冬瓜、节瓜枯萎病菌人工接种技术研究

对冬瓜枯萎病菌与节瓜枯萎病菌在接种浓度、接种方法等方面进行了研究。结果表明:枯萎病病菌、FOC(theculturefiltratesofFusariumoxysporum)、FA(Fusaricacid)、标准镰刀菌酸均可用于鉴定抗性;病菌适宜的接种浓度为5×106个孢子/mL;FOC接种浓度以原液的2～4倍稀释液为宜,接种时间为播种后15～20d,即1～2片真叶时期,FA的鉴定浓度以150mg/L效果最佳。     

一株拮抗香蕉枯萎镰刀菌稀有放线菌的分离及鉴定

本研究采用苯酚、干热、SDS和超声波四种不同的预处理方法从五指山原始林区采集的土样中选择性分离得到的702株稀有放线菌,共筛选出4株具有拮抗香蕉枯萎镰刀菌活性的菌株,经过复筛,获得一株高活性的拮抗菌210-1-61。通过对其进行形态鉴定、生理生化特征鉴定和16SrDNA序列分析,结果表明该菌株与M．pattaloongensis JCM12833^T进化关系最近,其16SrDNA序列同源性最高,达98．89％;其形态与生理生化特性也与小单孢菌属M．pattaloongensis JCM12833^T很接近。此外,我们还构建了与该菌株同源性较高的模式菌株16SrDNA序列的聚类分析图,结果发现该菌株与Mpattaloongensis JCM12833^T稳定单独构成一个分支,二者亲缘关系最近,初步鉴定该菌株为Micrombonospora.pattaloongensis。本研究为今后探讨小单孢菌属稀有放线菌对香蕉尖孢镰刀菌具有拈抗活性提供研究实验材料。     

西瓜枯萎病菌生物学特性测定及防治试验

对西瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍｆ．ｓｐ．ｎｉｖｅｕｍ）的生物学特性测定结果表明：病菌生长温度范围１０～３５℃，适宜生长温度２５～２８℃；分生孢子在饱和相对湿度下萌发率为７２．６％，在水滴中达８５．２％；分生孢子的致死温度为５５℃１０ｍｉｎ；病菌生长的ｐＨ值范围在２．３８～１１．４５，最适ｐＨ值为６．６５～９．６９。室内药效测定结果表明：７０％代森锰锌３００倍，４０％灭病威３００倍和５００倍，２５％多菌灵３００倍和抗枯灵５００倍对枯萎病菌菌丝生长有明显的抑制作用。田间防治以嫁接苗的防治效果最好，达９１．２％；其次为１５％粉锈宁１０００倍和５０％ＤＴ６００倍，防效分别为６８．４７％和６５．０５％。     

马铃薯环腐病菌内生拮抗细菌的分离，筛选及鉴定

从8个不同来源的3个马铃薯(Solanun trberosum)品种(紫花白、晋薯七号和弗乌瑞它)的块茎中分离到240株内生细菌菌株,通过离体测定和温室实验,共得到55株对马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganenc subsp sepedonicum)有拮抗作用的内生细菌,占总菌数的22.9％。初步筛选出3株具有促生和潜在防治马铃薯环腐病的内生细菌,分别为芽孢杆菌(Bacillus sp．)A-10’、T3和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)H1-6。其中A-10’菌株定殖、促生和拮抗作用兼备,具有很好的开发应用前景。     

香蕉细菌性枯萎病菌16S rDNA片段的克隆及序列分析

香蕉细菌性枯萎病是香蕉上的一种毁灭性维管束病害(Salanoubat et al．，2002)。美国、墨西哥、中南美洲、以及亚洲一些国家都有此病发生，目前我国尚无分布的报道，因此它是被我国列为禁止入境的二类危险性有害生物。我国入世后，香蕉的进口量呈明显上升趋势，而这种病原细菌在与我国有贸易关系的国家(如菲律宾等国家)中发生极为普遍，一旦这种病原细菌传入我国，将会给我国的香蕉种植业造成不可估量的损失。本     

鸡胚原始生殖细胞的分离、培养及鉴定

采用Ficoll密度梯度离心法分离第19期(孵化68～72 h)艾维茵鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGC)，通过体细胞-PGC共培养进行了原代和传代培养，对PGC进行了碱性磷酸酶(AKP)和过碘酸雪夫氏反应(PAS)鉴定，并用细胞增殖核抗原(PCNA)免疫细胞化学检测了传代于鸡胚饲养层上PGC的增殖活性。培养的PGC经AKP和PAS鉴定均为阳性，AKP阳性为红棕色，PAS阳性为深红色，PCNA染色显示PGC集落为红棕色，表明PGC处于增殖状态。同时比较了不同体外培养条件(5%~20%胎牛血清(FCS), ITS培养液(M199+ 10 μg/mL 胰岛素+5 μg/mL转铁蛋白+3×10-8 mol/L亚硒酸钠), 条件培养液, 15%FCS+ITS, 15%FCS+40% 条件培养液)下PGC增殖情况。发现未经密度梯度离心的PGC生长较离心的PGC好，且5%FCS在原代培养中起较好的促增殖作用；而传代培养时在不同培养条件下，5%FCS组或ITS组形成的PGC集落的直径较大，而仅用单纯的条件培养液效果并不明显。结果表明除鸡胚饲养层可作为PGC增殖的支持体系外，在体细胞-PGC共培养方式下5%FCS或单独的ITS也可作为PGC体外增殖的一种培养体系。     

柱花草炭疽病菌的鉴定及生物学特性研究

对柱花草炭疽病菌的鉴定及生物学特性测定结果表明：柱花草炭疽病菌为盘长孢状刺盘孢菌[Colletotrichumgloeosporioides（Penz）Sacc]．病菌生长温度15～36℃;适宜生长温度25～30℃;分生孢子萌发的温度6～40℃,最适萌发温度为28℃;分生孢子在饱和湿度下萌发率为83．1％,在饱和湿度加水滴中达87．9％;分生孢子的致死温度为49℃10min;病菌生长的pH值是2．5～14．0,最适pH值为6．4～7．2;病菌对碳源的利用较氮源好。     

烟草青枯病菌拮抗菌的筛选、鉴定及生防特性研究

烟草青枯病危害严重,以拮抗菌进行防病的生物防治手段成为研究热点。从不同烟田分离纯化出238株细菌菌株,首先经牙签接种初筛,选取对青枯病菌抑制效果较好的菌株制备其抑菌物质的粗提物,以牛津杯法复筛,最终获得3株对烟草青枯病菌有明显抑制作用的拮抗细菌。全细胞脂肪酸、16S rDNA及gyrB基因测序等分析结果表明,菌株H19、Y6为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),菌株H34为甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)。3株拮抗菌经CAS检测平板法和Salkowski比色法,发现均具有产铁载体和吲哚-3-乙酸(IAA)的能力,以菌株H19能力最强。温室促生试验结果表明,3株拮抗菌能显著促进烟草株高、鲜重及干重等指标,与对照相比,平均增长率分别达到70%~115%、40%~49%和32%~42%。温室控病试验结果表明,菌株H19、H34和Y6明显降低烟草青枯病的发病率,防效达76.57%、60.98%和69.83%,稍逊于农用链霉素处理的78.66%。     

甜瓜VQ家族基因鉴定及白粉病菌响应分析

VQ家族基因是植物特有的一类基因,其编码蛋白主要与WRKY蛋白相互作用协同调控下游基因表达,在植物生长发育及抵御各种外界环境胁迫中起重要作用。为揭示甜瓜VQ家族基因在抗白粉病中的功能,本研究采用生物信息学方法从甜瓜基因组中鉴定到26个VQ家族基因,这些基因不均匀地分布在甜瓜11条染色体上。系统进化分析表明,该家族成员分布于不同的分支中,分别与拟南芥VQ家族蛋白不同成员聚在一起。基因结构分析表明,甜瓜VQ家族基因序列均无内含子,只有1个外显子。组织表达分析表明,1个甜瓜VQ家族基因组成性表达,23个甜瓜VQ家族基因组织特异性表达。此外,白粉病菌侵染之后,6个VQ家族基因呈现不同程度的响应。本研究结果为进一步研究甜瓜VQ家族基因在甜瓜抗白粉病中的功能奠定了理论基础。     

辣椒BES1基因家族鉴定及表达分析

BES1基因是油菜素内酯信号途径中的关键转录因子。为了解辣椒中BES1基因家族功能,以已测序辣椒CM334为试验材料,根据已公布辣椒基因组数据,本研究利用生物信息学方法对辣椒BES1基因家族进行鉴定,并对基因结构、结构域、系统进化关系、基因表达模式和生物非生物胁迫表达情况进行分析。结果表明,辣椒中有9个候选BES1基因,根据BES1基因结构可将其分为ClassⅠ和ClassⅡ 2大类,Class Ⅰ 和 Class Ⅱ 在结构上差异较大。辣椒BES1编码蛋白介于181~713个氨基酸范围内,分子量为20.22~78.23 kDa,等电点介于5.48~9.23。转录组数据分析发现,辣椒BES1基因在辣椒中表达具有差异性。在脱落酸、低温、高温、茉莉酸甲酯和疫病胁迫下CA04g20150和CA12g17430均被诱导上调,表明其在生物和非生物胁迫中发挥作用。本研究结果为进一步探究BES1基因家族调控植物抗逆的分子机制奠定了基础。     

宽皮柑橘‘W默科特’黑腐病菌的分离与鉴定

通过对宽皮柑橘‘W默科特’黑腐病菌的分离鉴定,结果发现该真菌属于柑橘链格孢（Alternaria citri Ellis et. Pierce）,半知菌亚门链格孢属,引起柑橘黑腐病。     

转GhB301基因棉花响应枯萎病菌侵染的转录组分析

乙烯响应因子(ethylene responsive factor, ERF)可以激活或者抑制下游病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病信号转导途径中发挥着重要作用。为探究ERF-B3亚组基因GhB301在棉花抗枯萎病中的分子调控机制,本研究利用已获得的转GhB301基因棉花株系,通过孢子悬浮液蘸根的方法对转GhB301基因棉花株系(N)和野生型对照(WT)进行接菌处理,抗病性鉴定结果表明,过表达GhB301的N株系增强了对枯萎病的抗病性,其病情指数为14.77,显著低于WT(病情指数为37.50);枯萎病菌侵染0、6、12、24、48 h后,利用RNA-seq技术对N和WT的根部组织进行测序分析,共得到273 111 170个clean reads,其Q30均大于87.64%,将clean reads与陆地棉参考基因组TM-1比对,获得了14 021个差异表达基因(DEGs)。与WT相比,转基因株系能够在病原菌侵染后更快速地做出响应。GO及KEGG富集分析发现共有135个DEGs参与氧化还原过程,67个DEGs参与防御反应,31个DEGs参与苯丙烷类生物合成,推测这些DEGs可能与转基因棉花的枯萎病抗性增强存在密切关系。本研究结果为阐明GhB301基因响应棉花枯萎病菌侵染规律奠定了基础。     

猴头菌素分离纯化、结构鉴定及体外活性研究

为探究猴头菌功效成分的结构构成及其生物活性,对猴头菌发酵菌丝体中猴头菌素进行分离纯化和结构鉴定,并对其抑菌活性、抗肿瘤活性及刺激神经细胞分泌生长因子能力进行分析。采用乙醇回流提取,并依次通过石油醚、乙酸乙酯萃取得到粗萜物质,粗萜物质经硅胶柱层析和半制备高效液相色谱分离纯化得到组分Fr-3-1,红外光谱及质谱分析表明其为猴头菌素A类似物。采用滤纸片法测定Fr-3-1抑菌活性,MTT法测定其体外抗肿瘤活性,酶联免疫吸附法测定其刺激神经细胞分泌生长因子能力。结果表明,Fr-3-1对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性,对人胃癌细胞MGB-523有一定的抑制效果,其最小抑菌浓度(MIC)值分别为0.781 mg·mL~(-1)和453.14μg·mL~(-1)。当浓度为100μg·mL~(-1)时,Fr-3-1促进大鼠星型神经细胞的分泌神经因子浓度为46.63 pg·mL~(-1),显著高于同浓度的肾上腺素。本研究结果为猴头菌作为治疗老年痴呆症和神经衰弱等症状的备选药物及保健食品的开发利用提供了理论依据。     

西芹鲜根丙酮浸提物层析流分对黄瓜枯萎病菌的化感作用以及化感物质鉴定

为探明西芹鲜根中化感物质成分,利用柱层析法对西芹鲜根丙酮浸提液进行4次层析,每次层析后获得的流分与黄瓜枯萎病菌共培养,测定菌落直径与孢子萌发率,以化感抑制效果筛选最佳流分,然后通过GC-MS对第4次层析最佳流分中化感物质进行鉴定。结果表明,各次层析最佳流分均对黄瓜枯萎病菌菌丝生长及孢子萌发有较强抑制作用,第4次层析获得的最佳流分(RA3246、RA3344、RA9889、RA91064)对枯萎病菌菌丝生长的化感抑制效果[相对于第4次层析丙酮对照(ACK4)]分别升高至28.69%、37.83%、42.44%、33.83%,孢子萌发抑制率分别升高至50.72%、50.66%、55.02%、59.37%。通过GC-MS共鉴定出有机酸、酚、醇、酯类、杂环有机物及含氮化合物6类12种化感物质,分别为3-羟基扁桃酸、硫代乙醇酸、2,4-二叔丁基苯酚、十二烷醇、2-甲基-2-丙烯酸十三烷酯、2-丙烯酸十二烷基酯、2-丙稀酸十五烷基酯、二甲基环己酯、3,4-环氧呋喃、十六烷基二甲基叔胺、(Z)-9-十八烯酸酰胺和二丁氨腈。研究获得结果可为利用西芹提取物防控黄瓜枯萎病提供理论基础。     

辣椒CDPK基因家族的鉴定、进化与表达分析

钙依赖性蛋白激酶(CDPK)在植物细胞钙信号转导中起重要作用。为筛选鉴定辣椒CDPK基因家族,探讨其基因功能及进化模式,本研究利用生物信息学方法,在辣椒品种遵辣1号基因组中对其进行系统鉴定分析;同时,与辣椒品种CM334基因组进行比较分析。结果表明,遵辣1号基因组中共鉴定获得30个CDPK基因,分布在11条染色体上,命名为CaCDPK01~CaCDPK30。其中,有6对CaCDPK基因发生了片段复制。辣椒CDPK基因家族可分为4个亚族,亚族间基因数目及结构差异较大,Ⅳ亚族最保守。CaCDPKs在辣椒不同组织及成熟的不同阶段中具有表达特异性,部分基因对之间表达趋势相关性较高。在2个辣椒品种中,CDPK基因也发生了明显分化。本研究为深入解析CaCDPKs基因功能及进化模式奠定了重要的理论基础。     

不同抗性蚕豆品种根系分泌物对枯萎病菌的化感作用及根系分泌物组分分析

蚕豆枯萎病是土传病害,其发生与蚕豆根系分泌物有密切关系。本文以3个枯萎病不同抗性蚕豆品种——‘89-147’(高抗)、‘8363’(中抗)和‘云豆324’(感病)为材料,通过水培试验收集根系分泌物,测定根系分泌物对镰刀菌孢子萌发和菌丝生长的影响,分析对枯萎病表现出不同抗性的蚕豆品种根系分泌物中糖、氨基酸和有机酸的含量,分离鉴定了根系分泌物中氨基酸和有机酸的组分。结果表明,抗病品种的根系分泌物抑制了尖孢镰刀菌的孢子萌发和菌丝生长,在加入5 mL中抗品种根系分泌物时,显著促进尖孢镰刀菌孢子萌发,但对菌丝生长无显著影响;而在加入1 mL感病品种根系分泌物时,就能显著促进尖孢镰刀菌孢子萌发和菌丝生长。不同抗性蚕豆品种根系分泌物中氨基酸总量和总糖含量随抗性的降低而升高,有机酸分泌总量则随蚕豆品种对枯萎病的抗性增加而升高。感病品种和中抗品种中检出15种氨基酸,而高抗品种中检出14种,组氨酸只存在于中抗品种中,脯氨酸仅在感病品种中检出,3个蚕豆品种根系分泌物中均未检出精氨酸。蚕豆根系分泌物中天门冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸含量高,可能会促进枯萎病的发生,而蛋氨酸、赖氨酸和丝氨酸含量高可能抑制枯萎病发生。酒石酸仅在抗病品种中存在,根系分泌物中有机酸种类丰富,有助于提高蚕豆对枯萎病的抗性。蚕豆对枯萎病的抗性不同,根分泌物对镰刀菌孢子萌发和菌丝生长的影响也不同,而这种抗病性差异与蚕豆根系分泌物中糖、氨基酸、有机酸的含量和组分密切相关。     

百菌清降解菌BJQ2的分离、鉴定及影响因素研究

采用未有百菌清用药史的土壤定向培养49d,分离出50株百菌清耐受菌株,经初筛、复筛后得到1株降解能力最强的细菌BJQ2,经形态学、生理生化试验、16SrDNA序列同源性比对及系统发育树的分析,初步确定为阴沟肠杆菌（EnterobactercloacaeB9）,BJQ2可以以百菌清为唯一碳源于基础培养基中生长。BJQ2降解百菌清的最适宜条件为：培养温度30~35℃,初始pH值为7.0~8.0,百菌清的初始浓度为20mg·L-1,选用菌体母液（OD600=0.35）,以10%的接种量接种,6d后提取百菌清,利用气相色谱进行检测分析,计算后发现百菌清的降解率可以达到79.2%。