猪肺炎支原体二乙烯亚胺灭活条件的研究

为了探讨猪肺炎支原体灭活苗的灭活条件,对猪肺炎支原体C株抗原液用灭活剂二乙烯亚胺(BEI)进行了灭活试验,测定分析了37℃条件下不同灭活时间及不同浓度的BEI对猪肺炎支原体的灭活效果。结果表明,猪肺炎支原体C株的最佳灭活条件为4.0 mmol·L-1的BEI在37℃条件下作用24 h,灭活后使用等量的硫代硫酸钠中和残留BEI,可确保疫苗灭活彻底且无残留。     

猪流行性腹泻病毒JS2008株的传代培养及遗传变异分析

[目的]明确猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)JS2008株的序列特征及其连续传代后的序列变化规律,为筛选出新的疫苗候选毒株提供参考依据.[方法]将分离自华东地区某发病猪场的PEDV JS2008株在Vero细胞系上传代培养至100代,选取部分代次进行病毒滴度测定;每隔10代提取病毒RNA,采用RT-PCR对各代次病毒的S基因、ORF3基因和N基因进行扩增,并与PEDV经典和流行参考毒株进行序列比对及遗传变异分析.[结果]PEDV JS2008株经连续传代至100代,其病毒滴度由105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL.JS2008株在传代过程中共有11处碱基发生突变,其中9处发生在传代培养的第10~20代,变异主要位于S基因上(7/11);同时发现JS2008株及其传代株与attenuated DR13株的相似性最高.基于S基因和N基因序列构建的PEDV系统发育进化树均表明JS2008株各代次与attenuated DR13株同处于Group 3进化群;基于ORF3基因序列构建的PEDV系统发育进化树则显示,JS2008株各代次与attenuated DR13株均处于同一进化群(Group 2).[结论]PEDV JS2008株通过Vero细胞系进行体外连续传代至100代,其碱基突变主要发生在病毒传代培养的第10~20代,病毒滴度明显提高,抗原量增加,为研制新型PEDV疫苗提供可能,同时推测病毒传代培养10~20代是病毒发生变异以适应细胞培养的活跃期.     

猪流行性腹泻病毒CH-HeNXX-2017株全基因组序列测定与分析

为了解猪流行性腹泻病毒在河南流行毒株全基因组遗传进化水平,应用RT-PCR方法从疑似猪流行性腹泻病毒感染的病料中扩增出全基因组序列,并将PCR产物纯化后连接pMD20-T载体,转化JM109感受态细胞,挑选单克隆进行测序,获得的序列经过DNA STAR中Edit Sequence软件对全基因组序列进行拼接。结果表明,猪流行性腹泻病毒CH-He NXX-2017株全长28 038 nt(除去poly A);进化树分析显示,该毒株与IA1,USA Colorado2013,MN和PC22A等毒株亲缘关系较为接近,与国内外早期分离株如CV777,LZC,DR13等毒株亲缘关系较远。揭示猪流行性腹泻病毒一直处于不断的进化中,需要一直密切监控病毒进化趋势,为临床诊断以及疫苗研发等提供理论参考。     

猪流行性腹泻病毒陕西渭南株的遗传变异

从陕西省渭南某规模化猪场采集疑似猪流行性腹泻(PED)仔猪病料进行病毒检测,旨在从基因遗传变异方面分析疾病发生的可能原因。通过RT-PCR从疑似仔猪20份小肠样品中检测到9份PED病毒阳性样品,并扩增出PED病毒M、ORF3和S基因的部分序列。序列分析结果表明,与CV777疫苗株对比,样品渭南(WN)株PEDV M基因高度保守,同源性为98.2%;ORF3基因存在11处碱基突变,同源性为98.2%;S基因突变较大,存在4个插入区域,分别是164~166、177~179、181~186和416~418nt,内分核心中和表位区(COE,499~638位氨基酸)存在9个氨基酸突变位点。遗传分析显示,WN株M基因与中国近期分离毒株亲缘关系较近;ORF3基因与同处在G1群中的中国毒株亲缘关系较近,而与CV777疫苗株亲缘关系较远;S基因与中国早期分离毒株及CV777疫苗株亲缘性较远,与当前的流行株亲缘关系密切。这些结果表明,WN株与CV777疫苗株相比,有明显的遗传变异倾向,可能导致目前PEDV疫苗免疫效果下降,PED疫情大规模流行。     

对猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的佐剂作用

E515-A是一种含人参茎叶皂苷(GSLS)的白油佐剂。将E515-A和含猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原的水相在低剪切力(转速200 r·min^-1)下混合,形成油乳剂疫苗。为观察E515-A对PEDV灭活疫苗的免疫增强作用,将72只ICR小鼠随机分成6组,分别进行2次(间隔2周)皮下注射:(1)0.9% NaCl溶液,(2)PEDV抗原+0.9% NaCl溶液,(3)PEDV抗原+GSLS,(4)PEDV抗原+白油佐剂,(5)PEDV抗原+E515-A和(6)PEDV抗原+氢氧化铝铝胶。于一免后24 h采血检测血清IFN-γ水平和NK细胞杀伤活性;于二免后检测血清特异性IgG及IgG1和IgG2a水平,制备脾淋巴细胞检测细胞增殖能力。结果表明,E515-A对于PEDV疫苗诱导的免疫反应具有显著的促进作用,免疫增强效果优于铝胶佐剂。和对照组比较,E515-A油佐剂可以显著促进免疫小鼠的NK细胞杀伤活性,促进细胞因子IFN-γ的产生,增强脾淋巴细胞对刀豆蛋白A(Con A)和脂多糖(LPS)刺激的增殖应答能力,提高血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a水平。为增强猪的疫苗免疫效果,E515-A作为猪疫苗的佐剂值得进一步研究。     

猪流行性腹泻病毒的分离培养与鉴定

上海市农业科学院畜牧兽医研究所在上海郊区分离到一株猪流行腹泻病毒，以人工攻毒发病猪的小肠粘膜无菌处理后接种已长成单层的ＶＥＲＯ传代细胞，并在维持液中加入胰酶５０μｇ／ｍＬ和２％的小牛血清。     

中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展

2010—2011年中国境内的猪流行性腹泻（PED）大流行给养猪业造成重大经济损失。因疫苗免疫无法控制疫病流行,因此学者普遍认为猪流行性腹泻病毒（PEDV）出现了新的变种。论文综合分析了这个时期国内学者PEDV分子流行病学的研究结果,又对国内新近分离的PEDV的11个毒株的全基因序列进行遗传进化分析,进一步确定了国内暴发流行的PEDV毒株已远离中国86年分离的毒株和欧洲毒株CV777,成为了一个新的基因型。毒株基因变异应该是造成免疫失败和仔猪死亡率高的主要原因。进一步分析发现分离毒株的全长基因序列和棘突蛋白（S）基因序列长度有差异,其他基因长度保守性强。S基因的变异率高于其他基因,特别是短期内基因突变主要发生于S基因。综合分析认为国内变异毒株虽与韩国毒株遗传关系较近,但从境内毒株衍生和进化而来的可能性更大。因2006年已经观察到PEDV的免疫失效和PED流行,2010—2011年PED集中暴发可能是病原长期突变和适应性积累的结果,提示今后应充分发挥全国动物疫病预警网络的作用,加强毒株进化检测和疫病预警,优化疫病的防控手段,降低疫病发生频次和规模,减小疫病发生损失。     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的RT-PCR鉴别诊断

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）为套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的病毒，引起猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）。该病是一种猪肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征，各种年龄的猪均易感染，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％，尤其是哺乳仔猪受害最严重，该病主要发生于冬季，夏季也可发生。猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）为套式病毒目冠状病毒科、冠状病毒属的病毒，是猪传染性胃肠炎（porcine transmissible gastroenteritis，TGE）的主要病原。该病是一种急性、高度接触性传染病，以呕吐、严重腹泻、脱水为特征的传染病，对新生仔猪具有高度致死率。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5周龄以上的猪死亡率较低，多成僵猪，使养猪饲料报酬降低。     

3株猪流行性腹泻病毒M基因克隆与序列分析

【目的】了解近年来京津冀地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株M基因的变异情况。【方法】用RT-PCR技术从京津冀地区部分仔猪腹泻样品中扩增与克隆3株PEDV流行株M基因全长序列,并进行序列测定和分析。【结果】基因序列结果显示,3株PEDV的M基因全长均为681nt,其核苷酸同源性达99.7%以上,在系统发育进化方面属于同一簇。M基因系统发育进化关系显示,虽然这3株PEDV与中国以前PEDV流行毒株及疫苗株CV777属于不同的簇,但其与国内外其他PEDV参考毒株的核苷酸同源性均达96.5%以上。【结论】M基因仍然是检测PEDV的良好目的基因。     

15株猪流行性腹泻病毒河南株ORF3全基因的克隆与序列分析

为调查近年来河南省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,从2015—2017年河南部分地区猪场患腹泻仔猪的小肠组织及内容物中克隆了15株PEDV ORF3基因,并对其进行了序列测定及分析。结果显示,15株PEDV河南株 ORF3 基因序列长度均为675 bp。15株PEDV分离株之间核苷酸同源性为94.4％～99.9％,与经典毒株CV777、弱毒株attenuated DR13核苷酸同源性分别为95.7％～97.0％和96.6％～98.1％。遗传进化分析显示,PEDV分为两大群,3株分离株属于G1群,单独成一个小的分支。其余12株分离株与往年河南流行株、大部分国内分离株、韩国、日本、美国及法国毒株位于G2群,亲缘关系较近,而与经典毒株CV777亲缘关系较远。表明河南省PEDV有变异和进化趋势,为河南省PED的防控和疫苗的研制提供技术支持。     

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株侵染Vero细胞特性分析

为了探究PEDV(猪流行性腹泻病毒)流行毒株SHpd/2012侵染细胞的特性,研究采用IFA(间接免疫荧光)及绘制病毒一步生长曲线等方法,对感染PEDVSHpd/2012株后的Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)病变过程进行研究。结果发现,CPE(细胞病变)主要表现为细胞肿胀、变圆、皱缩、聚集成合胞体甚至从培养瓶壁大量脱落。IFA结果显示,接毒后12h病毒开始增殖,在接毒后36h时感染细胞数量最多,其后病毒增殖速度逐步下降,60h时趋于平稳。病毒一步生长曲线结果显示,SHpd/2012株感染细胞后24~60h的毒价一直处于较高水平,60h后开始下降。此外,本研究成功克隆并真核表达了PEDV S蛋白,为研究PEDV与受体蛋白的互作及病毒的致病机制奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白的原核表达

本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pet-32a-M在体外可以被成功表达.     

猪流行性腹泻病毒N基因的克隆及原核表达

从患猪流行性腹泻的病猪粪便中分离了猪流行性腹泻病毒(PEDV)命名为HLJBY,将病毒在Vero细胞上传代,使之适应生长。将扩增的猪流行性腹泻病毒的N基因克隆到原核表达载体PET30a上,构建了重组表达质粒PET-30a-PEDV-N,并在37℃的条件下诱导表达,通过不同时间取样,经SDS-PAGE分析结果表明,该蛋白...     

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株Nsp8基因分析及真核表达

应用生物信息工具和分子克隆技术对PEDV SHpd/2012株Nsp8基因编码的蛋白进行了结构和功能分析以及体外表达。结果显示,NSP8蛋白是一个含有194个氨基酸的亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜区。SHpd/2012毒株高度保守的NSP8氨基酸序列与CV777、AJ1102等毒株同源性高。NSP8蛋白也是一个单体蛋白,共有5个优势抗原表位。此外,本研究成功地在293T细胞内表达了NSP8蛋白,为进一步研究猪流行性腹泻病毒NSP8蛋白的功能提供了理论基础。     

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体(MAb),本试验将Vero细胞中增殖的PEDV超速离心纯化,作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术和PEDV重组S蛋白为基础的间接ELISA方法,制备并筛选能稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞;分别采用间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验,对单克隆抗体的亚型、特异性等生物学特性进行鉴定。结果表明,本试验成功获得了1株稳定分泌PEDV特异性抗体的杂交瘤细胞株5C3。MAb亚类鉴定为IgM,轻链为k型。杂交瘤细胞连续传至20代,细胞培养上清液和小鼠腹水抗体效价分别稳定在1∶600和1∶10 000。特异性试验结果显示,MAb不与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PrV)、猪圆环病毒(PCV2)发生交叉反应。western-blot结果显示,MAb能特异性识别PEDV的重组S蛋白。IFA试验结果表明,MAb能与PEDV感染的vero细胞产生特异性荧光。说明本试验获得的MAb能特异性识别重组及天然的PEDV S蛋白,具有良好的抗原性和特异性。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)种毒特性研究

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)可导致仔猪严重腹泻,死亡率极高,是危害养猪业的重要病毒。免疫接种是预防TGEV感染有效手段,TGEV疫苗开发对防治TGEV感染具有重要价值。制备纯净种毒是疫苗株基础。本试验通过细胞培养、病毒培养、间接免疫荧光、RT-PCR、理化试验、中和试验、纯净度检测等试验技术对TGEV自主致弱毒株HR/DN1进行系统特性,结果表明,该病毒理化特性和分子生物学特性均与TGEV相符,且该病毒具有繁殖滴度高、传代稳定、病毒纯净等特点,符合种毒制备基本条件,为开发TGEV疫苗提供基础。     

PEDV CH-HeB14株S1蛋白表达及其多克隆抗体的制备

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH-HeB14毒株S1蛋白的多克隆抗体,为PEDV新流行毒株诊断试剂盒和疫苗研制提供基础材料。【方法】利用RT-PCR扩增PEDV CH-HeB14毒株S1基因,对序列特征进行生物信息学分析,用PCR将S1基因截成不同片段(S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2),分别克隆至原核表达载体pET28a,转化BL21(DE3)构建重组表达菌株;用IPTG诱导重组蛋白表达,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。将表达蛋白与佐剂乳化制备免疫原免疫兔多克隆抗体,Western blotting和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性。【结果】PEDVS1、S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2片段长度依次为2 079,600,600,878,549和447bp。系统进化树表明,CH-HeB14株与2010年以来的22个新流行毒株亲缘关系较近,而与经典疫苗株CV777、attenuated DR13亲缘关系较远。成功截短表达了S1蛋白不同区段S1A、S1B和S1C-1重组蛋白(rS1A、rS1B和rS1C-1),且蛋白均以包涵体形式表达。制备了抗rS1A、rS1B和rS1C-1蛋白的多克隆抗体,其与这3种蛋白反应良好,且抗rS1A重组蛋白的多克隆抗体Western blotting效价为1∶32 000;IPMA结果显示,该抗体能与PEDV CHHeB14毒株和经典疫苗毒株attenuated DR13均发生特异性反应。【结论】成功克隆、表达了变异毒株PEDV CHHeB14的S1基因,所制备的S1蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性。     

刀豆蛋白A纯化猪流行性腹泻病毒的研究

为开发一种新型高效、低成本的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗原纯化方法,本研究尝试了一种基于凝集素(刀豆蛋白A,Con A)的PEDV浓缩纯化方法。通过Con A与PEDV病毒粒子的特异性结合,形成Con A-PEDV复合物,然后通过低速离心和竞争性解离即可实现病毒纯化。结果表明:1)当Con A的使用浓度为80 μg/mL,室温作用2 h,4 000 r/min离心15 min时,纯化效果较佳;2)利用Tris-HCl缓冲液(pH 7,0.01 mol/L,内含200 mmol/L甲基-α-D-吡喃甘露糖苷和50 mmol/L NaCl)进行解离时,较PBS缓冲液有更高的解离效率;3)该方法病毒回收率大约为80%,总蛋白去除率可达90%。综上,本研究利用Con A纯化PEDV是可行的,为高质量PEDV灭活疫苗的研发奠定基础。