BmNPV侵染后不同抗性家蚕品系中肠组织转录组学分析

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是造成蚕业严重经济损失的主要病原体之一,主要通过食下感染引发家蚕血液型脓病,中肠是免疫病原体的重要组织器官。研究比较了家蚕BmNPV抗性品系C9K和敏感性品系HYB感染BmNPV后中肠组织的基因表达差异,以期筛选家蚕BmNPV的抗性相关基因,为解析家蚕BmNPV抗性机制以及抗病毒育种提供数据支持。结果表明：BmNPV侵染能够诱导2个品系家蚕的全基因组转录水平发生较大变化,GO分析显示这些变化主要涉及到代谢过程、跨膜转运、膜结构、酶活性、信号传导、结合功能等,KEGG分析显示这些差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）主要参与能量代谢、氨基酸代谢、糖类代谢、次级产物代谢等;BmNPV感染后,一些免疫相关基因的表达发生了变化,许多与黑化和细胞凋亡等相关的DEGs可能参与宿主对BmNPV感染的反应。     

云南蚕区家蚕品种资源对家蚕核型多角体病毒的抗性评价分析

[目的]全面掌握云南蚕区家蚕品种资源的抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)能力,为挖掘具有特色的家蚕抗病材料及培育适应当地的抗病品种提供参考.[方法]采用三龄起蚕经口添食相同浓度病毒、逐日调查存活率的方法,对200个家蚕品种(品系)进行BmNPV抗性评价和筛选;并通过接种后每日存活数、各发育时期存活率等指标分析云南蚕区家蚕品种资源对BmNPV的抗性水平、发病死亡规律、不同抗性品种的发病死亡时期及同一品种不同品系间抗性差异.[结果]云南蚕区家蚕品种资源中抗BmNPV的品种有731、795、854B、872A、966B、B黄肉色茧、P50、山河B、选二甲白和竹印,感病品种包括955、242A、242B、963B、DW3、锦秀A、锦秀B、日、野乙和云夏A油.各抗病品种和感病品种首次出现死亡差异的时间截点分别是接种后96和48 h,二者相差48 h;部分抗病品种在秋季对BmNPV的抗性水平低于春季;同一家蚕品种A系和B系的抗病性差异不显著(P>0.05).[结论]云南蚕区家蚕品种资源中大多数品种的抗BmNPV能力属于中等水平,其中P50为BmNPV抗性最强品种.对未知品种进行抗BmNPV测定时,可选择接种后168 h作为抗性评价的时间截点.     

BmNPV对家蚕海藻糖酶活性及其基因表达的影响

为了明确家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrovirus,BmNPV)对家蚕不同组织海藻糖酶活性及其基因BmTre表达水平的影响,以五龄起蚕为试验材料,经口喂食BmNPV,分析血淋巴、脂肪体和中肠BmTre基因及海藻糖酶活性的变化情况.结果显示,家蚕血淋巴、脂肪体和中肠BmTre...     

云南不同地区BmNPV对家蚕致病力的研究

为研究家蚕病毒弱毒株系对强毒株系的交互保护作用,探索利用弱毒苗添食防治家蚕病毒病,试验收集了8种云南不同地区的BmNPV多角体,经纯化后,配制成102~108个/ML7种浓度多角体悬浮液,分别添食3龄起蚕,每种病毒的每种浓度为1个处理,每个处理3个重复小区,每小区30头蚕,调查记录各区蚕死亡头数,连续调查至供试蚕上蔟,累计死亡头数,计算各区蚕死亡率。参照吉田的方法计算其LC。结果表明,8种云南不同地区家蚕核型多角体病毒对家蚕致死中浓度由大到小依次为BmNPV(Heqing)(BmNPV(Xiangyun)(BmNPV(Mengzi)(BmNPV(Qiaojia)(BmNPV(Luliang)(BmNPV(Mojiang)(BmNPV(Zhanyu)(BmNPV(Baoshan)。毒力最强的是保山株,其对3龄起蚕的致死中浓度为5.75×104个/mL,次强是沾益株和墨江株同在一个数量级,陆良株、巧家株和蒙自株中等在同一个数量级,其次是祥云株,最弱为鹤庆株,LC50为8.81×109个/mL,其与最强的保山株(LC50为5.75×104个/mL)相差5个数量级。     

BmNPV对家蚕抗氧化酶基因表达及其酶活性的影响

[目的]探究喂食家蚕核型多角体病毒(BmNPV)后家蚕血淋巴和中肠组织抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)]的活性及其基因表达变化规律,明确BmNPV侵染对家蚕抗氧化系统的影响,为解析BmNPV的致病机理提供理论依据.[方法]以五龄家蚕为研究对象,经口喂食BmNPV,分别于添食后6、12、18、24、30、36、42和48 h采集家蚕的血淋巴和中肠组织,采用实时荧光定量PCR检测两种抗氧化酶基因(Bmsod和Bmcat)的表达水平,同时以抗氧化酶活性测试盒测定SOD和CAT的活性变化情况.[结果]BmNPV侵染五龄家蚕能引起典型的血液型脓病,主要表现为蚕体环节肿胀,狂躁爬行,体壁易破,体液呈乳白色等.家蚕血淋巴和中肠组织中Bmsod和Bmcat基因均在感染BmNPV中期开始上调表达,在感染后期呈下调表达趋势,其相对表达量也呈先增加后急剧减少的变化趋势.添食BmNPV后,家蚕血淋巴和中肠组织的SOD活性在感染18和24 h时极显著高于对照组(添食等量灭菌水)家蚕(P<0.01,下同),但从感染30 h起SOD活性开始急剧下降,至感染48 h时降至最低值.家蚕血淋巴和中肠组织的CAT活性在感染早期(6 h)略有下降,从感染12 h起CAT活性开始呈上升趋势,血淋巴CAT活性在感染18~30 h极显著高于对照组,随后急剧下降且显著低于对照组家蚕(P<0.05,下同);中肠组织CAT活性仅在感染18和24 h时显著或极显著高于对照组家蚕,从感染30 h起开始持续下降,至感染48 h时降至最低值,约为对照组家蚕的18%.[结论]BmNPV侵染能影响家蚕机体相关保护酶活性及其基因转录水平,SOD和CAT活性及其基因表达量在感染中期增加,感染后期则急剧降低,提示抗氧化酶SOD和CAT在家蚕的抗病毒过程中发挥重要作用.     

家蚕热激蛋白Hsp25.4对BmNPV增殖的影响

【目的】探究家蚕热激蛋白（Hsp25.4）基因在家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrovirus,Bm NPV）侵染家蚕后的表达变化规律,明确敲低该基因表达后对BmNPV增殖复制的影响,为深入解析BmHsp25.4蛋白在BmNPV侵染家蚕过程中发挥的作用提供参考依据。【方法】以5龄家蚕幼虫为研究对象,经口添食10μL预先制备好的BmNPV-T3株病毒悬液（5×108个/mL）,对照组添食等量灭菌水,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因在BmNPV侵染6 h各组织的表达情况,并选择相对表达量较高的3个组织,分析BmHsp25.4基因时空表达图谱;注射双链RNA(dsRNA)检测BmHsp25.4基因在体内的干涉效果,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因干涉后对BmNPV增殖复制的影响。【结果】BmNPV侵染家蚕6 h,BmHsp25.4基因在家蚕血液、中肠和脂肪体组织中的相对表达量升高;时空表达谱结果显示,BmHsp25.4基因在3个组织中的表达谱均呈先升高后降低的变化趋势,其中血液和中肠组织的相对表达量均在6h达峰值,而脂...     

家蚕对核型多角体病毒（NPV）抗性的遗传学研究

】以１０个家蚕原种和２个杂交种为材料,采用机率分析法研究了不同家蚕品种对ＮＰＶ的抗性差异。结果表明,不同家蚕品种对ＮＰＶ的抗性差异极显著。抗性主要受微效多基因控制,并具有偏父遗传现象。日本系统的品种的抗性比中国系统的品种强。     

家蚕IAP互作蛋白的筛选、鉴定及其对BmNPV增殖的影响

目的 细胞凋亡作为昆虫免疫应答的重要组成部分,在病毒与宿主相互作用的过程中扮演着重要角色,以细胞凋亡相关基因为研究对象对阐明其在病毒感染过程中的作用具有重要的参考价值。本研究旨在筛选家蚕凋亡抑制蛋白（Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein,BmIAP）的相互作用蛋白,并验证其在家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）侵染过程中与Bmiap的相互调控关系及在BmNPV增殖过程中的作用,为探明宿主与BmNPV相互作用的分子机制提供理论依据。方法 利用免疫共沉淀技术筛选在BmNPV侵染家蚕细胞过程中与BmIAP相互作用的蛋白,对获得的特异性差异条带进行LC-MS/MS蛋白质谱分析,根据蛋白分子量大小并利用生物信息学方法对获得的蛋白进行鉴定,确定候选基因;通过分子克隆技术对候选基因进行克隆,利用SMART在线工具及BioEdit分别对候选基因的结构域进行预测及多序列比对分析;通过免疫荧光试验验证BmIAP和候选蛋白的细胞共定位情况,并进一步利用免疫共沉淀验证它们的相互作用;分别通过真核表达和基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对候选基因进行过表达和敲除,利用qRT-PCR技术检测相应基因的表达情况,以确定Bmiap和Bmpp5在BmNPV侵染过程中的调控关系;同样,在过表达和敲除Bmpp5后检测杆状病毒Vp39的表达量,以确定Bmpp5对BmNPV增殖的影响。结果 通过免疫共沉淀获得7个可能与BmIAP相互作用的宿主蛋白和1个BmNPV蛋白,进一步分析确定1个与凋亡相关的候选基因Bmpp5;Bmpp5的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,预测的蛋白分子量约为56 kD,含3个TRP结构域和1个PP2Ac结构域,在昆虫间具有较高的保守性;免疫荧光检测证明BmIAP和BmPP5共定位于细胞质中,免疫共沉淀结果表明两者可以相互作用;在BmNPV侵染过程中,过表达Bmiap后,Bmpp5的表达量显著上调,而敲除Bmiap后,Bmpp5的表达量显著下调,表明Bmiap能够促进Bmpp5的表达;同时,过表达Bmpp5后,Bmiap显著上调表达,而敲除Bmpp5后,Bmiap显著下调表达,表明Bmpp5同样能够促进Bmiap的表达;过表达Bmpp5能够促进BmNPV的增殖,敲除Bmpp5能够抑制BmNPV的增殖,表明Bmpp5的表达利于BmNPV的增殖。结论 鉴定了1个能够与BmIAP相互作用的蛋白BmPP5,且该蛋白在昆虫中高度保守;在BmNPV侵染过程中,Bmiap和Bmpp5能够相互促进,且Bmpp5能够促进BmNPV的复制增殖。     

家蚕对BmNPV抗病性与中肠消化酶活性的关系

对6个现行家蚕品种中肠消化酶活性与家蚕对BmNPV病毒抗性比较与分析,以期寻找现行家蚕品种消化酶的活性与抗性的关系,为辅助家蚕育种及品种推广奠定基础.以DNS法测定不同品种海藻糖酶活性,以Fo-lion-酚法测定不同品种蛋白酶活性.以及以铜皂法测定脂肪酶活性,同时对不同品种家蚕4龄起蚕经口添加BmN-PV病毒进行抗性调查分析.结果表明,蛋白酶、脂肪酶酶活顺序为664×663较低,667×668相对较高,其他品种处于中间层次,对应抗性测定结果的相关分析表明,活性越强抗性越强,呈显著正相关关系;而海藻糖酶的活性与抗性的关系没有较好的相关性.因此,家蚕中肠消化液的蛋白酶、脂肪酶可能与家蚕对BmNPV病毒抗性有关.     

家蚕核型多角体病毒基因与抗病育种

家蚕(Bombyx mori L.)对家蚕核型多角体病毒(B.mori Nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)抗性为不完全显性,在常染色体上由主效基因控制,在性染色体上有微效基因的协同作用.抗BmNPV相关基因的研究,为生产上进行防治提供了理论基础.RNA干涉(RNA interferenc...     

gp64基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）增殖的抑制

 【目的】研究gp64基因相对应的多个dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果。【方法】体外合成dsRNA，通过病毒滴度试验、实时定量RT-PCR法研究gp64基因的不同区域、不同长度与RNAi干扰效果的关系。【结果】供试的6个dsRNA的最大抑制效果相当（滴度TCID50的最大抑制差值为4.00左右）；经RNAi的不同时间点的gp64 mRNA 表达水平均明显下调(P<0.01)，其中48 h的gp64 mRNA的表达量约为对照的1/300。【结论】6个dsRNA均能有效地抑制病毒的基因表达和增殖；gp64 ORF第1 390～1 499位点（G3-3）是RNAi的较佳靶位点。     

家蚕抗BmNPV细胞因子的筛选和分析

【目的】探讨家蚕NF-kB类转录因子BmRelish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当BmNPV感染家蚕BmE细胞后BmRelish全长形式（BmRelish-FL）是否转变成其活性形式（BmRelish_act）;利用荧光定量PCR检测过表达BmRelish_act的细胞在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,观测在被荧光标记的BmNPV（BmNPV-EGFP）感染后呈现EGFP荧光的细胞数,并与作为对照的未表达BmRelish_act的细胞相比较,以确定BmRelish是否参与抗病毒免疫;将新鲜细胞通过Transwell细胞共培养体系经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,定量检测在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,以探讨过表达BmRelish_act的细胞是否产生并分泌抗病毒细胞因子;通过超滤等方法对过表达BmRelish_act的细胞上清培养液予以初步分离,将滤过液和截留液分别孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,从而确定抗病毒细胞因子的分子量范围;用高温处理滤过液和截留液后再孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平以确定抗病毒细胞因子的属性;利用LC-MS/MS对滤过液中的多肽做进一步鉴定和分析。【结果】BmE细胞被BmNPV感染后,部分BmRelish-FL转变成其活性形式BmRelish_act;过表达BmRelish_act的细胞被BmNPV感染后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于对照细胞,且呈现EGFP荧光的细胞数也较对照少;新鲜细胞经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于用对照细胞上清培养液孵育的细胞;用100和3 kD超滤管超滤过表达BmRelish_act的细胞上清培养液后,滤过液仍然具有显著降低所孵育细胞的胞内病毒DNA的相对水平,而截留液无此活性;经高温处理后,该细胞上清培养液不再具有降低所孵育细胞的胞内病毒DNA相对水平的作用;在滤过液中通过质谱鉴定到67个肽段,长度为9-45个氨基酸,富集到32个蛋白质,分子量均＞3 kD,其中9个蛋白质含有信号肽。【结论】BmNPV感染导致BmRelish的激活;活化的BmRelish促进细胞产生抗病毒细胞因子并分泌到上清培养液中;该细胞因子具有增强细胞抗病毒能力的活性,为分子量＜3 kD的多肽。     

家蚕热休克蛋白HSP90相互作用蛋白的筛选与鉴定

[目的]HSP90是热休克蛋白家族的成员之一,在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用,已有研究表明HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖,但作用机制尚不清楚.本研究通过鉴定BmHSP90的相互作用蛋白,为其促进BmNPV增殖的作用机制解析提...     

家蚕DNA甲基转移酶功能预测及其在BmNPV感染下的表达特征

【目的】明确家蚕DNA甲基转移酶基因（BmDNMT）生物信息学基本特征及其在家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染前后的表达情况,揭示DNA甲基化在家蚕抗病毒免疫方面的作用机制,为挖掘家蚕抗病毒标志基因和药物靶标蛋白等提供理论依据。【方法】通过OrthoDB、MultiLoc2、SherLoc2、PSORTII、SMART、SWISS-MODEL及Schr?dinger等在线生物信息学分析软件进行BmDNMT蛋白氨基酸同源比对、系统进化分析、亚细胞定位、功能结构域预测、三级结构同源建模及小分子配体对接口袋预测,并采用实时荧光定量PCR分析BmDNMT基因在家蚕感染BmNPV后不同时间不同组织中的时空表达特征。【结果】BmDNMT基因包含BmDNMT1和BmDNMT2,分别位于家蚕8号染色体和11号染色体上,其推导BmDNMT氨基酸序列均与烟草天蛾DNMT氨基酸序列的亲缘关系最近。BmDNMT1蛋白大量存在于细胞核,少量分布在细胞质;而BmDNMT2蛋白大量存在于细胞质,少量分布在细胞核及线粒体。BmDNMT1蛋白的功能结构域多于BmDNMT2蛋白,二者均含有DNA甲基化酶功能结构域,且具...     

家蚕核型多角体病毒IE1的多克隆抗体制备及鉴定

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)ie1 基因是BmNPVDNA复制的必需基因,其编码的IE1蛋白能够反式转录 激活杆状病毒早期基因的表达.为了进一步研究IE1蛋白在家蚕核型多角体病毒感染宿主过程中具体的功能,研究 通过PCR扩增BmNPVie1 基因片段,亚克隆到原核表达载体pET32,获得重组质粒pET32-IE1,经测序正确后, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株.通过IPTG诱导融合蛋白原核表达后,初步纯化收集抗原,免疫新西兰大白 兔,制备IE1多克隆抗体.应用制备的免疫兔血清进行Western-blot分析,结果显示多克隆抗体能特异识别BmNPV 的IE1和IE0蛋白.免疫荧光结果同样显示IE1蛋白定位于宿主细胞核病毒复制中心.IE1抗体制备的成功为进 一步研究IE1在病毒感染家蚕中的作用机理奠定了基础.     

BmNPV DNA解旋酶基因酵母双杂交诱饵载体的构建

为了筛选家蚕对BmNPV DNA解旋酶的受体基因,根据GenBank公布的BmNPV (T3株)的序列,设计引物对其DNA解旋酶基因的核心结构域进行PCR扩增,成功克隆该基因并利用双酶切亚克隆至酵母双杂交诱饵载体PGBKT7.实验证明重组诱饵载体不能自激活,可以作为诱饵进行蛋白结合试验.     

家蚕核型多角体病毒BmOrf99的研究

[目的]探讨家蚕核型多角体病毒BmOrf99在杆状病毒生命周期中的功能.[方法]运用Red同源重组技术构建BmOrf99缺失型重组病毒,研究BmOrf99对病毒复制、BV产生和病毒形态发生的影响.[结果]病毒转染细胞1.5h可检测到BmOrf99表达;通过Red重组系统构建敲除型病毒BmNPV-BmOrf99KO-polh-GFP,转染结果显示,敲除BmOrf99病毒仍能增殖复制,透射电镜观察显示,BmOrf99敲除对病毒粒子装配和多角体形成无明显影响.病毒DNA转染后24～72 h,敲除型病毒转染细胞培养上清BV水平略高于对照病毒BmNPV-BmOrf99WT-polh-GFP;转染后72 h,前者细胞培养上清TCID50略高于后者;转染6～72 h,敲除型病毒转染细胞中病毒DNA水平高于对照病毒转染细胞;敲除型病毒感染72 h后,细胞中BmOf998a表达水平比对照组提高2.21倍.[结论]BmOrf99为病毒早期基因,且复制非必需,缺失可促进病毒DNA复制,略增加BV水平,但对病毒形态发生无影响,BmOrf-99有可能通过调节病毒其他基因的表达而发挥作用.     

家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展

追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒（Bombyxmori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV）基因与蛋白,了解家蚕抗BmNPV的机制,对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义。文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述,提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究,鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性;再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作,改变其对BmNPV的抵抗能力,确认这些基因、蛋白的抗病毒功能。另外,使用免疫组化、免疫共沉淀,ELISA等技术探索基因一蛋白、蛋白一蛋白间的相互作用,找到基因或蛋白的上、下游作用因子,解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制,为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料。     

异源多角体蛋白包装对重组家蚕核型多角体病毒感染性的影响

 将 Ac MNPV的 polh基因克隆到缺失 polh基因的 Bm NPV(API4)基因组中 ,得到被 Ac MNPV多角体蛋白包埋并可表达慈菇蛋白酶抑制剂的重组病毒 Bm NPV(OAc- API4)。发现它的芽生型病毒能感染家蚕细胞和经皮下注射感染家蚕幼虫 ,但包埋型病毒不能经口感染家蚕幼虫。