时间和温度下培养产气荚膜梭菌CVCC60102株的毒力;按毒素的分子量及超滤膜的截留分子量设计并比较2种不同浓缩工艺的毒素收获率及透出液的毒力。结果表明,pH值为8．0～8．4、灭菌方式为116℃30min、配制用水为去离子水时产毒最佳,毒力达到500—1000MLD／mL;合成培养基培养产气英膜梭菌CVCC60102株18h后毒力达500—1000MLD／mL,随着时间的延长,毒力不再增强;培养温度为36℃或37℃时,产毒效果最佳;不同截留分子量的超滤膜浓缩,10ku截留分子量的收获率为68％,其透出液静脉接种0．2mL,小鼠2／2死亡;而8ku收获率达80％,其透出液静脉接种0．2mL,小鼠0／2死亡。因此8ku截留分子量膜包适宜对C型菌培养毒素的浓缩。上述结果为C型产气荚膜梭菌合成培养基的应用提供了数据支撑。     

产气荚膜梭菌和腐败梭菌在厌氧菌基础培养基中的生长特性

测定了产气荚膜梭菌B型、D型和腐败梭菌在新研制的厌氧菌基础培养基中的生长曲线和产毒能力等特性。结果表明,这些细菌可以在新培养基中良好生长和产毒。产气荚膜梭菌B 型经2 h 的适应期后,很快进入对数生长期,培养到8 h细菌密度接近最高值,OD630为4.329;经检测,培养4 h~24 h的细菌所产生的毒素(培养物上清)1μL~2μL可致死KM小鼠。产气荚膜梭菌D型的生长速度也较快,无适应期就直接进入对数生长期,培养到12 h 时细菌密度最高, OD630 为1.75;细菌最佳产毒期在6 h~14 h,培养物上清0.5μL~0.65μL可致死KM小鼠。腐败梭菌生长速度较慢,经6 h的适应期后,才进入对数生长期,培养到14 h时细菌密度最高,OD630为1.335;细菌毒力在培养后的6 h~24 h内10μL菌液可达到在24 h内致死KM小鼠的效果。     

A型产气荚膜梭菌合成培养基使用参数及培养毒素浓缩工艺研究

经过对A型产气荚膜梭菌合成培养基pH值、灭菌方式和配制用水进行优化,确定最适pH值为8.0～8.5,灭菌方式为116℃30min,配制用水为去离子水。合成培养基培养产气荚膜梭菌CVCC37株6小时后毒力达50～100MLD/ml,随着时间的延长,毒力不再增强;培养温度为36℃或37℃时,产毒效果最佳。比较不同截留分子量的超滤膜浓缩效果,10Ku截留分子量的收获率为40%,其透出液静脉接种0.2ml,小鼠2/2死亡;而8Ku收获率达75%,其透出液静脉接种0.2ml,小鼠0/2死亡。因此,8Ku截留分子量膜包适宜对A型菌培养毒素的浓缩。     

G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备及其免疫保护效果的评价

为研制G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,本研究将G型产气荚膜梭菌菌株(7a9-2、D3-2)增菌培养后接种产毒培养基高效产毒,除菌后获得外毒素,经粗提后进行SDS-PAGE检测。结果显示：制备的G型产气荚膜梭菌外毒素含有α、NetB两种毒素蛋白。将两株G型菌株所产外毒素经2倍倍比稀释后经腹腔注射小鼠,检测外毒素的致病性,结果显示7a9-2菌株所产外毒素毒力较强,可作为疫苗候选株。因此选择7a9-2菌株制备外毒素,并经甲醛灭活后制备G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,经检验合格后免疫三黄鸡。免疫后5周内,每周随机选取10只鸡采血分离血清,采用ELISA方法检测鸡血清中的抗体效价。结果显示,免疫组鸡血清稀释100倍后,一免组鸡的抗体效价最高可达6.83log2,二免组鸡抗体效价最高可达8.34log2,免疫后鸡体内可产生较高水平的抗G型产气荚膜梭菌的抗体。免疫后实验鸡通过口服鸡球虫卵囊和G型产气荚膜梭菌菌液进行攻毒试验,结果显示,攻毒后免疫组鸡肠道病变程度和发病率均显著低于对照组(P<0.05)。在整个实验过程中观察各组鸡的生长情况,计算鸡平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F...     

接种温度对破伤风梭菌产毒的影响

将破伤风梭菌罗马TL－64008株经2次扩菌后，接种于预先设置的15、20、25、30和35℃双胨培养基上，然后均置于35℃培养132h。结果，在3批破伤风类毒素生产的试验中，其平均毒力（絮凝单位，Lf）依次为89．3、84．3、85．0、91．7和101．7Lf/mL，表明接种时温度以35℃产毒结果最佳，并以接种时温度下降而依次递减。     

仔猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌的毒力研究

为了确定不同纤毛抗原的猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌引起试验动物发病的最小菌(毒)含量,用不同菌数的E.coliC83549(K88)、C83644(K99)和C83710(987P)菌株培养物对出生18～24h的仔猪进行攻毒,用不同毒素含量的C型产气荚膜梭菌毒素分别对出生18～24h的仔猪和家兔进行攻毒。结果表明,引起仔猪发病的大肠杆菌三种菌株的最低含量均为150×108CFU,C型产气荚膜梭菌引起1日龄仔猪和家兔发病的最低毒素含量分别75和80小鼠MLD。     

A型产气荚膜梭菌重组菌株BL21（DE3）

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素突变基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下α毒素突变基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因且基因序列和阅读框架正确。同时以IPTG为诱导剂诱导α毒素突变基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果是：培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5 h,此时重组菌株pXMCPA02蛋白表达量为35%。从而实现了α毒素突变基因的高效表达,为A型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌分离株的生物学特性研究

对发酵黄芪样品中分离的1株产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌的生物学特性进行了检测,试验结果表明,菌株在10℃~60℃环境均能生长,最适生长温度为35℃~40℃。pH5.0~8.0培养基均适宜菌株生长,其中最适pH为6.0。在37℃环境200r/min振荡培养的生长曲线在0~4h为延迟期,4h~12h为对数期,12h~24h为稳定期,24h以后为衰亡期。细菌37℃培养32h开始产生芽胞,在培养72h时芽胞形成率达到80.67%。菌株对多数抗菌药物敏感,且安全性良好。该菌株适应性强,生长条件较为宽松,这为其开发应用提供了依据。     

不同培养温度对嗜酸乳杆菌BL-A1生物学特性的影响

采用MRS培养基对嗜酸乳杆菌BL-A1菌株在30℃和37℃不同培养温度下的生长、产酸、耐盐、耐胆酸盐及培养物抗菌性等部分生物学特性进行了研究。结果表明,该菌在37℃培养时具有繁殖速度快、产酸能力强的特点,而在30℃培养时具有更强的耐盐、耐胆酸盐能力。两个不同温度培养下的嗜酸乳杆菌的代谢物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都具有很强的抑制作用。     

马棘种子发芽及人工加速老化测定标准化研究

以水土保持植物马棘Indigofera pseudotinctoria种子为研究对象,针对其质量检测存在的问题,确定适宜的发芽和加速老化条件。在发芽试验中,设置15~25、15~30、15~35、20~30、20~35、25~35、20、25、30、35℃共10种温度处理,光照设8 h光照和24 h黑暗2个处理;在加速老化试验中,设置39、41、43、45℃共4个温度水平和24~96 h之间的7个时间处理。研究结果表明:不同光照和温度条件下马棘种子发芽率不同,在8 h光照和24 h黑暗适宜发芽的条件均为恒温25℃或变温20~30℃,种子发芽对光照不敏感,但黑暗条件会导致种苗黄化,温度和光照间存在互作效应。初次发芽计数时间为7 d,末次发芽计数时间为14d。加速老化最适条件为43℃、72 h,且老化温度和时间存在互作效应。     

B型诺维氏梭菌产毒素主要影响因子研究

为了掌握B型诺维氏梭菌同宝菌株(TB05)产毒特性,应用不同培养基、不同p H和不同培养时间进行最佳产毒比较试验。结果表明,该菌在含1.0%葡萄糖的VF培养基中37℃72h产毒达最高点,碳原比例及p H对本菌的生长及产毒具有较大的影响,1%葡萄糖、p H 8.0~8.4最适于本菌产毒。     

不同样品保存液和保存条件对动物细胞体外培养的影响

本研究取矮脚油鸡7日龄胚胎作为试验材料,用MEM、全培养基和PBS 3种不同的液体对鸡胚组织进行保存,同时在不同保存温度条件下按不同保存时间梯度,采用组织块贴壁培养法进行体外细胞培养。对细胞的保存液变化,细胞形态、细胞生长等情况进行研究,分析样品保存条件对细胞体外培养和细胞系构建的影响。结果发现,4 ℃保存的组织块培养效果明显优于室温保存;无论在4 ℃或常温,基础培养基保存的组织块培养效果明显优于保存液,全培养基效果最好。常温保存48 h以内3种保存液培养效果差别甚微,48 h后培养效果均急剧下降,96 h后保存在PBS中的组织失活,未长出细胞。本研究结果为建立细胞系采集样品的保存提供了一定的参考。     

猪流行性腹泻病毒变异株CH/GX/750A/2015在Vero细胞上转瓶培养条件的优化试验

本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件，为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑。试验以10 L转瓶培养病毒，对接毒时细胞维持液中胰酶浓度（0、2、4、6、8和10 μg/mL）、细胞密度（40%、60%、80%、100%、200%）、接毒剂量（MOI分别为1、0.1、0.01和0.001）、吸附时间（0、30、60、90、120、240 min）、收毒时间（接毒后12、24、36、48、60、72 h）、维持培养温度（35、36、37和38 ℃）和转瓶转速（6、8、10、12、14、16 r/h）7个条件进行优化。结果显示，PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为：细胞刚铺满单层时接毒，接毒量为MOI=0.01，维持液（无血清DMEM培养液）中胰酶质量浓度为6 μg/mL，不需吸附，维持培养温度为37 ℃，12 r/h 旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液，效价可稳定达到10^6.50 TCID₅₀/0.1 mL。本试验为 PEDV 变异株大量培养提供了参考，为变异株疫苗研发奠定了基础。     

红豆草黑腐病菌菌丝生长和产毒培养条件的优化

从红豆草自然发生的黑腐病病斑上分离得到细链格孢菌(Alternaria tenuis)菌株,对该病菌的菌丝生长及其产毒条件进行了研究。结果表明,病原菌在供试的6种培养液中均能生长并且产毒,但在PSK培养液中生长及产毒最好;在1-19d的培养时间内该病菌均可以生长及产生毒素,而在13 d时菌丝生长量及其产毒能力均达到最大,菌丝生长与产毒能力间显著正相关;该病原菌在5-40℃的范围内均可生长并产生毒素,但菌丝生长的最适温度为25℃,而最适合产毒的温度为15℃;在pH值为3~11的范围内,该病菌均能生长并产毒,而且偏酸性条件有利于菌丝的生长及其毒素的产生,菌丝生长和产毒的最佳pH值分别为4和6。     

产β-半乳糖苷酶枯草芽孢杆菌BGJ222培养条件的初步优化

本文以酵母粉蛋白胨培养基为基础培养基,探讨了不同培养时间、接种量、初始pH、碳源、氮源、金属离子对枯草芽孢杆菌BGJ222表达β-半乳糖苷酶能力的影响。结果表明,菌株BGJ222最大产酶量的培养条件为:初始pH 6.6,接种量2%(V/V),培养温度37℃,培养时间24 h;培养基组成为:酵母粉0.5%(m/V),蛋白胨1.0%(m/V),NaCl 0.5%(m/V),三梨醇1.0%(m/V),MgCl20.5%(m/V)。在此条件下,菌株BGJ222表达β-半乳糖苷酶达到11456.4 Miller,比基础培养基的表达量(860 Miller)提高了12倍。