非培养方法解析烟草根部内生细菌的群落结构

为了解烟草根部内生细菌多样性,采用改进的CTAB法提取烟草根部总DNA,利用细菌16 S rDNA基因通用引物对烟草根总DNA进行16 S rDNA扩增,构建烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库;挑取具有不同酶切谱型的克隆进行测序、比对并构建16 S rDNA基因系统发育树。构建的烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库中,155个克隆分属于36个不同的分类单元,Blast结果表明,大部分克隆与已知细菌的16 S rDNA序列相似性较高,分别属于变形菌门(Proteobacteria)的Alpha、Gamma、Beta亚群,放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),厚壁菌门(Fir-micutes)中的肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养食单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)等16个属,其中13.5%的克隆序列与非可培养细菌(Uncultured bacteria)的相似性在93%～99%之间,假单胞菌属细菌是烟草根部内生细菌的优势种群。这些研究结果说明烟草根部存在较为丰富的内生细菌系统发育多样性,并且潜藏着未知的内生细菌资源。     

低温条件下牛粪沼气产甲烷菌多样性初步研究

为了在低温条件下调查牛粪沼气产气高峰期的产甲烷菌菌群结构。采用分子生物学方法构建16S rDNA基因文库,随机分析文库中60个克隆的16S rDNA基因序列,研究了牛粪沼气池发酵液中产甲烷菌的菌群结构。结果表明,在60个克隆中,18个属于甲烷八叠球菌属（Methanosarcina sp.）与Methanosarcina spAK-16菌株同源程度最高,相似性为99%。7个属于甲烷八叠球菌科（Methanosarcinales）,15个属于甲烷鬃毛菌属（Methanosaeta）。利用MEGA 4.0软件分析60个克隆的16S rDNA序列,构建相应的系统进化树,结果显示,60个克隆子主要分为两大类群GroupA和GroupB。其中以属于甲烷八叠球菌属(Methanosarcina sp.)为主要类群,占全部克隆的42%,另一部分以甲烷鬃毛菌属(Methanosaeta)为主要类群,占25%。在整个发酵周期中到投料第18天达到产气最高峰。随着产气高峰期的过后,产气量逐渐下降。1个周期的总产气量504.91 mL 折合8 m3发酵罐产气量21.71 m3,其中甲烷气体总量为62%。分析低温（4℃）条件下以牛粪为主要发酵原料的沼气池产气高峰期的优势产甲烷菌群,结果发现甲烷八叠球菌属(Methanosaeta sp.)占总数的42%。     

基于高通量测序的不同轮作方式下烟田土壤细菌群落组成分析

在自然界中,土壤微生物与植物之间存在着密切的联系,土壤微生物依赖植物提供的养分而生存,同时对植物的生长发育起着促进作用。本研究利用Illumina Hi Seq高通量测序技术,提取西双版纳烟田烟草连作、田菁轮作和青蒿轮作3种种植模式下土壤样品的总DNA,通过PCR方法扩增构建16S r RNA基因文库。结合生物信息学方法分析土壤细菌16S r RNA基因V3~V4区的多样性指数、群落结构等,以确定烟田更好的种植模式。所有样本共测序分析获得4 898个细菌分类单元OTU,经琢多样性和茁多样性分析表明3个处理下细菌群落多样性存在显著差异,并且在对照组中的细菌群落丰富度最高,青蒿轮作中的细菌群落丰富度最低。样本中优势门类为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi),其中变形菌门(Proteobacteria)相对丰度33.49%占绝对优势。优势属类为硝化螺旋菌属、Kaistobacter、红游动菌属和黄杆菌属,可促进氮素转化的硝化螺旋菌属在田菁中的相对丰度最高,烟株青枯病致病菌罗尔斯通菌属在青蒿轮作中相对丰度最低;拮抗黑胫病的假单胞杆菌属在青蒿轮作中相对丰度最高。本研究将对烟草轮作方式和轮作作物的选择提供分子层面的支持。     

缢蛏致病菌气单胞茵的分子生物学鉴定

从患病缢蛏(Sinvnovacula constricta)中分离到一株病原菌,暂命名为12#菌.对该株的16SrDNA的全序列进行PCR扩增并测序,然后用NCBIBLAST对测序结果进行比对.16S rDNA序列分析表明:12#菌与多株气单胞茵的16S rDNA的同源性均在95%vx以上.在细菌系统分类学中应归属于气单胞茵属.从构建的系统发育树中可以看出:12#茵与点状产气单胞茵(Aeromonas punctata)共同构成一个分支,且该菌株与点状产气单胞菌(Aeromonas punctata)的16S rDNA同源性达到99%以上,由此可以初步认为该菌为点状产气单胞茵(Aeromonas punctata).     

沙漠中褐沙蒿根际细菌群落结构特征分析

基于16S rDNA基因的文库构建和分析,本文对比分析了浑善达克和毛乌素沙漠中褐沙蒿根际细菌群落结构特点。结果表明：褐沙蒿根际细菌类群主要有9类,即芽单胞菌（Gemmatimonadetes）(4.26%/2.08%,浑善达克样/毛乌素沙样,下同)、酸杆菌（Acidobacteria）(2.15%/2.08%)、放线菌（Actinobacteria）(10.64%/8.33%)、拟杆菌（Bacteroidetes）(2.13%/4.17%)、绿弯菌（Chloroflexi）(0/2.08%)和α-变形菌（α-proteobacteria）(65.96%/56.25%)、β-变形菌（β-proteobacteria）(0/6.25%)、δ-变形菌（δ-proteobacteria）(2.08%/2.13%)和γ-变形菌（γ-proteobacteria）(10.64%/2.08%)。来自两个采样地的褐沙蒿根际细菌菌群结构总体相似,表明植物在此结构组成决定方面起了重要作用;两地根际细菌菌群最主要差别之一是毛乌素褐沙蒿根际细菌比浑善达克沙漠多了三种光合细菌,即红螺菌（Rhodospirillales）、红细菌（Rhodobacter）和绿弯菌。     

重病田和无病田棉花根组织中细菌群落结构的差异

为了研究黄萎病菌侵染条件下内生细菌群落结构多样性变化,以不同时期健康棉株和感染黄萎病菌(Verticillium dahliae)的棉株根部组织为材料,提取样品总DNA,扩增内生细菌16S r DNA的V3可变区,将扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析,并对21个优势条带进行切胶回收、克隆测序,构建系统发育树。结果表明:不同时期发病棉株和健康棉株样品可以聚成2大类,一是苗期和蕾期的根部样品,二是初花期和结铃期的根部样品;感染黄萎病棉株内生细菌种类多样性下降;BLAST比对结果发现21个克隆序列与Gen Bank数据库中已知16S r DNA基因序列同源性很高(99%~100%),绝大多数属于变形菌门(Proteobacteria),占总克隆序列的80.95%,其他不可培养细菌占19.05%。说明黄萎病菌的侵染能明显影响内生细菌群落结构多样性。     

缢蛏致病菌气单胞菌的分子生物学鉴定

从患病缢蛏（Sinvnovacula constricta）中分离到一株病原菌,暂命名为12#菌。对该菌株的16S rDNA的全序列进行PCR扩增并测序,然后用NCBIBLAST对测序结果进行比对。16S rDNA序列分析表明：12#菌与多株气单胞菌的16S rDNA的同源性均在95%以上。在细菌系统分类学中应归属于气单胞菌属。从构建的系统发育树中可以看出：12#菌与点状产气单胞菌（Aeromonas punctata）共同构成一个分支,且该菌株与点状产气单胞菌（Aeromonas punctata）的16S rDNA同源性达到99%以上,由此可以初步认为该菌为点状产气单胞菌（Aeromonas punctata）。     

三明水稻-烟草轮作土壤细菌群落多样性比较

为了比较福建三明地区不同水稻-烟草轮作土壤细菌多样性及群落结构,认识三明水稻-烟草轮作土壤微生物资源多样性,对不同土壤样品中细菌类群进行分析。通过构建细菌16S r DNA克隆文库,对将乐砂壤土、将乐壤土、宁化砂壤土和宁化壤土细菌多样性和群落结构进行分析和比较。结果表明:4个土壤样品中的细菌类群包括厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)等11个类群,将乐2个土壤样品中厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)是优势类群;宁化2个土壤样品中变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)为主要优势菌门。香农-维纳指数(H′)和辛普森指数(D)表明,壤土细菌多样性高于砂壤土。通过构建细菌16S r DNA克隆文库揭示了三明水稻-烟草轮作土壤中细菌多样性十分丰富,这为初步掌握三明水稻-烟草轮作土壤中细菌种类和组成状况提供了一定的参考依据,也为进一步开发利用该地区水稻-烟草轮作土壤微生物资源提供科学的依据。     

野生金线莲根际土壤微生物分析

为分析野生金线莲根际土壤微生物的种类和丰度,优化金线莲仿生态栽培土壤条件,本研究采用Illumina NovaSeq高通量测序技术对6个样本福建金线莲根际土壤微生物16S区域文库进行双末端测序,分析金线莲根际土壤微生物多样性。结果显示,共得到可操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)6 695个,分属46个菌门,421个菌属,在门水平上优势菌门为变形菌门(Proteobacteria),亚优势菌门为酸杆菌门(Acidobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes),变形菌门在各样本中的含量占比不同,但都属于优势菌群。在属水平上优势菌属为梭菌属(Clostridium),亚优势菌属为苔藓杆菌属(Bryobacter)和玫瑰螺菌属(Roseiarcus)。金线莲土壤6个样本共有OTUs数938个,占各样本OTUs数大于80.00%。金线莲根际土壤微生物的丰富度和均匀度高,物种组成较为相似。该研究为金线莲仿野生栽培的土壤改良奠定基础。     

春季稻虾轮作系统微生物群落特征分析

为分析春季不同时间稻虾田微生物群落的构成，采用Illumina Miseq高通量测序技术对克氏原螯虾肠道及养殖环境细菌群落组成进行分析。结果显示，所有样品共检测得到16966个分类操作单元(operational taxonomic units,OTUs),4月底泥样本OTUs最多为3677，虾肠道最少为757。Alpha多样性分析显示，底泥菌群丰度和多样性较高；稻虾轮作系统中优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。4—5月所有样品中的优势类群均为变形菌门，6月克氏原螯虾肠道的优势类群为厚壁菌门。放线菌门在水体中的占比高于肠道和底泥。主坐标分析(PCoA)和样品层级聚类分析(UPGMA)发现，不同月份的底泥和水体菌群按物种聚类到一起，但6月的克氏原螯虾肠道与底泥菌群相似度较高。综合分析，春季稻虾轮作系统中，克氏原螯虾肠道菌群组成与外界养殖环境存在相关性，不同月份各样品菌群的多样性和组成虽有差异但相对稳定。     

柑橘黄龙病菌亚洲种16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区的PCR-RFLP及序列分析

为明确柑橘黄龙病菌的遗传多样性,PCR扩增了6个不同地区黄龙病菌的16SrDNA和16S-23S rDNA间隔区(intergenic spacer regions,ISR),分别通过4种内切酶对其进行了限制性片段长度多态性分析,发现不同分离物的16S rDNA和16S-23S rDNA间隔区各酶切产物的电泳谱带完全一致,未表现多态性。对16S-23SrDNA ISR进行了克隆和测序,经DNAman和NCBI Blast比对分析发现,6个分离物16S-23SrDNAISR序列之间不存在碱基差异,与数据库中柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)同源性高达99.0%～100%。系统发育分析显示所有的Ca.L.asiaticus归为一个类群,而后与Ca.L.africanus、Ca.L.americanus和Ca.L.psyllaurous组成韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)一个大的类群。结果表明,同一种柑橘黄龙病菌不同分离物16S rDNA和16S-23S rDNAISR无分子变异或变异较小,不存在遗传多样性。     

Microbial Community Structure and Ecological Variation in TISTD Reactor

Based on the sewage treatment device of Two-phase Integrated Sludge Thickening and Digestion reactor (TISTD), microbial community structure in stable operation and its ecological variation when load changes are investigated. During a stable operation with 30% sludge dosage rate, 20 dominant bacterial strains are individually isolated from acid-phase and methane-phase of the reactor. Sequence analysis of 16S rDNA reveals that six of the achieved strains belong to Bacillus, Methanospirillum and Methanococcus respectively. Ten sludge samples are collected separately in 5 periods when the reactor operates with 10%, 20% and 30% sludge dosage rate and in the state of started-up and disordered, and followed by DNA extraction, purification, 16S rDNA PCR amplification and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE). The good quality of DNA extraction and amplification demonstrates that there is an abundant biomass in the sludge under mid-temperature condition. The results show that TISTD reactor has a high biodiversity in microbial communities and is complex and stable in ecosystem structure, which effectively supports the good digestion in sludge thickening.     

不同种植方式大豆根际土壤细菌多样性分析

利用Illumina MiSeq第二代高通量测序平台, 对黑龙江省不同地区轮作及连作大豆根际土壤细菌16S rDNA基因组测序, 初步分析在不同种植方式下受大豆胞囊线虫侵染的大豆根际土壤细菌群落结构的变化。从6个土壤样本中共获得25 419个OTUs, 鉴定到细菌的47个门, 147个纲, 709个属。变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门是供试土壤细菌的优势菌门, 占所有细菌群落总数90%以上。连作4年总OTUs及丰富度最高, 连作20年最低。不同轮作方式土壤细菌丰富度差异不显著(P > 0.05), 短期连作与长期连作细菌丰富度及多样性差异显著(P < 0.05)。不同轮作方式下放线菌门相对丰度低于连作方式, 芽单胞菌门和拟杆菌门相对丰度高于同地区连作方式。土壤功能细菌根瘤菌(Bradyrhizobium)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、溶杆菌属(Lysobacter)、土微菌属(Pedomicrobium)的相对丰度在不同年限连作下高于轮作。长期连作土壤优势细菌丰度与轮作土壤相似性更高。     

基于高通量测序患炭疽病草莓根际与健康草莓根际细菌群落的比较研究

研究旨在比较患炭疽病草莓与健康草莓根际土壤细菌群落多样性,了解其细菌群落生态特征,为找到有效的生防菌奠定基础。本研究基于土壤细菌16S rDNA V3-V4区基因多样性,利用Illumina Miseq高通量测序技术进行比较研究。研究得出：与健康对照相比,患病土壤细菌的OTUs数目及多样性指数均较低;在门水平上,变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门等是2种生境共有的优势类群;在属水平上,2种生境的优势菌丰度有差异,患病土壤的假单胞菌属丰度显著降低,气单胞菌属丰度显著升高;而且,健康土壤的解毒类菌、固氮菌、光合菌和硝化菌丰度均高于患病土壤。健康草莓根际土壤细菌丰富度及多样性均高于患病草莓,2种生境细菌菌群结构有差异,且健康土壤中对植物有益的功能微生物群体含量高于患病土壤。     

含羞草、山蚂蟥等几种豆科植物根瘤菌的数值分类及16S rDNA PCR-RFLP分析

为揭示云南省豆科植物根瘤菌的资源多样性,采用数值分类、16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析技术对云南省8个地区含羞草、山蚂蝗等几种不同豆科植物分离的48株根瘤菌菌株进行了遗传和表型多样性研究。16S rDNA PCR产物经HinfⅠ、MspⅠ、RsaⅠ和HaeⅢ4种内切酶消化后产生22种遗传图谱类型;数据经MVSP3.0软件聚类后,所有供试菌株在70%的相似性水平上分为4个分支,经16S rDNA全序列分析,确定分支Ⅰ为伯克霍尔德属(Burkholderia)类群,含1株菌株;分支Ⅱ为贪铜菌属(Cupriavidus)类群,含5株菌株;分支Ⅳ为根瘤菌属(Rhizobium)类群,包括29株菌株;而分支Ⅲ没有和参比菌株聚在一起,经测序为狭长平胞属(Stenotrophomonas)类群。通过对菌株的抗生素抗性、耐盐性、生长温度范围、BTB产酸产碱反应以及对3-酮基乳糖利用情况共计28个表型性状测定,结果显示所有菌株耐盐性较强,多数菌株可耐受60℃的高温。实验表明,分离自云南省的这些菌株具有丰富的遗传和表型多样性。     

方斑东风螺地膜覆沙池和潮线下养殖系统细菌种群结构的PCR-DGGE 分析

为了解方斑东风螺养殖系统中细菌种群结构,研究和优化方斑东风螺地膜覆沙池养殖体系的管理模式。试验采用PCR-DGGE技术,对方斑东风螺地膜覆沙池养殖系统和潮线下养殖系统底质样品和水体样品中的细菌种群结构进行了分析。试验结果显示,以广东省湛江市东海岛海水为基础构建的方斑东风螺养殖系统内主要细菌种群包括变形菌门、绿弯菌门、蓝细菌门和放线菌门。其中地膜覆沙池养殖系统主要细菌种群包括γ-变形菌纲、α-变形菌纲、δ-变形菌纲、变形菌纲、厌氧绳菌纲、蓝细菌和放线菌等;潮线下养殖系统主要细菌种群包括γ-变形菌纲、α-变形菌纲、δ-变形菌纲、厌氧绳菌纲、蓝细菌,而变形菌纲和放线菌的分布较少。被检测的两个养殖系统中细菌种群均具有较高的多样性,UPGMA聚类分析结果表明,被检测的两个养殖系统底质样品S1和S2为一簇,种群结构相似度为54.5%;两个养殖系统的水体样品S3和S4为一簇,种群结构相似度为84.0%;试验结果说明,通过池塘水体更新和微生物种群监测等调控手段有效控制养殖系统微生物种群结构,能够使方斑东风螺地膜覆沙池养殖系统的微生物生态水平接近潮线下养殖系统。     

高原作物青稞根及根际内生细菌群落结构的高通量分析

利用高通量测序技术分析了西藏青稞主栽品种藏青2000根及根际内生细菌的16S V4变异区序列,同时应用UparseRON、KA等软件整理和统计样品序列数和操作分类单元（OTU）数,分析物种丰度及Alpaha多样性等指标。获得的用于分析青稞根部内生细菌的有效序列和OTUs为55 192/3 613,用于分析青稞根际土壤内生细菌的有效序列和OTUs为62 181/4 399;根部及根际土壤Chao1指数分别为3 443.4290和4 632.5820,shannon多样性指数分别为8.542和9.967。在门水平对代表性OTU进行注释发现,青稞根及根际土壤内生细菌主要是变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）。在属水平上主要是假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptomyces）、土地杆菌属（Pedobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、红游动菌属（Rhodoplanes）。结果显示,青稞根及根际内生细菌具有丰富的多样性,且二者的优势菌属一致。     

西瓜根际土壤细菌群落多样性对枯萎病发生的影响

通过高通量测序分析不同栽培条件下西瓜患枯萎病与健康植株根际土壤细菌群落差异,为克服西瓜连作障碍提供土壤生物学的理论依据。以西瓜品种‘早佳8424’为材料,采用Illumina Hiseq 平台进行测序,对其根际土样微生物16S(V4)区域进行扩增子测序分析,比较不同栽培条件下西瓜感病与健康植株根际土壤中细菌多样性变化,探讨影响西瓜枯萎病发生的关键细菌。连作健康组中共获得234895条序列,分归于11230 个OTUs;连作发病组中共获得224092 条序列,分归于11228 个OTUs;非连作健康组中共获得220963 条序列,分归于10068 个OTUs;非连作发病组中共获得231746 条序列,分归于10248 个OTUs。门水平上,变形菌门(Proteobacteria)在各组分中占比均为最高,分别为非连作健康土55.61%、非连作发病土60.84%、连作健康土46.06%、连作发病土47.21%,在非连作土壤中占比高于连作土壤11.59%。另外,连作健康组与非连作健康组存在组间差异显著物种,梭菌纲(Clostridia)在连作健康组中特有,而加玛变形菌纲(Gammaproteobacteria)仅存在非连作健康组中。而在属水平上,非连作组中丰度高的有水恒杆菌属(Mizugakiibacter)、潘多拉菌属(Pandoraea)、热单胞菌属(Thermomonas)、乳杆菌属 (Acidobacterium),且RH组中Taibaiella、戴氏菌属(Dyella)和噬几丁质菌属(Chitinophaga)含量显著增高。对不同处理的综合分析表明,发病植株与健康植株在非连作条件下,根际土壤细菌群落结构差异明显;发病植株的根际土壤细菌群落在不同栽培条件下的组成结构不同。根际土壤细菌群落结构、数量和种类是影响西瓜枯萎病发生的主效环境因子之一。     

复方中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响

为了提高凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的生长性能和抵抗细菌性疾病的能力,将黄芪、大黄、甘草和黄芩等比例组成复方,采用连续和间断两种投喂方式评价1%中草药饵料对凡纳滨对虾的生长和非特异性免疫功能的影响。试验共分3个组,分别为D0组（基础饲料对照组）,D1组（1%中草药饲料组）,6D1-6D0组（6天投喂1%中草药饲料-6天投喂基础饲料）。试验期间在不同时间取样测定血淋巴酚氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶的活性,并在14、28天分别进行副溶血弧菌感染凡纳滨对虾。结果表明：D1组对虾的增长率和相对增重率均显著高于6D1-6D0组和D0组(P＜0.05);6D1-6D0组对虾的增长率和相对增重率略低于对照组,但无显著差异(P＞0.05)。饲料中添加复方中草药可显著提高对虾免疫相关酶(PO、LSZ、SOD)活性。养殖第14、28天的弧菌感染试验结果显示：D1组的免疫保护率分别为68.3%和91.6%,6D1-6D0组的免疫保护率分别为27.2%和45.8%。说明中草药可改善对虾对弧菌性疾病的抵抗能力,并随投喂时间的增加而增强。