用注射器直接对睾丸打点注射EGFP生产转基因兔的试验研究

为探讨直接用 1 mL 注射器对睾丸打点注射pIRES2-EGFP建立操作方便、效率高、成本低、可批量生产转基因兔的可行性.选择4只成年新西兰雄兔,双侧睾丸内分别打点注射 0.5～0.8 mg/mL浓度的质粒 0.25 mL,第 3 周和第 8 周分别取4#和3#雄兔睾丸做冰冻切片,置荧光显微镜下观察是否发绿色荧光.其它雄兔于第 3 周开始参与配种,最后采新生仔兔耳组织提取其基因组进行 PCR 和 Southern 杂交检测阳性率.结果表明,雄兔睾丸冰冻切片于荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR 和 Southern 杂交检测表明在睾丸注射后的第 6 周和第 7 周进行配种所得后代阳性率最高.不同雄兔后代经 PCR 和 Southern 杂交检测平均阳性率存在差异(P<0.05),2#雄兔后代平均阳性率达到 56.46%,3#雄兔的最低达36.96%的阳性率.表明用注射器直接对睾丸打点注射外源基因生产转基因的方法操作简便、高效,为大规模制备一些大型家畜的转基因后代奠定了基础.     

单精注射法生产转基因小鼠的研究

精子胞质内显微受精技术（ICSI）作为辅助受精的一种手段,将体外受精研究和胚胎的显微操作技术结合起来,比以往对精子质量的要求大大降低,使其无论在畜牧业生产实践还是在哺乳动物的生殖生理基础研究中都有着十分重要的意义。本研究用小鼠精子及小鼠精子与GFP基因孵育后对小鼠卵母细胞进行ICSI,获得子代鼠。提取鼠尾基因组DNA,应用PCR、Southern blot进行整合检测。在发育至成年的11只小鼠中经PCR和Southernblot检测到3只阳性（27.3%）。结果表明,利用ICSI技术可以高效地生产转基因小鼠。     

抗菌肽基因导入桑树获得抗病转基因植株

用携带抗菌肽基因的农杆菌处理桑子叶,在含有羧苄青霉素（Cb）400～500mg／L和卡那霉素（Km）20mg／L的MS培养基上,有32.4％的子叶产生了不定芽;66.5％的不定芽在含有Cb300mg／L和Km30～40mg／L的培养基中,正常生长成2～3cm高的新稍;新梢在含Cb50mg／L和Km10mg／L的生根培养基中有72．6％形成完整根系。3次转化共获得12个株系55株KmR植株。不同株系桑苗叶片DNA点杂交分析显示,7个株系有阳性杂交信号。KmR株系桑苗的抗病性测定显示,5个株系共14株桑苗对青枯病具有较强抗性.     

显微注射法制备转基因鼠和转基因猪的技术特点比较

本文采用显微注射技术制作转基因鼠和转基因猪并对其进行比较,阐明了用显微注射方法制作两种转基因动物的技术原理和实验方法。对两者相似点进行了归纳和总结,同时也对两种转基因动物制作过程中的不同之处进行了比较和分析。根据两种不同的实验动物,描述了它们各自不同的实验特点,技术方法和实验要求,本文同时也在理论上和实践中对转基因动物的制作进行了探索。     

T3代抗菌肽转基因辣椒的PCR检测及青枯病抗性测定

对T3代抗菌肽转基因辣椒的11个株系进行了PCR分子生物学检测，证明T3代抗菌肽转基因辣椒仍保持外源抗菌肽基因；对T3代转基因辣椒群体进行了抗枯病测定试验。转基因辣椒群体抗病力提高，表明在转基因辣椒中蚕抗菌肽D、B基因得到了有效表达，从而缓减了青枯病症状。     

β干扰素转基因小鼠的建立和特性研究

选择ICR小鼠为受试动物,应用显微注射仪,将线状人β干扰素基因,按2940～10000拷贝,1～3pL的剂量注射到供体受精卵的雄前核,然后移植到假孕受体的输卵管。实验先后注射了301个受精卵,移植到20只假孕受体,其中5只妊娠,产仔25只。从所获得的25只亲代小鼠的尾组织提取DNA,用内切酶BamHI消化,以[α-~(32)P]-dCTP标记的上述外源基因为特异性核酸探针,应用DNA印迹法检测这些小鼠DNA内外源基因的整合状况.结果表明,亲代小鼠中有人β干扰素基因重组子的转基因小鼠,杂交带在6.8kb位置。应用上述同样方法对亲代转基因小鼠的子1代组织DNA检测发现,绝大多数小鼠的标本除见到1条1.8kb人β干扰素基因的较弱杂交带外,还有数条5.0kb以上强弱各异的杂交带,表明这种外源基因不仅整合到了亲代小鼠的遗传物质内,而且可经垂直方式传给子代。人β干扰素基因的鼠体水平表达检测发现,1只子1代转基因小鼠的肿瘤组织浸出液中含有人β干扰素,滴度达160U/mL,表明整合在小鼠DNA内的人β干扰素外源基因不经诱导而有一定表达。     

水平显微注射法制备转基因小鼠的研究

由于传统显微注射法具有操作繁琐、技术要求高和外源基因导入率低等局限性,本试验对常规显微注射法进行改进,旨在建立一套比较完善的水平显微注射方法。采用水平微注射系统,将外源DNA片段导入胚胎的雄原核中,获得子代鼠,分娩后3周提取鼠尾基因组DNA,PCR法筛选转基因阳性鼠。本试验采用Puc/BLG IN S和Chym os in基因,共使用710枚鼠原核胚进行研究,胚胎经注射后移植了25只受体,产下仔鼠77只;妊娠率分别为33.3%(5/15)和50%(5/10),胚胎成活率分别为9.47%(41/433)和l3.00%(36/277),阳性率分别为4.88%(2/41)和8.33%(3/36)。将阳性雌鼠配种妊娠后,对外源基因整合情况进行检测,结果表明初步获得了转基因阳性小鼠。     

人β-干扰素转基因家兔的建立及特性的初步研究

采用显微注射技术,将人β- 干扰素重组基因注射到家兔受精卵雄前核内,共注射受精卵265枚,获仔兔35只.通过打点杂交及Southern杂交检测,2号(?)、6号(?)、9号(?)、11号(?)与~(32)P-α-dATP标记的β-干扰素探针呈现阳性杂交;采用细胞病变抑制法检测血清中的干扰素活性,其中2号兔β-干扰素效价较正常兔高1000U/mL,9号兔较正常高3000U/mL.该结果表明,整合于兔体内的人β干扰素基因于机体水平获得了有效表达.     

转基因小鼠多重PCR快速检测方法的建立

以转赖氨酸基因小鼠为研究对象,根据转入基因的载体结构分别设计赖氨酸基因、新霉素抗性基因、转基因启动子及小鼠基因组内参基因特异性引物,优化反应条件,建立转基因小鼠多重PCR检测方法。结果表明,建立的方法可以用于转赖氨酸基因小鼠的检测,同时为转基因动物检测标准的建立提供试验依据。     

SPRN转基因小鼠脏器质量和动物行为学的比较分析

采用统计学计算Tg(Mosprn-B)/C57BL/6转基因小鼠与C57BL/6野生型小鼠雌雄两性的主要脏器质量与系数,并利用水迷宫观察游泳路径及时间以探讨SPRN基因对小鼠生理结构、生长发育等影响。结果表明,相同年龄的Tg(Mosprn-B)/C57BL/6转基因小鼠,雄性的体质量及心、肺、肝、肾质量显著大于雌性(P<0.01),脑质量差异比较显著(P<0.05);比较脏器系数,脑和肝的差异比较显著(P<0.05)。与C57BL/6野生型小鼠相比较,Tg(Mosprn-B)/C57BL/6转基因小鼠脑更重(P<0.01);比较脏器系数发现,脑差异极显著(P<0.01),肺、肾、脾差异较显著(P<0.05)。水迷宫定位航行结果显示,Tg(Mosprn-B)/C57BL/6转基因小鼠的逃避潜伏期小于野生型小鼠,第4天的潜伏期具有显著差异性(P<0.05);在空间搜索试验中,Tg(Mosprn-B)/C57BL/6转基因小鼠第1次穿越平台时间小于C57BL/6野生型小鼠,穿越平台的次数大于C57BL/6野生型小鼠。     

饲料添加黄金虫虫粉对小鼠肠道炎症相关细胞因子表达的影响

为研究日粮中添加不同比例黄金虫虫粉对动物肠道健康及局部炎症的影响,选取昆明小鼠28只,随机分为4组,各组基础日粮分别添加0％,5％,10％,20％黄金虫虫粉,饲喂2周后,灌胃0.05 mL/g的1× 108 CFU/mL的沙门菌菌液建立腹泻模型,荧光定量PCR检测小鼠肠道不同部位炎性因子及抗菌肽的表达量.结果显示,灌胃...     

转基因小鼠后代乳汁中外源基因的表达

运用传统育种方法，用整合有人凝血因子Ⅸ(hFⅨ）的转基因小鼠交和远交。通过选育，在其后代中出现4只双重杂合子（3♀，1♂）及2只纯合子小鼠（2♀）。收集雌鼠乳汁，用ELISA测定其中hFⅨ蛋白含量。结果表明，相对于单纯杂合子小鼠，纯合子小鼠的表达量无增高（P＞0．05），而双重杂合子小鼠的表达量有显著提高（P＜0．01）。结果提示 ，选育双重杂合子转基因后代小鼠，是一条提高转基因动物外源基因表达水平的有效途径。     

转高赖氨酸基因稻谷替代玉米对肉鸡生产、屠宰性能的影响

试验采用不同比例(40%、100%)的转高赖氨酸基因稻谷替代玉米饲喂AA肉鸡,以研究转高赖氨酸基因稻谷替代玉米的效果及可行性。结果表明:21日龄,40%组平均体增重比对照组显著提高6.86%;40%组和100%组的料肉比比对照组分别低7.3%和10.1%;试验组与对照组的胸肌率差异显著,但两试验组之间差异不显著,40%组、100%组分别比对照组显著提高20.9%和14.4%;全净膛率、腿肌率和腹脂率均差异不显著。42日龄,40%组和100%组与对照组的平均体增重均差异不显著,但两试验组之间差异显著,100%组的平均体增重比40%组提高12.8%;料肉比相当;胸肌率三组间差异显著,40%组、100%组分别比对照组显著提高11.4%和22.5%,100%组比40%组显著提高10.0%;40%组腿肌率比对照组显著提高12.5%,而100%组与40%组和对照组均差异不显著;40%组的腹脂率比100%组、对照组分别显著提高38.6%和30.8%,全净膛重、全净膛率差异不显著。试验得出,用40%和100%转高赖氨酸基因稻谷替代玉米饲喂肉仔鸡无不良影响。     

Tumor promoting effect of phenolphthalein on development of lung tumors induced by N-ethyl-N-nitrosourea in transgenic mice carrying human prototype c-Ha-ras gene

In order to examine tumor modifying effects of phenolphthalein (PhP), female transgenic mice carrying human prototype c-Ha-ras gene (rasH2 mice) were given a single intraperitoneal injection of 60 mg/kg body weight of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), followed by the diet containing 12,000 ppm PhP for 26-week. Histopathologically, alveolar hyperplasias, adenomas and adenocarcinomas were observed in the ENU + PhP group, but only hyperplasias and adenomas were observed in the ENU alone group. The incidence and multiplicity of adenocarcinomas in the ENU + PhP group was significantly increased as compared to that in the ENU alone group. The combined multiplicity of adenomas and adenocarcinomas in this group was also significantly higher than that of the ENU alone group. In addition, the ratio of area of adenomas in the ENU + PhP group was significantly higher than that in the ENU alone group. The result of our study suggests that PhP has a clear tumor promoting effect in the lung of rasH2 mice.     

Chi基因的克隆及转基因马铃薯植株的获得

为了提高马铃薯对真菌病害的抗性,本试验进行了马铃薯转基因抗病育种的初步研究。通过PCR扩增,从生防木霉菌Trichoderma atroviride的cDNA中克隆到一个内切几丁质酶基因Chi,构建了植物表达载体p33ECR-Chi。通过农杆菌介导的转化方法将Chi基因转化到马铃薯栽培品种“费乌瑞它”和“夏波蒂”试管薯片中。经侵染和共培养后,用卡那霉素和羟苄青霉素筛选抗性芽,共获得18株植株,对所得转化植株进行PCR检测,结果12株为阳性,占67%。本试验为利用基因工程技术提高马铃薯的生防能力奠定了基础。     

苷肽注射液对孕鼠致畸作用的影响

本试验通过对孕鼠注射不同剂量苷肽注射液,研究了苷肽注射液对孕鼠增重、窝重、着床数,胎鼠身长、体重、囟门、骨骼变化、畸形等发育情况的影响.结果表明,苷肽注射液在2.5～168.0 mg/kg体重范围内不具有母体毒性、胚胎毒性、致畸性.因此苷肽注射液不具有遗传毒性和致畸作用.     

中药增效抗菌复方对小鼠免疫功能的影响

为明确中药增效抗菌复方的抗感染作用机制,本实验进行其对小鼠免疫功能影响的研究.将受试药物按每千克体质量1 g、5 g和10 g的剂量对小鼠连续腹腔注射15 d,采用脏器系数测定法、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞法、乳酸脱氢酶释放法和MTT法分别对小鼠免疫器官指数、腹腔巨噬细胞吞噬功能、NK细胞活性、血清溶血素水平和淋巴细胞增殖能力进行测定.结果表明,该药物可以显著增加小鼠免疫器官指数,增强腹腔巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性,也可以明显提高血清溶血素水平和淋巴细胞增殖能力.因此,中药增效抗菌复方对小鼠非特异性免疫和特异性免疫功能均有增强作用.     

日本结缕草滞绿基因 ZjSGR 对烟草的转化及功能分析

SGR 基因是植物体内调控叶绿素降解的关键基因之一,在调控植物衰老以及响应非生物胁迫等方面也发挥着重要的作用。 本研究利用 DNA 重组技术,构建 35S::ZjSGR:YFP 植物表达载体,并通过农杆菌介导的方法成功转化烟草。PCR 和 qRT-PCR 结果显示日本结缕草滞绿基因ZjSGR已整合到烟草基因组中,并能够在转基因烟草中高效表达。在正常生长环境下,转基因烟草表现出黄化的表型。与对照相比叶绿素含量较低,光合速率下降。亚细胞定位实验证明ZjSGR定位在叶绿体,透射电镜观察结果表明过表达ZjSGR基因使叶绿体发育异常,且有加速降解的趋势。qRT-PCR结果发现转ZjSGR基因的烟草中SAG113,SAG12,NCED和AAO3的表达量明显高于野生型,衰老进程明显加快。本研究证明ZjSGR可在调控叶绿素降解和衰老的进程中发挥重要作用。