小鹅瘟病原学与检测方法的研究

从患病雏鹅的病料样本中分离鉴定出一株小鹅瘟野生强毒.采用鹅胚增殖病毒,以琼脂扩散试验从感染鹅胚尿囊液中检出小鹅瘟病毒抗原;以感染鹅胚尿囊液人工接种5日龄健康雏鹅,复制出与自然感染病例相类似的病变; 通过电镜观察到典型的小鹅瘟病毒粒子.该分离毒株核酸分子量为5 000 bp.制备的小鹅瘟沉淀抗原可以检测患病雏鹅血清中的抗体,监测治疗血清的滴度和疫苗接种的效果.标记的小鹅瘟荧光抗体能直接检测患病雏鹅组织中的病毒抗原.针对编码主要结构蛋白VP3的基因设计合成一对引物,扩增出与预期长度相符的特异性DNA片段.     

小鹅瘟病毒GD-06株的分离鉴定

从广东某地死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾中分离到一株病毒。采用鹅胚增殖病毒，通过电镜观察到细小病毒样粒子；人工感染7日龄健康易感雏鹅，引起100％的发病和死亡，并具有典型小鹅瘟的临床症状和剖检特征。经琼脂扩散试验，用此株病毒感染的鹅胚液制备的小鹅瘟沉淀抗原能与小鹅瘟病毒阳性血清发生特异性反应。针对编码主要结构蛋白VP3的基因设计合成一对引物，扩增出与预期长度相符的特异性DNA片段。     

鸭病毒性脑炎（暂定）病原分离与鉴定的初步研究

从以腹泻和腿麻痹为主要症状的康贝尔鸭肝、脾中分离到1株病毒。该病毒能适应于鸡胚、鸭胚，胚接种后不死亡，但有出血点。小鸭人工感染病毒后出现与自然病例相似的症状，并能回收到病毒。电镜观察病毒主要呈球形，有囊膜，大小约为30nm；病毒有3种结构蛋白，VP1（17KD）、VP2（41KD）和VP3（50KD），其中VP3为主要结构蛋白，病毒核酸为单链RNA。     

1株小鹅瘟病毒的分离与鉴定

自山东省某鹅场病死鹅组织病料中分离到1株小鹅瘟病毒,命名为SD株。对其进行了PCR检测、电镜观察、回归动物试验和特异性鉴定。结果表明,该分离株的VP3基因扩增片段为436 bp,与小鹅瘟病毒基因序列同源性达到95%以上;病毒形态与小鹅瘟病毒基本一致;鹅胚尿囊液毒肌肉接种4日龄雏鹅10日内80%死亡,死亡雏鹅剖检主要病变为肿大,表面有坏死斑,十二指肠肠腔膨大,肠道黏膜脱落。该分离株的确定为小鹅瘟的精准防控提供了依据。     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒生化及基因组特性的比较

番鸭细小病毒莆田株（MPV-P）和鹅细小病毒莆田株（GPV-P）分别感染的番鸭胚尿囊液经氯仿处理、PEG沉淀和Sepharose4B柱纯化。纯化样品在电镜下观察，均见到实心和空心2种病毒粒子。病毒粒子呈圆形，立体对称，无囊膜，直径为20-24nm。经SDS-PAGE分析，MPV和GPV均呈现3条结构蛋白带。MPV结构蛋白的相对分子质量约为VP1 89000、VP2 78000和VP3 61000，其中VP3为主要结构蛋白。GPV要相对分子质量与MPV有微小差别。MPV和GPV核酸均为单链DNA，长度约为51000bp。分别以MPV核酸和GPV核酸为模板，加到无引物的DNA聚合酶Ⅰ大片段合成体系中，合成产物经1%琼脂糖凝胶电泳，均可见长度约为5600bp的双链DNA带，证明MPV和GPV核酸的3'末端具有发夹结构。对这2种病毒核酸及经Klenow合成的双链核酸进行限制性内切酶分析，两者的酶切结果明显不同，表明MPV和GPV核酸在一级结构上存在明显差异。以上结果证明，MPV和GPV不但在致病性上有显著养异，而且在核酸结构上也有明显差异。     

小鹅瘟病毒的分离与鉴定

用接种鹅胚的病毒增殖法,从具有小鹅瘟典型症状和病理变化的病死雏鹅的脏器中分离到一株病毒,并进行了鹅胚致病性试验、鹅胚中和试验、雏鹅感染试验和琼脂扩散试验.结果表明,所分离的毒株为小鹅瘟病毒.     

一例鹅病毒病的病原鉴定初步报告

对一种成年鹅的传染性疾病的病原进行了初步鉴定.用成年病死鹅和病鹅肝组织悬液接种12日龄鹅胚,48～72 h鹅胚死亡,再用第一代鹅胚尿囊液连传6代均死亡(为GVF1-6).用GVF2接种鸡胚,48～96 h死亡, 连传4代均死亡(为EVF1-4);用GVF3回归到成年母鹅,出现与自然感染类似的病变;用EVF4进行毒力测定,对ELD50为10-5.3;鸡胚平均死亡时间为96 h;用EVF4胚尿囊液进行纯化和浓缩,作电镜检查,观察到大小为120～220 nm有囊膜的近似球形病毒颗粒和六角形的病毒,初步怀疑为副粘病毒和小鹅瘟病毒混感;经用2种血清进行中和处理,得到2种病毒,其中一株进行血凝试验能凝集鹅、豚鼠、牛、羊、人等多种红细胞;进行血凝抑制试验,能被相应的血清和鸡新城疫血清所抑制;经理化测定对乙醚、氯仿敏感,胰蛋白酶不敏感;不耐酸,对热较敏感;核酸型测定,核酸为RNA.经初步确定本病毒可能是鹅副粘病毒.另一种经中和试验和电镜确定为小鹅瘟病毒.     

6株鹅细小病毒的分离鉴定及VP3基因序列分析

为了解吉林省不同地区小鹅瘟流行情况,从吉林省磐石、白城、九台、德惠、辽源、镇赉地区鹅养殖场采集疑似小鹅瘟病料,接种SPF鹅胚后分离到6株病毒(暂命名为PSH、BCH、JLJT、DH、LY、ZL株),经PCR鉴定为鹅细小病毒。VP3基因序列分析结果显示,分离到的6株病毒VP3基因、蛋白与近年来国内流行的鹅细小病毒同源性较高,分别为93.1%～99.6%与95.9%～99.4%。其中,BCH株、JLJT株、LY株属同一分支,与浙江、扬州等地区分离的鹅细小病毒相似性较高,达到99.4%-99.6%;ZL株、DH株、PSH株属同一分支,相似性较低。试验表明,吉林省流行的鹅细小病毒与我国南方地区流行毒株同源性较高,与其他地区流行毒株存在一定差异。     

用病毒分离法鉴定诊断小鹅瘟

采用未免疫小鹅瘟疫苗的健康母鹅所产种蛋的12日龄鹅胚,从死亡的具有小鹅瘟典型症状雏鹅的脾中分离到1株病毒,电镜负染观察到细小病毒样粒子。雏鹅接种试验结果,试验组雏鹅表现出小鹅瘟临床症状和剖检特征。由此证明该雏鹅死于小鹅瘟。     

小鹅瘟病毒地方株的分离与鉴定

对安徽省六安地区疑似小鹅瘟病死雏鹅进行剖检,对具有典型症状和病变的病死雏鹅脏器进行病毒的分离培养.用接种鹅胚的病毒增殖法,从病死雏鹩的脏器中分离到一株病毒.通过鹩胚致病性试验、鹅胚中和试验、雏鹅感染试验和琼脂扩散试验,初步鉴定所分离的毒株为小鹅瘟病毒,且该病毒具有较强的致病性.     

鹅细小病毒强毒株XKY10株的分离、鉴定及其生物学特性分析

采用电镜观察、PCR检测、血液凝集和琼脂扩散方法来鉴定从白城某养鹅场10日龄雏鹅具有典型症状的雏鹅肝脏、脾脏和肠组织中分离的一株病毒;通过测定此病毒最小致死量致死鹅胚的平均时间(MDT)和鹅胚半数致死率(ELD₅₀)来分析其毒力。鉴定结果表明,该病毒为鹅细小病毒。毒力分析结果表明,该毒株为强毒株。     

小鹅瘟病毒分离与初步鉴定

取死于具有小鹅瘟典型症状的 7日龄吉林白鹅脾脏 ,制成乳剂 ,接种于未免疫小鹅瘟疫苗的健康母鹅所产种蛋的 12日龄鹅胚尿囊腔。结果当盲传至第 3代 ,鹅胚死亡 ,电镜负染尿囊液观察到细小病毒样粒子。雏鹅接种试验结果表明 ,试验组雏鹅表现出小鹅瘟临床症状和剖检特征。由此证明 ,该雏鹅死于小鹅瘟     

鹅细小病毒BC1105株的分离鉴定

2011年5月中旬在吉林省白城地区的某养鹅场疑似小鹅瘟病死雏鹅的肾脏、肝脏、脑和脾脏组织中分离到1株病毒,选用未免疫小鹅瘟疫苗的健康母鹅所产的14日龄鹅胚,进行鹅胚接种试验,连续传代、血凝试验、琼脂扩散试验、电镜观察、PCR鉴定和动物回归试验,初步确定该病毒为鹅细小病毒,命名为BC1105株。     

FPV在鹅胚上的驯化及部分TK基因的克隆与序列分析

通过将禽痘病毒接种15日龄鹅胚的绒毛尿囊膜的方法对其进行驯化,使其适应鹅胚,并出现典型病变;再以驯化第9代的病毒接种16日龄雏鹅,通过PCR的方法在接种后10d的鹅血液中检出病毒。根据已发表的禽痘病毒TK基因序列设计1对引物,采用PCR技术扩增出与预期设计的600bp大小相符的TK基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体,经酶切鉴定筛选出阳性克隆,进行序列测定和分析。序列分析表明:所扩增的TK基因的核苷酸长度为552bp,,共编码183个氨基酸。同源性分析表明:经鹅胚驯化的FPVTK基因片段与已发表的282E4株FPVTK基因比较核苷酸序列同源性为99.82%,氨基酸序列同源性为99.45%。     

血清4型禽腺病毒W株的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解血清4型禽腺病毒（fowl adenovirus genotype 4,FAdV-4） W株全基因序列、结构特征及遗传变异情况,本试验采集发病鸡肝脏和肾脏进行PCR鉴定、SPF鸡胚和鸡胚肝细胞分离、电镜观察证明该病毒为FAdV-4,TCID₅₀为10^-7.2/0.1 mL;电镜观察可见70 nm左右的二十面体无囊膜病毒颗粒;经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚后能明显抑制鸡胚发育出现侏儒胚,接种10 d内死亡率达100%;进一步对W株进行全基因组扩增及序列分析。病毒序列分析结果显示,其全基因组长为43 591 bp,共有60个开放阅读框,W株与GenBank中公布的FAdV-4参考毒株全基因组核苷酸序列同源性为98.4%~100%,其中与标准株非致病性毒株ON1（登录号：GU188428.1）的同源性为98.4%,主要缺失ORF19（脂肪酶基因）和ORF27;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Fiber-1和Fiber-2基因分析发现,W株与近几年国内分离株亲缘关系较近,与ON1株及其他国外分离株差异较大。综上说明,该分离株具有高致病性,与国外分离株存在较大差异,为进一步分析FAdV-4的毒力增强机制提供了基础依据。     

鹅副粘病毒YF株的分离鉴定与生物学特性研究

从辽宁省某鹅场病死鹅中分离到1株禽Ⅰ型副粘病毒.应用鸡胚传代、电镜形态学观察、红细胞凝集、红细胞凝集抑制试验、血清中和试验、动物回归试验、免疫保护试验进行了研究,并进行了最小致死量平均死亡时间(MDT)、脑接种致病指数(ICPI)、静脉内接种致病指数(IVPI)三项毒力指标的测定.参照新城疫病毒毒力判定的标准及其方法,分别测定该分离株的鸡(鹅)胚MDT、1日龄鸡(鹅)ICPI和6周龄鸡(鹅)IVPI为51.6/68.6 h、1.75/1.70和1.68/1.72.结果表明,该分离株为鹅副粘病毒强毒株,命名为YF株.应用YF毒株制备的油乳剂灭活苗免疫实验鸡和雏鹅,结果表明有良好的保护率.     

鸡传染性支气管炎病毒SC株N基因序列测定与同源性分析

从我国四川省一疑似鸡传染性支气管炎(Avianinfectious bronchitisvirus,IB)的雏鸡病料中成功分离到一株鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV),命名为SC。病毒经鸡胚传代、血凝试验监测和负染电镜检查证实为IBV。自接毒鸡胚尿囊液中提取RNA后应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到了IBVSC株mRNA6 cDNA(编码N蛋白)。应用DNAstar5．06,Clustal1．8分析软件将克隆测序的N蛋白基因与Genbank中11株国内外参考毒株进行序列比较分析和同源性分析,发现IBV SC株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。     

鸭疱疹病毒Ⅱ型（暂定名）的分离鉴定

自1990年以来，在福建、浙江和广东等省发生一种以双翅羽毛管淤血呈紫黑色、断裂和脱落以及皮下、脏器（肝脏、胰脏）和肠道（十二指肠、直肠和盲肠）出血为主要特征的新的鸭传染病，暂定名为鸭出血症。我们对从自然感染该病典型病死番鸭脏器中获得的1株含2种病毒粒子（直径大小分别为30－40mm和80－120mm)的分离物，以Ⅰ型雏鸭病毒性肝炎标准阳性血清进行连续4代中和后接种番鸭胚，收集死亡番鸭胚胚液进行病毒纯化、负染、电镜观察和SPF鸡胚接种试验证明获得单一病毒分离株（定名为鸭出血症病毒）。该病毒为不耐酸、不耐碱、不耐热、对氯仿处理敏感、核酸类型为双股DNA的有囊膜病毒，直径为80－150nm；对番鸭胚、鹅胚、麻鸭胚、半番鸭胚、北京鸭胚和SPF鸡胚的致 死率分别为100％、100％、78．3％、60％、82．1％和0％；对10－11日龄番鸭胚的ELD50为10^-7.78/0.2ml；无血凝活性，不凝集“O”型人、鸭、鸡、鹅、家兔、小鼠，豚鼠、猪和绵羊红细胞；经血清中和试验证明该病毒与Ⅰ型雏鸭肝炎病毒、雏番鸭细小病毒、雏鹅细小病毒、鸭瘟病毒无血清学相关性。据以上结果可将该病毒确定为疱疹病毒科成员，但鉴于其与鸭瘟病毒（鸭疱疹病毒Ⅰ型）无血清学相关性，则暂定名为鸭疱疹病毒Ⅱ型，此为国内外首次报道。     

鸭坦布苏病毒分离鉴定及其囊膜蛋白遗传进化分析

【目的】 了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】 通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】 分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】 成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。     

鹅细小病毒QY株的生物特性研究

本研究的病毒是从广东患病鹅的小肠组织中分离的,初步鉴定为小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV),命名为QY/05后,对病毒的生物学特性进行了鉴定。病料经过处理后,接种12日龄非免疫鹅胚,传代,发现病毒对鹅胚的平均致死时间为3～4d,胚体全身出现较为严重的出血点。病毒接种鹅成纤维细胞和番鸭成纤维细胞,显微镜下可见细胞圆缩、脱落、折光性增强等明显的细胞病变。鹅胚尿囊液经梯度离心后,磷钨酸负染,电镜下可见明显细小的病毒样粒子。这株小鹅瘟病毒尿囊液对鹅胚的EID50为10-3.67/0.3ml。对鹅胚成纤维细胞的TCID50分别为2-5.425/0.1ml。感染一个病毒最小致死量的鹅胚平均死亡时间(MDT)分别为96h。提取DNA后,PCR扩增,在阳性对照处扩增出需要的目的条带。研究结果表明,该分离毒株为典型的鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)。