麦长管蚜重要基因的RNA干扰

选用12个蚜虫生长发育的关键基因,利用喂食的方法将其双链RNA(dsRNA)引入麦长管蚜体内,以死亡率为评价指标,对基因RNA干扰(RNAi)沉默效应进行分析。结果表明,水通道蛋白基因(Wsa)、ATP合酶基因(v Ad1-78)的RNA干涉能够显著提高蚜虫死亡率,而葡萄糖脱氢酶编码基因(Gl D-17)的RNA干涉则使蚜虫死亡率明显降低。基因表达荧光定量PCR分析结果显示,喂食dsRNA后5 d内,水通道蛋白基因(Wsa)和ATP合酶基因(v Ad1-78)表达水平分别下降了74.8%和44.6%;而葡萄糖脱氢酶编码基因(Gl D-17)表达水平则上调了209.0%,基因表达水平变化规律与蚜虫死亡率变化趋势一致。在所有供试基因中,水通道蛋白基因(Wsa)的RNA干涉沉默效应效果最突出,导致蚜虫死亡率提高到37.5%,基因表达量下调74.8%,可以作为利用RNAi技术培育抗蚜虫小麦新品种有效的靶基因。     

麦长管蚜对蚜害诱导小麦挥发物及蚜虫报警信息素的行为反应

【目的】探究小麦蚜害诱导挥发物与蚜虫报警信息素反-β-法尼烯(EβF)对麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius)行为反应的影响,为麦长管蚜的绿色防治提供依据。【方法】采用四臂嗅觉仪,测试不同质量浓度小麦蚜害诱导挥发物6-甲基-5-庚烯-2-酮(MHO)、6-甲基-5-庚烯-2-醇(MHOH)、水杨酸甲酯(MeSA)和蚜虫报警信息素(EβF)对有翅型麦长管蚜行为反应的影响;在此基础上,将上述化合物按各自对麦长管蚜具备最佳驱避效果的质量浓度等体积混合,分析或比较不同混合物对麦长管蚜行为反应的影响;最后,比较MHOH、EβF及二者混合物对有翅型麦长管蚜F1代翅型分化的影响。【结果】MHO、MHOH、MeSA与EβF分别在100,1,1,10ng/μL时对有翅型麦长管蚜具备最佳驱避效果;小麦蚜害诱导挥发物两两混合或三者混合后,对该蚜虫在处理臂与对照臂的停留时间无显著影响,丧失了对麦长管蚜的驱避作用;MHOH或MeSA与EβF混合后对麦长管蚜的驱避作用丧失,MHO与EβF的混合物对麦长管蚜仍然有强烈的驱避作用。翅型分化试验结果表明,EβF处理的麦长管蚜F1代有翅蚜率明显增加;MHOH与EβF混合后,不能引起有翅型麦长管蚜F1代有翅蚜率增加。【结论】小麦蚜害诱导挥发物的不同组分对麦长管蚜的行为反应影响存在差异,小麦蚜害诱导挥发物与蚜虫报警信息素之间可能存在相互作用。     

禾谷缢管蚜、麦长管蚜乙酰胆碱酯酶基因片段的克隆与序列分析

采用RT—PCR技术，设计简并上、下游引物，从禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi（Linnaeus））和麦长管蚜（Sitobion avenae （Fabricius））中均克隆出2种不同乙酰胆碱酯酶的cDNA片段，分别命名为Rp.acel、Rp.ace2和Sa.acel、Sa.ace2。同源性分析结果表明，Rp.acel、Sa.acel与棉蚜（Aphis gossypii）和桃蚜（Myzus persicae）的Ⅰ型乙酰胆碱酯酶（Acel）基因序列具有96％以上的相似性，Rp.ace2和Sa.ace2与棉蚜和桃蚜的Ⅱ型乙酰胆碱酯酶（Ace2）以及从麦二叉蚜（Schizaphis graminum）中克隆出的乙酰胆碱酯酶基因序列具有95％以上的相似性。说明禾谷缢管蚜和麦长管蚜体内都存在2种乙酰胆碱酯酶基因，而且预示蚜虫体内可能普遍存在2种不同的乙酰胆碱酯酶基因，这2种基因都具有相应的功能。     

紫外诱导下麦长管蚜细胞色素b基因和SOD基因的克隆与序列分析

【目的】证实前期消减文库的研究结果,揭示紫外诱导条件下麦长管蚜的生态遗传机理。【方法】根据前人研究证明的细胞色素b基因和SOD基因的保守性区域,设计特异性引物,采用RT-PCR方法,扩增紫外线照射24,48h和对照麦长管蚜变异基因的部分序列,进行测序及核苷酸分析,并推导氨基酸序列。【结果】RT-PCR扩增分别得到长度420bp的细胞色素b基因cDNA片段和357bp的超氧化物歧化酶(SOD)基因cDNA片段。序列分析表明,细胞色素b基因编码140个氨基酸残基,30W紫外辐射48h处理的麦长管蚜细胞色素b基因突变位点为3个,其编码的氨基酸序列变异位点为2个;SOD基因编码119个氨基酸残基,且对照与处理的序列一致,未发现变异位点。【结论】紫外诱导条件下,麦长管蚜细胞色素b基因发生突变部分的具体位点已经找到,其突变方式为转换和颠换;SOD基因未发现变异位点。     

拟黑多刺蚁hsp90基因的RNA干扰及其对EcR和USP基因mRNA表达的影响

【目的】对拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)成虫热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因进行RNA干扰(RNAi),为分析hsp90基因的功能及将RNAi技术用于害虫防治提供参考。【方法】采用Trizol法提取拟黑多刺蚁总RNA,反转录合成cDNA第一链用于hsp90基因的克隆。利用T7RiboMAXTM Express RNAi System将hsp90合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),将其配制成120,60,30,15和7.5ng/μL的溶液饲喂拟黑多刺蚁雌蚁、雄蚁和工蚁成虫进行RNAi,共饲喂14d,记录成虫死亡率,确定dsRNA最适质量浓度,并以此剂量对各品级成虫进行干扰,通过荧光实时定量PCR,检测干扰效果及干扰hsp90基因对EcR、USP mRNA表达的影响。【结果】成功获得拟黑多刺蚁hsp90基因片段,其长度523bp,并合成了dsRNA。饲喂dsRNA后发现,dsRNA质量浓度越大,拟黑多刺蚁死亡率越高,在dsRNA质量浓度为120ng/μL时,饲喂5d后成虫全部死亡;30ng/μL是dsRNA干扰的最适质量浓度。以30ng/μL dsRNA干扰后,荧光实时定量PCR结果表明,拟黑多刺蚁每个品级成虫hsp90基因mRNA均被沉默。hsp90基因被干扰后,EcR的表达没有显著变化,USP的表达显著降低。【结论】采用饲喂法成功干扰了拟黑多刺蚁hsp90基因mRNA的表达;hsp90基因与USP基因表达有一定的相关性。     

重金属锌长期胁迫对麦长管蚜生长发育和繁殖的影响

【目的】研究重金属Zn2+长期胁迫对麦长管蚜生长、发育和繁殖的影响,为重金属污染对生态系统的影响及监测和治理研究提供理论依据。【方法】以不同含量(0,200,400,800,1 600mg/kg)Zn2+处理小麦土壤,用特定时间-特定龄期两性生命表的方法,观察和分析土壤-小麦-蚜虫体系中Zn2+长期胁迫对麦长管蚜不同龄期蚜虫的发育历期、成虫寿命、若虫期存活率和繁殖力的影响。【结果】低含量(200和400mg/kg)Zn2+短期处理后,麦长管蚜若虫期存活率显著升高,随着代数的增加,各处理的麦长管蚜若虫期存活率逐渐下降;Zn2+长期胁迫对麦长管蚜1龄、3龄和4龄若蚜的发育历期有显著影响,对2龄若蚜无显著影响;长期胁迫条件下,低含量(200和400mg/kg)Zn2+处理后,麦长管蚜的成虫寿命延长,高含量(800和1 600mg/kg)Zn2+处理则显著缩短。高含量(1 600mg/kg)Zn2+短期胁迫(1代)下,麦长管蚜的繁殖力显著高于对照,随着世代的增加,繁殖力显著下降。【结论】长期胁迫后,Zn2+在麦长管蚜体内产生了积累特性和累积毒性效应,高含量Zn2+处理的毒害作用加强,低含量Zn2+处理则诱导产生了代谢补偿机制。     

不同小麦品种(系)对麦长管蚜生命参数的影响

【目的】比较小麦品种抗性对麦长管蚜连续2个世代若蚜和成蚜主要生命参数的影响。【方法】采用田间罩网试验,调查和测量Pm232等10个具有不同抗蚜性的小麦品种上定殖的有翅成蚜数量及若蚜发育历期、存活率、体重、翅型分化和成虫寿命、繁殖力等生命参数。【结果】麦长管蚜对10个供试小麦材料的不选择性有着明显差异,抗蚜材料对蚜虫的趋避作用明显较强。发育历期等5个生理参数的比较表明,抗蚜材料上的若蚜发育历期较感蚜材料明显延长,若蚜存活率、成虫寿命、繁殖力和体重较感蚜材料明显降低或减少,并且这种影响随着小麦抗性的升高而加重。研究还发现抗蚜材料上产生的有翅蚜要显著多于感蚜材料。通过对比不同世代的蚜虫生理参数发现抗蚜材料对蚜虫下世代的影响存在加重现象。【结论】小麦抗蚜品种对麦长管蚜不仅具有明显的趋避作用和抗生作用,而且其抗生性在蚜虫世代间可能存在累加效应。     

农药胁迫对2种体色型麦长管蚜生长发育和繁殖的影响

【目的】研究农药胁迫对不同体色型麦长管蚜生长发育和繁殖的影响,为蚜虫生态遗传与进化提供理论依据。【方法】在不同剂量氧化乐果、吡虫啉农药胁迫下,于人工气候箱中饲养2种不同体色型（红色型和绿色型）麦长管蚜(Sitobion avenae Fab.)初生若蚜,分别测定各处理麦长管蚜的发育历期、体质量差、相对日均体质量增长率、种群平均世代周期、净增殖率及内禀增长率等生长发育和繁殖生物学参数。【结果】随着氧化乐果和吡虫啉施用剂量的增加,2种体色型麦长管蚜的发育历期、种群平均世代周期均增加,且绿色型麦长管蚜增加幅度比红色型大;2种体色型麦长管蚜的相对日均体质量增长率、净增殖率、内禀增长率均减少,且绿色型麦长管蚜减小幅度比红色型大。【结论】农药胁迫对2种体色型麦长管蚜的生长发育具有显著的延缓作用,对其繁殖有显著的抑制作用,且绿色型麦长管蚜比红色型更敏感。     

农药胁迫对2种体色型麦长管蚜生长发育和繁殖的影响

【目的】研究农药胁迫对不同体色型麦长管蚜生长发育和繁殖的影响,为蚜虫生态遗传与进化提供理论依据。【方法】在不同剂量氧化乐果、吡虫啉农药胁迫下,于人工气候箱中饲养2种不同体色型(红色型和绿色型)麦长管蚜(Sitobion avenae Fab.)初生若蚜,分别测定各处理麦长管蚜的发育历期、体质量差、相对日均体质量增长率、种群平均世代周期、净增殖率及内禀增长率等生长发育和繁殖生物学参数。【结果】随着氧化乐果和吡虫啉施用剂量的增加,2种体色型麦长管蚜的发育历期、种群平均世代周期均增加,且绿色型麦长管蚜增加幅度比红色型大;2种体色型麦长管蚜的相对日均体质量增长率、净增殖率、内禀增长率均减少,且绿色型麦长管蚜减小幅度比红色型大。【结论】农药胁迫对2种体色型麦长管蚜的生长发育具有显著的延缓作用,对其繁殖有显著的抑制作用,且绿色型麦长管蚜比红色型更敏感。     

噻虫嗪种子包衣棉花对棉蚜和棉长管蚜解毒酶活性的影响

【目的】研究棉蚜和棉长管蚜取食噻虫嗪包衣棉花后解毒酶活性的变化,分析二者的抗药性机制。【方法】使用2、4 g/kg噻虫嗪包衣棉花,三叶期时采用生化方法测定取食0、2、6、12、24 h后棉蚜和棉长管蚜体内解毒酶的活性变化。【结果】取食噻虫嗪包衣棉花叶片后,低剂量处理组的棉蚜和棉长管蚜体内乙酰胆碱酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CarE)、细胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)的活性除棉长管蚜AChE外均先被诱导,而后被抑制,不同酶受影响程度不同。高剂量处理组棉蚜和棉长管蚜体内各解毒酶均被抑制;供试棉蚜AChE、CarE、CYP450、GSTs的相对活力分别为棉长管蚜的4.62、2.51、1.08、1.51倍。低剂量处理后棉蚜和棉长管蚜间AChE、CYP450、GSTs相对活力比短时内均升高,随时间延续又有所下降,而CarE则表现为降低→升高→降低的趋势。高剂量处理后CYP450与CarE的相对活力比均表现为升高→降低→升高的变化趋势。【结论】噻虫嗪低剂量种子包衣对蚜虫CarE和CYP450有短时的诱导作用,高剂量对各解毒酶均表现出抑制作用,CarE与CYP450可能是蚜虫对噻虫嗪解毒代谢的关键酶,棉蚜较棉长管蚜对药剂包衣棉花适宜能力更强。     

不同剂量胰岛素、胰高血糖素和甲状腺素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn mRNA表达的影响

 【目的】采用real-time PCR方法检测体外激素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn（neonatal Fc receptor,FcRn）mRNA表达的影响。【方法】在乳腺上皮细胞培养液中添加不同浓度胰高血糖素（0.01、0.1和1 μmol•L-1）、胰岛素（0.005、0.1和0.5 μmol•L-1）、甲状腺素T4（0.01、0.1和1 μmol•L-1）,体外培养并收集细胞,提取细胞mRNA后,利用real-time PCR检测FcRn mRNA的相对丰度。【结果】在一定添加剂量范围内,随着添加剂量的增加,甲状腺素和胰高血糖素能够显著地促进FcRn mRNA表达量升高（P＜0.05）,胰岛素在添加量为0.005 μmol•L-1和0.5 μmol•L-1时FcRn mRNA的表达量低,但在0.1 μmol•L-1添加时表达量显著升高（P＜0.05）。【结论】添加外源胰岛素、胰高血糖素和甲状腺素能够影响FcRn mRNA的表达,为进一步研究乳腺内FcRn受体变化以及影响因素提供了依据。     

巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌

【目的】建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. citrulli,Aac）,为西瓜细菌性果斑病（bacterial fruit blotch of watermelon,WFB）的防控提供技术支持。【方法】 根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5 µL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增,采用50 μL反应体系：5 μL 10×PCR buffer（25 mmol?L-1 MgCl2）,4 μL dNTP （D4030RA,2.5 mmol?L-1）,引物（5 μmol?L-1）各3 μL,0.4 μL Taq DNA酶（DR001B,5 U?μL-1）,通过退火温度优化,反应条件为：引物BX-L1/BX-R5各3 μL进行第一轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s;65℃,45s;72℃,1 min;35个循环;72℃,延伸7 min;取扩增后的产物1 μL为模板,以引物BX-L1/BX-S-R2各3 μL进行第二轮扩增,95℃,2 min;95℃,30 s,66℃,45 s,72℃,1 min,30个循环,72℃,7 min。在此条件下对梯度Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验,对不同带菌率的西瓜种子提取液进行检测。【结果】引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2在检测不同来源的Aac菌株时都产生了预期大小的片段,并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种（A. avenae subsp. cattleyae）、魔芋假单胞菌（A. avenae subsp. konjaci）及其不相关菌株未扩增出目标片段。以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,对Aac纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4.7×101 cfu/mL,比direct-PCR灵敏度高出1 000倍。当西瓜种子带菌率在0.1%-0.5%时,nested-PCR阳性检测率为66.7%;当种子带菌率为1%-10%时,nested-PCR的阳性检测率为83%-100%。【结论】以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR方法,能够快速、高效检测携带微量Aac的西瓜种子,检测结果重现性高。     

水稻P450基因Oscyp71Z2增强稻瘟病抗性的机制

【目的】分析水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在稻瘟病抗性中的作用,并解析其介导的水稻抗稻瘟病机制。【方法】根据高抗稻瘟病转hrf1水稻NJH12表达谱结果,筛选到一个表达量高达114.6倍的细胞色素P450基因Oscyp71Z2（NCBI登录号：Os07g0217600）。根据Oscyp71Z2全长编码区序列设计引物,以水稻模式粳稻品种日本晴的cDNA为模板,通过PCR扩增Oscyp71Z2全长编码区序列。将所得的cDNA序列经测序后,与双元表达载体pVec8连接,构建超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2。采用冻融法将构建的超量表达载体pVec8::Oscyp71Z2质粒转入农杆菌菌株EHA105,并利用农杆菌转化法获得Oscyp71Z2超表达水稻。常规PCR技术检测T4代Oscyp71Z2超量表达水稻中选择标记基因潮霉素磷酸转移酶编码基因（hygromycin phosphotransferase gene,hph）,并通过qRT-PCR检测超量表达水稻中目的基因Oscyp71Z2的表达量。进一步对阳性超量表达水稻（T4、T5和T6）进行稻瘟病表型鉴定,并检测植保素含量变化（T4）。【结果】RT-PCR和qRT-PCR结果显示,水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2在高抗稻瘟病的转hrf1水稻中有较高的表达,与表达谱数据一致。通过生物信息学分析Oscyp71Z2全长1 554 bp,含有2个细胞色素P450保守结构域,是CYP71Z2亚家族成员。将Oscyp71Z2成功连接到双元载体pVec8,利用农杆菌介导法获得Oscyp71Z2超量表达水稻。超量表达水稻株系在各生育期、株高等性状,与非转基因水稻日本晴基本一致。超量表达株系中Oscyp71Z2的表达量较野生型有显著升高。超量表达水稻的穗颈瘟抗性等级维持在1-2级,表现为抗病或者中抗,而野生型水稻的穗颈瘟等级为3-4级,表现为感病,Oscyp71Z2在水稻中超量表达显著增强了对穗颈瘟的抗性。Oscyp71Z2超量表达株系每克新鲜叶片中植保素MA和PB含量平均是328和124 ng,相对于野生型的85和42 ng•g-1新鲜叶片有显著升高。Oscyp71Z2超量表达株系中涉及到植保素MA和PB合成通路的4个关键基因的表达量较野生型有显著地升高。【结论】水稻细胞色素P450基因Oscyp71Z2通过调控植保素生物合成通路,赋予水稻稻瘟病抗性。     

外源褪黑素对牛卵母细胞体外成熟的影响

 【目的】探索外源褪黑素（melatonin,MT）处理对牛卵母细胞体外成熟的影响从而优化牛体外胚胎生产体系。【方法】在牛卵母细胞成熟过程中添加不同浓度的MT,观察并统计其体外受精后胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数。应用放射免疫分析法检测血清、卵泡液和成熟培养液内MT与孕酮（P）、雌激素（E2)、促卵泡素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平的变化并检测卵母细胞的活力和活性氧（ROS）的浓度。【结果】存在于牛卵泡液中的MT浓度与血清中的相近,添加10-11 mol•L-1 MT组的P浓度（2.01±0.33）ng•mL-1显著高于对照组（（0.87±0.10）ng•mL-1,P＜0.05）。与对照组（（67.32±7.30）%）相比,10-9 mol•L-1 MT组卵裂率显著提高（（77.81±7.06）%,P＜0.05）,并能提高囊胚率且囊胚细胞数（（29.61±9.55）%,（90.30±28.74）个）,显著高于对照组（（19.64±9.22）%,（75.07±25.98）个,P＜0.05）;同时,10-9 mol•L-1 MT组卵母细胞的活力高于对照组,并能降低卵母细胞内的ROS含量但没有显著差异（P＞0.05）。【结论】牛卵泡液中存在MT,适当浓度的外源MT能促进牛卵母细胞体外成熟。     

北京地区二斑叶螨不同种群的药剂敏感性

【目的】明确北京地区作物上二斑叶螨（Tetranychus urticae Koch）不同种群对杀螨剂的敏感性水平,了解二斑叶螨对药剂敏感性与体内4种解毒酶活力的相关性。【方法】在实验室内采用改进的玻片浸渍法（slide-dip method）检测北京房山、怀柔、昌平、延庆和平谷5个地区二斑叶螨田间种群对联苯肼酯、阿维菌素、螺螨酯和哒螨灵4种杀螨剂的敏感性;采用PCR技术对单头叶螨的CYTB基因进行扩增和测序,检测二斑叶螨对联苯肼酯的抗性突变位点;并采用酶标仪微量板法,检测二斑叶螨体内与抗性相关的多功能氧化酶、乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活力。【结果】5个田间种群对联苯肼酯最敏感,其LC50分别为2.4880、6.4693、6.2398、0.7882和14.7783 mg•L-1。对阿维菌素的敏感性次之,其LC50分别为22.4712、35.4431、14.5260、15.4904和14.0023 mg•L-1。对螺螨酯和哒螨灵的敏感性非常低,螺螨酯的LC50分别为49.6833、81.8826、72.9609、204.4609和1 433.5137 mg•L-1,哒螨灵的LC50分别为202.6902、806.8324、375.3518、188.3234和2 310.9040 mg•L-1。延庆地区二斑叶螨乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性显著高于其他地区,其活力分别为14.9508 U/(mg protein)、0.2271 μmol•mg-1 protein•30 min-1和58.2962 U/(mg protein)。怀柔地区多功能氧化酶的活性显著低于其他地区,其活力为1.4272 μmol•mg-1 protein•30 min-1。联苯肼酯、阿维菌素、螺螨酯和哒螨灵的敏感性水平与乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和多功能氧化酶的酶活力之间没有直接的线性关系;采用PCR技术对5个地区的288个二斑叶螨个体进行CYTB基因检测后,仅发现怀柔地区的一个个体CYTB基因第126位氨基酸密码子的第一位核苷酸由G突变为A导致氨基酸由G突变为S,其余地区均无突变,这与生物测定方法中各地区对联苯肼酯较敏感的结果基本一致。【结论】北京地区二斑叶螨不同种群对联苯肼酯敏感性最高,对阿维菌素的敏感性次之,对螺螨酯和哒螨灵敏感性非常低;二斑叶螨对4种杀螨剂的敏感性水平与乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和多功能氧化酶的酶活力之间没有直接的线性关系;通过检测到的基因突变个体,说明怀柔地区二斑叶螨种群中存在着对联苯肼酯产生高抗性风险的个体。PCR方法能够更加快速准确地检测种群抗性发展程度。基于以上结果,在农业防治二斑叶螨中应降低联苯肼酯使用频率,交替使用阿维菌素,避免使用螺螨酯,停止使用哒螨灵,以延缓和降低二斑叶螨产生抗性的风险。     

飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的特性及生物学功能

【目的】研究飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶（glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,GNA）的特性及生物学功能,为探讨飞蝗表皮几丁质的合成机制及研发新型绿色环保杀虫剂提供实验依据。【方法】采用生物信息学方法,在飞蝗EST数据库中搜索GNA的cDNA序列,并与其它物种GNA序列进行同源比较;设计飞蝗GNA特异性表达引物,分析5龄第2天不同组织样品间的表达差异及5龄第1 天至第7 天表皮中GNA表达量的变化;构建pET-28a（+）蛋白表达载体,在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）菌株中表达GNA重组蛋白,Ni柱亲和纯化重组蛋白并分析重组蛋白的酶学活性;通过RNA干扰研究GNA的生物学功能。【结果】飞蝗GNA与其它物种GNA的氨基酸序列一致性很高,结合底物GlcN6P的氨基酸残基完全一致,说明不同物种间GNA非常保守;飞蝗GNA组织特异性分析显示其在表皮、脂肪体及肌肉中表达量较高;飞蝗5龄表皮的发育变化表明,GNA在刚蜕皮后的表达量最高,之后逐步降低;飞蝗GNA重组蛋白在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）菌株中成功表达,经过Ni-NTA柱纯化得到单一目的条带,酶学特性研究表明飞蝗GNA重组蛋白的最适反应温度为37-50℃,最适pH为8.0-9.5;测定了飞蝗重组GNA的Km值,当D-GlcN6P的浓度为200 μmol•L-1时,Acetyl-CoA的Km=133.60 μmol•L-1;当Acetyl-CoA的浓度为200 μmol•L-1时,D-GlcN6P的Km=42.43 μmol•L-1;飞蝗GNA的RNA干扰结果显示,GNA的表达能够被有效沉默,但蜕皮及发育未受影响。【结论】飞蝗GNA与其它物种的GNA氨基酸序列一致性很高;用该序列原核表达的重组蛋白具有葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的活性;飞蝗GNA被干扰后未观察到对飞蝗蜕皮及发育产生影响,推测存在N-乙酰葡萄糖胺激酶（GlcNAc kinase）补救途径催化产生GNA的底物N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc6P）,用于几丁质的合成。     

环斑猛猎蝽对烟蚜若虫的捕食作用

【目的】明确环斑猛猎蝽（Sphedanolestes impressicollis Stal.）对烟田烟蚜［Myzus persicae（Sulzer）］若虫的捕食潜力,为田间应用环斑猛猎蝽防控烟蚜提供参考。【方法】实验室条件下,在培养皿中设置1头饥饿24 h的环斑猛猎蝽4龄若虫与不同密度梯度的1~4龄烟蚜若虫,统计环斑猛猎蝽的捕食量并通过GrapPad Prism 8.0、DPS等软件进行生物学统计分析,明确环斑猛猎蝽对烟蚜若虫的功能反应和搜寻效应;以不同密度的环斑猛猎蝽4龄若虫与烟蚜4龄若虫在不同温度梯度及空间格局条件下,通过控制单一变量法并构建线性回归方程,明确环斑猛猎蝽4龄若虫种内干扰对捕食率的影响以及自身密度、温度、空间格局对捕食量的影响,评估环斑猛猎蝽4龄若虫对烟蚜4龄若虫的捕食功能反应模型。【结果】环斑猛猎蝽4龄若虫对烟蚜若虫的捕食功能反应符合Holling-II模型,其种内干扰及自身密度对捕食量的影响分别符合Hassell模型和Watt模型。环斑猛猎蝽4龄若虫对1~4龄烟蚜若虫中的3龄和4龄若虫捕食具有偏好性,对4龄若虫的捕食量最大,最大日捕食量为55.7头,其次为3龄烟蚜（55.3头）。在空间一定和烟蚜若虫定量条件下,环斑猛猎蝽4龄若虫个体间存在种内干扰,干扰系数为1.31,并随着自身密度的增加干扰增强,平均捕食量下降。在不同空间且烟蚜若虫密度一定的条件下,随着空间的增大,环斑猛猎蝽4龄若虫对猎物的捕食量减少。在16~32℃的温度梯度下,环斑猛猎蝽4龄若虫对烟蚜若虫的捕食量随着温度的升高而逐渐增强,32℃下的日捕食量最大,达23头。【结论】环斑猛猎蝽在烟田中具有防治烟蚜的潜力。     

飞蝗3个细胞色素P450基因的分子特性及功能

【目的】研究飞蝗（Locusta migratoria）细胞色素P450（CYP450）第四家族（CYP4）中3个基因的功能。【方法】以飞蝗为材料,依据飞蝗EST数据库P450基因预测序列设计引物,利用 RT-PCR技术克隆飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列,命名为CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1（GenBank登录号： KF857162、KF857163和KF857164）。采用实时定量 PCR 技术分析CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗各发育阶段以及不同组织中mRNA的表达水平。应用RNA干扰技术沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1,实时定量 PCR 技术检测基因的沉默效率。应用农药点滴技术测定2龄若虫期飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的毒力,通过SPSS软件分析得出3种杀虫剂的LC30,同时应用该技术研究dsRNA干扰过的飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得了飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,其中CYP4C69开放阅读框1 518 bp,编码506个氨基酸;CYP4C73开放阅读框1 521 bp,编码 507个氨基酸;CYP4DH1开放阅读框1 512 bp,编码 504个氨基酸。对飞蝗不同龄期定量PCR结果分析,发现CYP4C69在若虫末期表达量高于成虫期,CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫初期和末期以及成虫期表达量较高;不同组织的定量PCR结果表明CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均在胃盲囊高表达,CYP4C69和CYP4DH1在脂肪体中高表达。通过RNA干扰,发现CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均可以被显著沉默。马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯对2龄若虫期飞蝗的毒力测定表明2龄若虫期飞蝗对3种杀虫剂的LC30剂量,分别为59.438、8.215、0.759 μg•mL-1。飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂敏感性试验结果表明,双链RNA沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1后,飞蝗点滴马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂后的死亡率与注射dsGFP的对照组相比,没有显著提高。【结论】获得飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,这些基因均可被双链RNA干扰而沉默,但CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1沉默后,飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性与对照组相比没有显著提高。     

灰飞虱体内水稻条纹病毒基因的RNA干扰效应

【目的】探讨利用RNA干扰技术切断灰飞虱体内水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）繁殖的可行性,研究RSV病毒不同基因间的互作关系。【方法】利用喂食的方法测定体外合成的dsRNA对灰飞虱体内RSV基因表达的抑制作用。根据RSV基因序列设计并合成3种dsRNA（dsRdRp、dsNSvc4和dsCP）,分别喂食携带RSV病毒的2龄灰飞虱,96 h后利用荧光定量PCR技术同时检测灰飞虱体内RSV病毒不同基因RdRp、NSvc4和CP的表达量。【结果】经过特异性dsRNA喂食处理的灰飞虱体内RSV病毒靶基因NSvc4、CP的表达量大幅下调,下调幅度分别为93.2%和94.9%;靶基因RdRp表达量下调幅度为45.6%。dsRNA喂食处理对其它非靶标RSV基因的表达均具有一定的下调作用,表明RSV病毒不同基因RdRp、NSvc4和CP间可能存在互作关系。【结论】本研究为利用转dsRNA工程微生物或转基因水稻进行RSV病毒的防治提供了重要依据。     

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE）人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法（UV Scan）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6-7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30 μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng•mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件：包被浓度：5 μg•mL-1;抗体工作浓度：1﹕6400;二抗稀释度：1﹕1000;底物显色时间：10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng•mL-1,标准曲线回归方程为y=－0.3627x + 1.3517（R2 = 0.9956）,与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%-87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%-10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%-88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%-10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5个标准浓度 B/B0的批内变异系数在3.39%-6.68% ,批间变异系数在4.69%-9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%-110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。