鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS1的原核表达及纯化

根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。     

谷物胚乳中淀粉合成酶及其同工型的研究进展

谷物中通常以淀粉的形式储存能量,淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。在胚乳中,支链淀粉生物合成中涉及二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶(ADP glucose pyrophosphorylase,AGPase),可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase,SS),淀粉分支酶(starch branching enzyme,BE)和淀粉脱支酶(starch debranching enzyme,DBE)及其同工型一系列的酶反应,而直链淀粉合成需要AGPase和颗粒结合淀粉合成酶(granule-bound starch synthase,GBSS)的协同作用。同时质体淀粉磷酸化酶(plastidial starch phosphorylase,Pho)很可能对胚乳淀粉生物合成中的底物形成起重要作用。这些酶及其同工型的相互作用和差异表达使淀粉结构产生变化进而对谷物的质量和产量产生影响。综述了谷物胚乳淀粉生物合成过程中必要的酶及其同工型的作用,通过推断这些酶及其同工型在谷物胚乳中促进淀粉的生物合成所产生的作用,为提高谷物的产量和优化其品质提供参考。     

多肽配体R18促进水稻弱势籽粒灌浆的初步研究

14-3-3蛋白在植物生长发育中具有重要的调控作用,其亚型GF14f在水稻弱势籽粒中高表达是其灌浆结实差的一个重要的原因。本研究首先通过分子对接的方式,发现多肽R18与GF14f蛋白具有潜在的结合位点,进而采用体外竞争性实验,发现R18能够竞争性的与GF14f蛋白结合,从而导致GF14f与SuS2、SS和AGPS三个互作靶蛋白间的结合力减弱,与此同时,体外酶活实验表明,外源添加R18能够显著提高淀粉合成酶(StSase)、蔗糖合成酶(SuSase)和ADPG焦磷酸化酶(AGPase) 3个酶的活性。免疫共沉淀实验表明, R18在水稻籽粒中除了能和GF14f结合外,还能与GF14b、GF14c、GF14d及GF14e结合, BiFC结果也证实了上述结果。籽粒灌浆期,外源喷施60 mg L^–1浓度的R18于弱势籽粒上, StSase、SuSase及AGPase酶活性显著提高,弱势籽粒千粒重及结实率也显著提高。本研究结果表明,多肽配体R18能够与14-3-3互作靶蛋白竞争性结合,减弱14-3-3与靶蛋白间的结合力,进而释放籽粒灌浆过程中蔗糖转化及淀粉合成途径中关键酶的活...     

马铃薯块茎淀粉积累及相关酶活性的研究

研究不同类型马铃薯淀粉积累及相关酶活性的变化动态,探讨各种酶活性与淀粉含量的关系。以"陇薯3号"、"宁薯15号"、"农家1号"(高淀粉马铃薯品种)和"陇薯6号"、"青薯168号"、"宁薯14号"(低淀粉马铃薯品种)为试验材料,取不同发育时期的块茎,分别测定淀粉含量、ADP焦磷酸化酶(AGPase)可溶性淀粉合成酶(SSS)和淀粉分支酶(DBE)活性。6个马铃薯品种的AGPase、SSS、DBE酶活性均呈现单峰曲线变化趋势;6个马铃薯品种的淀粉含量的变化曲线表现为"升高-降低",薯块重量为120~200 g时,马铃薯淀粉总量达到最大值。马铃薯块茎淀粉含量是各种酶综合作用的结果。     

果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalactuionasem, PG)是一种细胞壁结构蛋白,可以催化果胶分子多聚α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,使细胞壁结构解体,导致果实软化。本文采用qRT-PCR方法,分析不同生长阶段菌丝侵染的油菜叶片中多聚半乳糖醛酸酶基因的表达模式。结果表明：(1)采用RT-PCR从果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)菌核中扩增多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA,其全长为1143 bp,命名为CsPG1 (GenBank登录号为KR296662),编码380个氨基酸残,根据侵染油菜叶片的表达量,确认CsPG为基因家族的主效基因;(2)将CsPG1基因连接pET28a(+)载体并转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3),获得包涵体形式,但对底物(聚半乳糖醛酸)没有活性的蛋白;(3)最适CsPG1包涵体溶解的尿素浓度6 mol L^–1,采用缓慢稀释低温复性的方法对重组蛋白CsPG1进行了重折叠复性试验,经高亲和力的Ni-NTA树脂纯化后为得到单一条带,获得可溶性蛋白,复性后的多聚半乳糖醛酸酶比活力为5.02 U mg^–1;(4)生物试验表明,CsPG1蛋白能够加速嘉陵40 (Morus atropurpurea Roxb.)桑椹的成熟和软化,推测该蛋白与肥大性菌核病菌对桑椹的侵染有关。这一结果揭示了不同果桑品种对菌核病敏感性的差异,为果桑生产中菌核病的防控提供了分子证据.     

小麦籽粒胚乳中淀粉分支酶基因的RNAi表达载体的构建及表达

构建sbe2b的RNAi表达载体,并对其转化烟草,检测其对直链淀粉合成的影响.利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定小麦胚乳淀粉分支酶sbe2b的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从小麦籽粒胚乳中成功克隆出了小麦胚乳中淀粉分支酶sbe2b基因...     

大豆14-3-3蛋白与转录因子蛋白GmMYB173的互作

14-3-3蛋白家族在真核生物中普遍存在,可与其他蛋白相互作用,调控多种生理生化过程。MYB基因家族作为植物中最大的一类转录因子,广泛参与了植物的生长发育和代谢调控。本研究通过分析1个从自贡冬豆中克隆的MYB转录因子GmMYB173的亚细胞定位情况,发现GmMYB173在细胞核中特异表达;序列分析发现GmMYB173与GmMYB176相似,具有1个14-3-3蛋白的潜在结合结构域,即pST结合结构域。通过重叠延伸PCR (SOE-PCR)删除了GmMYB173序列中pST结合结构域编码序列,发现GmMYB173细胞核表达特异性消失。酵母双杂交互作分析表明,大豆基因组中所有具有表达的16个14-3-3蛋白GmSGF14a~GmSGF14p均能与GmMYB173互作。β-半乳糖苷酶活性分析发现,与GmMYB173互作最强的是GmSGF14n,GmSGF14k、GmSGF14e和GmSGF14o其次。这些结果说明14-3-3蛋白不仅与GmMYB173互作,且可能调控其在细胞内的定位,有助于研究14-3-3蛋白与GmMYB173的互作关系及其在大豆生长发育中的作用。     

小麦TaNADP-ME1基因在大肠杆菌中的融合表达及可溶蛋白纯化

NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。     

棉花GhCOMT3基因的原核表达、纯化及鉴定

为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结果表明,pET-28a-GhCOMT3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达产物,为在蛋白水平上研究GhCOMT3基因功能奠定了基础。     

小麦蔗糖合成酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的研究进展

植物蔗糖合成酶(SS)和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)在植物淀粉生物合成过程中起着重要的作用,淀粉是小麦等禾谷类作物子粒胚乳的重要组成成分,与作物的产量和品质密切相关。综述了小麦蔗糖合成酶和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的细胞定位生物学功能、分子生物学分析及酶活性的调控,并进一步对两种酶的研究作出设想。     

大穗型小麦品种强、弱势籽粒淀粉积累和相关酶活性的比较

在大田条件下, 以两个大穗型小麦品种山农12和PH01-35为材料, 对籽粒发育过程中强、弱势籽粒淀粉积累及其相关酶活性变化进行了比较研究。结果表明, 两品种强势粒直链淀粉积累量和支链淀粉积累量均高于弱势粒。Logistic方程模拟淀粉积累过程, 强势粒淀粉积累起始势(C₀)高, 活跃持续期长, 平均积累速率(R_mean)高, 最终淀粉积累量高。 籽粒蔗糖合酶(SS)、ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、UDPG焦磷酸化酶(UGPase)、可溶性淀粉合酶(SSS)和束缚态淀粉合酶(GBSS)活性均呈单峰曲线变化, 强势粒上述酶活性均高于弱势粒。花后7~21 d, 弱势粒蔗糖含量明显高于强势粒, 表明弱势粒淀粉积累量低, 并不以其淀粉合成底物的供给为限制因子, 而主要与淀粉合成能力低有关, 同时与籽粒灌浆前期胚乳细胞的数量关系密切。     

三个不同品质类型冬小麦品种籽粒淀粉积累动态及其有关酶的活性变化

在池栽条件下，研究了3个不同品质类型冬小麦品种藁麦8901（强筋）、豫麦49（中筋）和洛麦1号（弱筋）籽粒灌浆过程中淀粉及其组分积累动态和与之有关的酶活性变化。结果表明，3个品种籽粒灌浆过程中支链淀粉的合成均与直链淀粉的合成同时进行，灌浆中后期支链淀粉的合成比直链淀粉的合成快。豫麦49籽粒中直链、支链和总淀粉积累速率均高于其它两品种。3个品种籽粒中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPP）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPP）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、淀粉粒结合的淀粉合成酶（GBSS）、淀粉分支酶（SBE）活性变化均呈单峰曲线。豫麦49在灌浆期上述各酶活性变化的峰值均高于其他两品种，且大部分酶类在灌浆中后期仍维持较高活性。可见，与藁麦8901和洛麦1号相比，豫麦49具有较强的淀粉合成能力。     

水稻籽粒灌浆过程直链淀粉的积累及其相关酶的品种类型间差异

对籼、粳、糯3种类型水稻籽粒灌浆过程中直链淀粉含量的变化及其相关酶活性差异的比较分析表明,不论是早籼品种浙733,还是早粳品种浙农104,其直链淀粉含量在籽粒灌浆过程中的变化趋势基本相似,均表现为灌浆初期的直链淀粉含量较低,随着灌浆时间的推移,籽粒中直链淀粉含量明显升高,灌浆后期则略有降低,而对早糯品种早香糯而言,     

14-3-3蛋白结构与功能预测及其在木薯成熟期的表达分析

为了深入研究木薯14-3-3蛋白结构和功能,也为研究木薯块根淀粉积累的分子调控提供新思路。本研究采用生物信息学方法对木薯14-3-3蛋白家族的组成成分与理化性质、系统发育进化、导肽、亚细胞定位、二级结构、功能结构域、三级结构及亲水性、疏水性进行分析和预测,并对14-3-3基因在不同木薯品种中进行差异表达分析。结果表明：（1）木薯14-3-3蛋白家族16个异构体存在多个不同的保守结构域,二级结构相似的亲水性蛋白家族成员在进化关系上可划分为2大不同的类别;（2）14-3-3基因家族16个成员在花叶木薯、ZM-Seaside和华南9号(SC9)块根成熟期的表达水平存在显著性差异(P<0.05),与花叶木薯和SC9相比,产量较高的木薯品系ZM-Seaside块根中14-3-3基因表达水平显著下降(P<0.05),推测14-3-3蛋白在木薯块根成熟期的淀粉积累过程中可能起着负调控作用。     

水稻淀粉合成关键酶的研究进展

淀粉是稻米的主要成份,其组成和性质决定着稻米品质。在水稻淀粉合成过程中,淀粉合成关键酶发挥了重要的作用。综述了ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）及淀粉脱支酶（DBE）的功能及调控机理,并对目前研究存在的问题进行了探讨。     

Wheat starch biosynthesis

Starch biosynthesis in plants involves the concerted action of a numberof enzymes, including ADPglucose pyrophosphorylase, starch synthases,branching enzymes and debranching enzymes. We report on the cloningand characterisation of genes encoding these enzymes from wheat and ontheir chromosomal locations. The prospects for manipulating wheat starchstructure and functionality using these genes is discussed.     

六个不同产量玉米品种籽粒淀粉积累及相关酶活性的比较

以6个玉米品种为试材,比较研究了不同产量品种的籽粒淀粉积累和淀粉合成相关酶活性的差异。结果表明,蔗糖合酶(SS)、UDPG焦磷酸化酶(UGPase)和淀粉分支酶(SBE)是玉米淀粉合成的关键酶,较高的SS、UGPase和SBE活性利于淀粉的积累和粒重的提高。低产品种直链淀粉积累的时间(30 d)短于中产(40 d)和高产品种(50 d以上);低产品种支链淀粉的积累在籽粒充实前期(授粉后20 d)慢于中产和高产品种,但后期差异变小;低产品种籽粒SS活性在授粉后10~30 d高于中产和高产品种,但在授粉30 d后迅速下降且降幅大于高产品种;低产品种UGPase活性峰值出现在授粉后20 d,中产和高产品种则出现在授粉后40 d,且低产品种的UGPase活性在籽粒充实后期明显低于中产和高产品种;低产品种的SBE活性在籽粒充实后期(授粉后30~50 d)明显低于中产和高产品种,而中产品种又低于高产品种,低产、中产和高产品种的SBE活性降幅分别为72.44%、44.54%和30.21%。高产和中产品种籽粒可溶性淀粉合酶(SSS)活性呈“N”形曲线变化,并于授粉后30 d出现第一个峰值,而低产品种为单峰曲线;低产品种籽粒ADPG焦磷酸化酶(ADPGPPase)活性高于中产和高产品种;在籽粒充实全期,3个产量品种淀粉脱分支酶(DBE)活性均迅速下降,不同产量品种类型间差异不显著。     

施氮处理对水稻颖果淀粉积累和相关酶活性的影响

以扬稻6号和粳稻941为材料,通过盆栽试验,研究了不同施氮处理对水稻颖果淀粉积累和相关酶活性的影响。结果表明,增加穗肥施氮量显著降低颖果中的可溶性糖含量,淀粉含量有降低的趋势,但不明显。颖果中直链淀粉和支链淀粉含量随粒重的增加而上升,二者积累具有同步性;增加穗肥施氮量能显著降低颖果中直链淀粉含量,并使颖果中直链/总淀粉的比例降低,其效果要好于分蘖期施氮。分蘖期或孕穗期增施氮肥可以显著提高灌浆中、后期颖果中的ADPG焦磷酸化酶(AGP)、可溶性淀粉合酶(SSS)和淀粉分支酶(SBE)的活性,降低颖果中淀粉粒结合型淀粉合酶(GBSS)的活性。就施氮时期来看,孕穗期施氮(LH)对这些酶的促进或抑制效果好于分蘖期施氮(HL)。