锦鲤疱疹病毒ORF1基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus Virus,KHV)诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORF1基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后诱导表达。再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774 bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS-PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37.3 KD为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1:27000,表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

锦鲤疱疹病毒ORFl基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus Virus,KHV）诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORFl基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌E．coliBL21（DE3）后诱导表达,再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS．PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37．3KD,为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1：27000。表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72 kDa。Western blotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。     

绵羊FecB基因的原核表达及其抗体制备

为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。     

PVX介导的槟榔坏死环斑病毒CP蛋白在烟草中的表达和纯化

槟榔坏死环斑病毒(areca palm necrotic ringspot virus, ANRSV)是新发现的一种槟榔黄化病致病病毒。本研究利用马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)表达载体pgR107,在烟草中表达ANRSV的外壳蛋白(coat protein, CP),旨在分离纯化该蛋白并开展对病毒蛋白的功能研究和利用该蛋白制备多克隆抗体。为方便纯化,将8肽Strep蛋白标签序列融合到ANRSV-CP编码基因的3'端,利用In-Fusion无缝克隆策略将其克隆到PVX载体,构建重组表达质粒PVX-ANRSV-CP-Strep。采用电转化法将质粒PVX-ANRSV-CP-Strep转入根瘤农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导注射侵染接种本氏烟,14 d后对收集的16 g表达ANRSV-CP-Strep蛋白、PVX侵染的本生烟草样品进行了蛋白提取,采用SDS-PAGE和Western blot检测ANRSV-CP-Strep蛋白的表达情况。测序结果显示植物病毒表达载体PVX-ANRSV-CP-Strep构建成功。经Strep-Tactin~?XT High Capacity亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示ANRSV-CP-Strep重组蛋白可通过PVX载体在烟草中有效表达,其表达量为22μg/g (鲜叶质量)。本研究为后续利用该蛋白制备多克隆抗体并建立ELISA方法进行病毒检测提供了理论依据。     

猪瘟病毒E2基因的哺乳动物细胞表达

利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。     

南方水稻黑条矮缩病毒P6抗体的制备及应用

为了建立快速准确检测田间介体白背飞虱带毒率的方法,利用Gateway 重组技术将与病毒早期复制有关的P6 基因的N端993 bp 构建原核表达载体pDEST17-P6,并将诱导表达的目的蛋白免疫注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果表明：Western blot 检测制备的P6 抗体可特异性检测SRBSDV侵染水稻的P6 蛋白,免疫荧光标记技术可检测南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black streaked dwarfvirus,SRBSDV)侵染白背飞虱体内的P6 蛋白,且P6 抗体可直观高效准确地用于免疫荧光标记检测昆虫带毒率。以上研究表明,所制备的P6 抗体可用于SRBSDV的田间介体昆虫带毒率快速检测,有助于病毒病害的监测和预报。     

盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆、原核表达及纯化

前期研究表明,盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶DsSTPK在转录水平上的表达受盐胁迫诱导。为了进一步研究该蛋白激酶的生理功能,通过RT-PCR扩增DsSTPK的开放阅读框,并将其克隆至pET32a(+)载体,得到重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK。将重组表达载体转化E. coli. BL21 (DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用His60 Ni离子重力柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。本研究成功构建了重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK,经IPTG诱导后表达出的融合蛋白的分子量与预期相符;表达形式分析显示该融合蛋白在上清和包涵体中均存在;将上清蛋白纯化后获得了纯度较高的融合蛋白;Western-blot检测显示该融合蛋白能被抗组氨酸抗体特异性识别,具有良好的免疫学活性。DsSTPK的成功表达、纯化,为下一步制备抗体,然后进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。     

棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达

目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。     

小麦TaNADP-ME1基因在大肠杆菌中的融合表达及可溶蛋白纯化

NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。     

兔出血症病毒VP60基因的表达及其免疫原性研究

为研究兔出血症病毒VP60基因原核表达蛋白的免疫原性。采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后进行序列测定,将测序正确的纯化产物经双酶切,克隆入原核表达载体PET28b中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E. coli RosettaTM中,用IPTG诱导培养重组表达菌。结果表明：经SDS-PAGE分析,在相对分子量62.0 KD处可见明显的表达带,经Western blot鉴定,在62.0 KD处出现明显的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。说明RHDVVP60基因原核表达蛋白具有较好的免疫原性。     

番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。     

扁桃CBF2基因的克隆及原核表达

为进一步研究扁桃CBF2 目的蛋白功能,探明CBF2 转录因子在扁桃中的抗寒分子机制,以新疆栽培扁桃(Amygdalus communis L.)‘双软’叶片为材料,通过PCR 技术从基因组DNA 中克隆CBF2 基因,命名为AcCBF2,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-AcCBF2 并转化E. coli Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;生物信息学推测显示该基因的开放阅读框(ORF)为717 bp,编码238 个氨基酸,其分子量为26.59 kD,等电点为5.29。系统发育树分析结果显示,AcCBF2 基因与扁桃CBF1、光核桃和桃的亲缘关系最近。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,该蛋白分子量约47 kD,与预期蛋白大小基本一致。AcCBF2 基因在E. coli Rosetta 中的最佳诱导条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导4 h。     

水稻一个C3HC4型锌指蛋白编码基因的克隆表达与分析

锌指蛋白是生物体内数量最多的转录调控因子,它在动植物的生长发育中都起着十分重要的作用。通过RT-RCR从水稻cDNA文库中获得一个水稻锌指蛋白基因OsZNP的完整阅读框,序列分析表明该基因编码一条253个氨基酸残基的多肽,含有一个典型的C3HC4型锌指结构。将测序正确的OsZNP基因克隆到表达载体pGEX-KG中,转化宿主菌BL21(DE3),成功地构建了原核表达载体pGEX-KG-OsZNP。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析检测表明,水稻OsZNP基因以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达。     

杜仲EuGT2基因的原核表达及蛋白纯化

本研究以克隆所得杜仲(Eucommia ulmoides)EuGT2基因为基础,利用基因重组技术构建原核表达载体pMCSG19-EuGT2。重组载体转化到E.coli Rosetta(DE3)中,用0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6 h。使用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱进行纯化,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。研究结果表明,杜仲EuGT2基因在E.coli Rosetta(DE3)中得到成功表达,重组蛋白表达形式为部分包涵体、部分可溶性蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,在相对分子质量约56 kD处有1条特异性蛋白条带,经质谱鉴定该特异性蛋白条带确为杜仲EuGT2蛋白。以上研究结果为后续研究杜仲糖基转移酶的功能提供了科学依据。     

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

大肠杆菌内毒素多克隆抗体的制备与纯化

为制备大肠杆菌内毒素多克隆抗体,应用大肠杆菌内毒素作为抗原免疫5周龄家兔,辛酸-硫酸铵法和葡聚糖凝胶层析法分离提纯抗血清,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳方法鉴定多抗纯度,紫外分光光度计测定抗体蛋白含量,ELISA法检测抗血清效价与交叉反应;大肠杆菌内毒素抗体含量和效价分别为6.95mg/ml和1:12800;成功制备出抗大肠杆菌内毒素多克隆抗体,为大肠杆菌内毒素病诊断试剂盒的研制奠定基础。     

小麦籽粒胚乳基因sbe2b cDNA的克隆与原核表达条件的优化

本研究采用RT-PCR技术克隆了小麦胚乳基因sbe2b全长cDNA序列。序列分析表明,该序列与已报道的sbe2bcDNA序列(登录号:AY740401)同源性为98%。同时构建了原核生物表达载体pET28(a+)-sbe2b,对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,37℃8h能诱导sbe2b融合蛋白的最大量表达,在0.5mmol/LIPTG浓度下可以成功表达出sbe2b蛋白。为进一步体外研究sbe2b的物理化学性质及催化机理奠定基础。     

C型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因的原核表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达, Western Blot 检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原.